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方法論記事

マイクロフォーカスX線CT(マイクロCT)アクチニアエクイナ(クニダリア)、ハーモトホーsp.(アネリダ)、およびゼノトゥルベラジャポニカ(キセナコエロモルファ)のイメージング

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DOI：

10.3791/59161

⸱

2019年8月6日

 ,  ,  , 
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

この記事について

サマリー

ここで、3匹の海洋無脊椎動物のマイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(microCT)イメージングを行うためのプロトコルについて詳しく説明する。本研究では、サンプル固定、染色、取り付け、スキャン、画像再構成、データ解析などの手順について説明します。異なるサンプルに対してプロトコルを調整する方法に関する提案も提供されます。

要約

伝統的に、生物学者は、不透明な生物の内部構造を調査するために、断面などの破壊的な方法に頼らなければなりませんでした。非破壊マイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(microCT)イメージングは、マイクロCTハードウェア、処理コンピュータ、およびデータのサンプル染色方法と技術革新の技術進歩により、生物学における強力で新しいプロトコルとなっています。分析ソフトウェア。しかし、このプロトコルは、医療や産業分野では一般的に使用されていません。この限定的な使用の理由の1つは、サンプル収集、固定、染色、取り付け、スキャン、およびデータ分析など、必要な手順のすべてをカバーするシンプルで分かりやすいマニュアルがないことです。もう一つの理由は、メタゾン、特に海洋無脊椎動物の広大な多様性です。海洋無脊椎動物の多様なサイズ、形態、生理学のために、サンプルに応じて、各ステップで実験条件とハードウェア構成を調整することが重要です。ここでは、マイクロCTイメージング法は、3つの系統的に多様な海洋無脊椎動物を用いて詳細に説明する:アクチニア・エクイナ(アントゾア、クニダリア)、ハーモトホー・sp.(ポリチャエタ、アネリダ)、およびゼノトルベラ・ジャポニカ(ゼヌトゥルベリダ、キセナコエロモルファ)。様々な動物に対してマイクロCTイメージングを行う上での提案も提供される。

概要

生物研究者は、一般的に、不透明な生物の内部構造を調べるために、薄い切片を作り、光または電子顕微鏡による観察を行わなければならなかった。しかし、これらの方法は、希少または貴重な標本に適用された場合、破壊的で問題があります。さらに、埋め込みや断面化など、この方法のいくつかの手順には時間がかかり、プロトコルによってはサンプルの観察に数日かかる場合があります。また、多数のセクションを処理する場合、常に一部のセクションを損傷または失う可能性があります。組織除去技術は、一部の標本1、2、3、4、5で利用可能であるが、多くの動物種にはまだ適用できない。

これらの問題を克服するために、一部の生物学者は、マイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(microCT)イメージング6、7、8、9、10、11、およびを使用し始めました。 12,13,14,15.X線CTでは、試料の周りを移動するX線源から発生する様々な角度からX線を照射し、送信されたX線は、試料の周りを移動する検出器によって監視されます。得られたX線伝送データを分析し、試料の断面画像を再構築する。この方法は、サンプルを破壊することなく内部構造の観察を可能にします。安全および容易さのために、それは医学および歯科の適用で一般的に使用され、CTシステムは世界中の病院および歯科センターで見つけることができる。また、産業用X線CTは、産業分野における検査や計測用の非医療サンプルの観察に多く使用されています。X線源と検出器が可動式の医療用CTとは対照的に、2つの部品は工業用CTで固定され、スキャン中にサンプルが回転します。産業用CTは一般に医療CTよりも高い解像度の画像を生成し、マイクロCT(マイクロメートルレベルの解像度)またはナノCT(ナノメートルレベルの解像度)と呼ばれています。近年、生物学14、15、16、17、18、19の様々な分野で、マイクロCTを用った研究が急速に増加している。20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27歳,28歳,29歳,30歳,31歳,32歳,33歳,34.

