キシレム内の水分布を観察することは、木質植物の水流ダイナミクスに関する重要な情報を提供します。本研究では、サンプル調製時の水位のアーティフィスの変化を排除するクライオスタットとクライオSEMを用いて、キシレム水分布をその中で観察する実践的なアプローチを実証する。
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この記事について
サマリー
要約
クライオユニット(クライオSEM)を設置した走査型電子顕微鏡により、氷点下の温度での検体観察が可能となり、液体窒素(LN)を用いて凍結固定技術と組み合わせて植物組織の水分布を探索するために使用されています。2.木質種の場合、しかし、キシレム横断切断面を観察するための準備は、木繊維の配向のためにいくつかの困難を伴う。さらに、キシレム導管の水柱の張力が高いと、特にサンプルの固定および収集中に、水の分布にアーティフィカルな変化を引き起こす場合があります。本研究では、クライオスタットとクライオSEMを用いて、その場で木質植物のキシレム内の水分布を観察する効率的な手順を示す。まず、サンプル採取中に、キシレム水電位を測定し、キシレム導管に高張力が存在するかどうかを判定する必要があります。キシレム水電位が低い場合(< ca. -0.5 MPa)、サンプル凍結固定中にキシレム導管の水状態をより良く保存するために、緊張緩和手順が必要です。次に、木の茎の周りに防水首輪を取り付け、キシレムの水状態の凍結固定のためにLN2で満たされる。収穫後は、観察のためのサンプル調製の手順を完了しながら、サンプルが凍結保存されていることを確認するために注意する必要があります。クライオスタットは、キシレム横断切断面を明確に露出させるために使用される。クライオ-SEM観測では、凍結エッチングの時間調整は、霜の塵を除去し、表示面上の細胞壁のエッジを強調するために必要とされます。我々の結果は、細胞および細胞レベルでのキシレム内の水分布の観察のためのクライオSEM技術の適用性を示す。クライオ-SEMと非破壊的な観察技術の組み合わせは、木質植物の水流ダイナミクスの探査を大幅に改善します。
概要
水資源(沈殿、土壌水分含有量)の利用可能性は、土壌から水を吸収し、光合成生産のために葉に輸送する必要があるため、植物種の死亡率と地理的分布を厳密に決定します。植物は、変動する水供給の下で水輸送システムを維持する必要があります。特に、木質植物は、場合によっては、地上100m以上のクラウンを保持する必要があるため、蒸散流れに沿って導管に高い張力を発生させます。このような高い負圧下で水柱を維持するために、キシレム導管は、硬直および疎水性細胞壁1を有する管状細胞の連続体からなる。各種におけるキシレム導管のキシレム機能障害に対する脆弱性は、変動する水供給2の下での種生存の良好な決定要因である。また、キシレム導管の水位を調ることは、生物学的または生物学的ストレスを受けた個々の樹木の健康状態を評価するために重要である。樹液の流れまたは水の電位を測定することは、キシレム導管の統合された油圧機能による木質植物の水の状態の推定を提供できる。さらに、キシレム細胞における水の分布を可視化することで、キシレム油圧システムの個々の成分の状態を明らかにすることができる。
キシレム導管の水位を可視化するためのいくつかの技術が存在する3.木質組織の水経路を観察するための古典的で有用な方法は、切断された枝の端を染料に浸すことによって、または立っている木の茎4に染料を注入....
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プロトコル
注: このプロトコルの概略図を図 1に示します。
1. サンプリング:キシレム導管の水柱内の緊張緩和
注:Xylem水配分における凍結および張力誘発アーティファクトの両方を避けるために、LN2アプリケーションの前に次の張力緩和治療が推奨されます。
- 黒いビニール袋でサンプリング用の枝と葉を囲み、キシレムと葉の間の水位を平衡化してから2時間以上前に残します。
- 圧力室またはサイクロムスターを使用して、サンプルから少なくとも2つの葉の水電位を決定します。水位がca.0.5 MPaより高い場合(すなわち、凍結後にサンプルを収穫することができます(セクション2:凍結固定を参照)。水の電位が-0.5 MPaより低い場合は、以下に説明するようにリラクゼーションの治療が必要です。
- 水で満たされるために、茎の周りに水密襟を固定します。底のないプラスチックカップは、防水襟として機能することができます。その後使用される液体媒体の漏れを防ぐために粘着テープを使用して、茎と襟の間のスペースをしっかりと密封するように注意する必要があります。細い枝や小枝などの柔軟な茎を収穫する場合は、茎を曲げて水で満たされたバケツに切断部分を沈めます。剪定せん断またはのこぎりを使用して水面下で切断します。切り傷....
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結果
凍結-SEMによって観察された、縮小樹と広い木キシレムの横切り面の代表的な画像を図2に示す。低倍率では、画像内の黒い領域は水が完全または部分的に消失する空洞を示し、灰色の領域はキシレム細胞壁、細胞質、および水を示します(図2A)。高倍率では、水が3つの気管イドのルミナから完全に失われるわけではないことが明らかであり、その中のキシレム樹液におけるマクロ気泡の発生を示す(図2B)。広い放置種に関しては、血管内でキャビテーションの発生が容易に検出され、特に低倍率では繊維内で水の存在を区別することは困難である(図2C)。パレンキマ細胞における細胞質は、氷平野テクスチャを介してトラセイドまたは血管内の水と区別することができる(例えば、
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ディスカッション
本論文で紹介したクライオSEM観測法は、細胞規模での水分布を明確に可視化するために実用的である。この方法を通じて、キシレム内の水の分布の変化を調べた場合、生物ストレス(水不足または凍結)や生物学的ストレス(樹木病)に対する樹種耐性のメカニズムを明らかにするのに役立つ可能性がある。
この方法で最も重要なステップは、サンプル収集およびその後のサンプル調製時に、天然水位の水分布特性を維持することです。長い導管を持つ種のキシレム組織(特に環状多孔質の木の初期の木血管)は、収穫と凍結の間に容易に水を失うことができる。Cochard et al. (2000) は、キシレム導管38,41に沿った水柱の高張力による凍結アーティファクトについて議論している。梅林らは(2016)、非破壊MRI観測39と比較して、緊張緩和サンプルのクライオSEM観測の妥当性を確認した。いずれの観測技術も同様の分布パターンを示した。高い油圧張力下で凍結によ.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
この作品は、JSPSカケンヒ(いいえ) 20120009、20120010、19780129、25292110、23780190、23248022、15H02450、16H04936、16H04948、17H03825、1822)
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コーティング材 | JOEL株式会社 日本 | 金線 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, 品番 125000499 | |
| クライオ走査型電子顕微鏡 | JOEL社製 | JSM-6510 MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| クライオスタット | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| ミクロトームブレード | Thermo Scientific | HP35 ULTRA ディスポーザブルミクロトームブレード、3153735 | |
| 組織凍結包埋培地 | Thermo Scientific | Shandon クライオマトリックス包埋樹脂、 |
参考文献
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al.
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再版と許可