CTを用いた生物学的研究は、当初、主に骨などの硬い組織からなる内部構造を標的とした。様々な化学薬品を用いて染色技術を進歩させ、様々な生物6、7、8、9、14、15の軟部組織の可視化を可能にした,16歳,17歳,18歳,19歳,20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27歳,28歳,29歳,30歳,31歳,32歳,33歳,34.これらの試薬のうち、ヨウ素系造影剤は比較的安全で安価であり、様々な生物7,14における軟部組織の可視化に使用することができる。海洋無脊椎動物に関しては、軟体動物6、25、32、33、アネリッド18、19などの動物に広く使用されている。20歳,28, およびアルセロポッド21,23,29,31.しかし、ブリオゾン6、キセナコエロモルフ26、クニダリアン24、30などの他の動物フィラに関する報告はほとんどありませんでした。一般に、海洋無脊椎動物に対するmicroCTを用いる研究は脊椎動物に比べて少ない。海洋無脊椎動物に対するこの限定的な使用の主な理由の1つは、これらの動物で観察される広大な多様性です。その多様なサイズ、形態学、生理学のために、各種は異なる実験手順に異なる反応をします。したがって、サンプル調製時には、最も適切な固定および染色試薬を選択し、各工程で条件を設定し、種ごとに調整することが重要です。同様に、取り付け方法、電圧、電流、機械的拡大率、空間分解能などのスキャン構成をサンプルごとに適切に設定することも必要です。この問題を克服するためには、必要なすべてのステップをカバーするシンプルで分かりやすいマニュアルが、各工程を試料に応じて調整する方法を説明し、複数のサンプルからの詳細な例を示す必要があります。

本研究では、3種の海洋無脊椎動物を用いて、サンプル固定からデータ解析まで、microCTイメージングプロトコルを段階的に説明する。東京大学三崎海洋生物局の近くで、アネモネアネアクティニア馬(アントゾア、クニダリア)の標本を採取した。直径約2cmの球状で柔らかい体を持っていた(図1A-C)。三崎海洋生物学ステーション付近では、ハーモトホー(ポリチャエタ、アネリダ)のサンプルも採取した。長さ約1.5cmの細身の虫で、全身に強いシャエタが存在していました(図1D)。第13回JAMBIO沿岸生物共同調査の間、筑波大学下田海洋研究センターの近くで、ゼノトゥルベラ・ジャポニカ35(ゼノトゥルベリダ、ゼナコエロモルファ)の標本を採取した。長さ約0.8cmの柔らかい体の虫でした(図1E)。各サンプルの条件と構成に対して行われた調整について詳しく説明します。本研究は、海洋無脊椎動物に対してマイクロCTイメージングを行う方法に関するいくつかの提案を提供し、生物学者がこのプロトコルを研究に利用するよう促すことを期待しています。

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プロトコル

1. 固定

  1. アクティニアエクイナの場合は、室温で約15分間、10%MgCl2海水で動物をリラックスさせます。70%エタノールに移し、室温で保存します。
  2. Harmothoe sp.の場合は、約15分間氷冷海水に入れて麻酔をかけ、海水で10%(v/v)ホルマリン溶液に移し、室温で保存します。
  3. ゼノトゥルベラ・ジャポニカの場合は、淡水で7%MgCl2を使用して動物をリラックスさせます。濾過海水で一晩4%パラホルムアルデヒド(PFA)を固定します。70%エタノールに入れ、4°Cに保存します。
    注意:PFAは危険であり、注意して取り扱う必要があります。

2. 染色

  1. サンプルを50%エタノールに移し、15時間室温で保存し、50%エタノールを25%エタノールに置き換え、室温で2時間保存します。
    注:これは、海水を含む10%(v/v)ホルマリン溶液中のHarmothoe sp.サンプルには必要ありません。
  2. 溶液を蒸留水(DW)に置き換え、サンプルを室温で2時間DWに保存します。
  3. DWでストック溶液(以下)を25%に希釈して25%のLugol溶液を準備します。ストック溶液(100%ルゴル溶液)は、10gのKIと5gのI2を含み、DWで100mLに調整した。
    注:Lugol溶液は光に敏感なので、光から保護された溶液を保存して処理します。ヨウ素の取り扱いと廃棄物処理については、各国・機関の規制に従ってください。
  4. サンプルからDWをデカントし、25%ルゴル溶液を注ぎます。室温で24時間の汚れ。

3. ステージ取り付け

  1. 電子レンジ(800W、約1〜3分)で250mLの円錐フラスコにDWの100mLに500mgアガロースを溶解することにより、0.5%アガロースを調製します。室温に保ち、約30~40°Cまで冷やします。
    注意:アガロが沸騰するのを防ぐために、加熱時にフラスコを過熱または完全に密封しないでください。
  2. 50 mLチューブを使用してA.エクイナなどの大型サンプルを取り付けます。
    注:1,000 μLマイクロピペット「ブルー」チップに収まらない大型サンプルを取り付けるには、50 mLチューブを使用してください。
    1. 染色したサンプルをDWで60mmの皿に入れ、表面から過度の染色液を洗い流します。
    2. 50mLのチューブに0.5%のアガロースの5mLを穏やかに注ぎ、氷の上にアガロースを硬化させます。アガロースに泡を入れないように注意してください。
    3. 50 mLチューブに0.5%のアガロースの20mLを静かに加え、アガロースが硬化し始めるまで氷の上に置きます。鉗子を使用して0.5%アガロース内に標本を置きます。アガロースに泡を入れないように注意してください。
    4. 鉗子でサンプルの位置と向きを調整し、氷の上にアガロースを硬化させます。
    5. マイクロCT取り付け段階に粘土を置き、粘土に50mLチューブをセットします(図2A)。
  3. 1,000 μLマイクロピペット「ブルー」チップを使用して、ハーモトホーsp.やX.ジャポニカなどの小さなサンプルを取り付けます。
    注:より小さいサンプルのために、200 μLマイクロピペット「黄色」の先端を使用することができる。この場合、プラグに30μLのアガロースを使用し、アガロースまたは蒸留水の200 μLを追加します。
    1. 0.5%のアガロースの100 μLを1,000 μLマイクロピペット「ブルー」先端に引き上げ、先端にプラグを差し込んでアガロースを硬化させます(図2B-a)。
    2. 鉗子を使用せずに60mmの皿に染色されたサンプルをデカントする。
    3. リングピンセットを使用してサンプルをDWで別の60mm皿にゆっくりと移し、表面から過剰な染色液を洗い流します。
    4. マイクロピペットを使用して、プラグ先端(ステップ3.3.1)に0.5%のアガロースまたはDWのいずれかの1,000 μLを追加します。
      注:0.5%アガロースの使用をお勧めしますが、アガロースを避けるべき壊れやすいまたは貴重なサンプルのためにDWを使用してください。
    5. 60mm皿からリングピンセットを使用してプラグ先端のアガロースまたはDWにサンプルを静かに移します。
    6. ペチオレート針または精密ピンセットでサンプルの位置と向きを穏やかに調整します。取り付け媒体で気泡を作らないように注意してください。DWを取り付け媒体として使用する場合は、先端の壁の間でサンプルが安定していることを確認してください(図2D-b)。土印媒体として使用する場合は、アガロースを硬化させるために氷の上に先端を置きます。
    7. 新しい 1,000 μL マイクロピペット '青' 先端 (図 2B-b,c)を切り取り、プラグを差し込んだ先端を新しい先端に挿入します。
    8. マイクロCT取り付け段階に粘土を置き、粘土の内部にサンプルを入れた先端を設定します(図2C,D)。
      注:染色液は、DWに置かれたらサンプルを洗い流し始めるので、すぐに次のスキャンステップに進みます。

4. マイクロCTスキャン

  1. 80 kV、100 μA で X 線ビームをオンにします。
  2. 画面中央のX線伝送画像を観察しながら(図3 A)、X軸ボタンとZ軸ボタン(図3A)をクリックしてサンプル全体が見られるようにステージを動かす(図3A)。取り付けステージ上のY軸ノブを調整する(図3B)。コントラスト条件を調整して内部構造を観察できるように、画像のコントラストを設定します(図 3A:画像コントラスト)。
  3. 粘土のチューブ/先端の角度を変更してサンプルの向きを調整します(図2A)。回転軸(図3A)を90に設定し、相対移動ボタン(図3A)をクリックしてステージを90°回転させます。完全な回転を完了するために4回同じ操縦を行います。
    注: システムが自動的にオフにしない限り、サンプルドアが開くたびにX線ビームを手動でオフにします。
  4. Z軸ボタン (図 3A) をクリックし、取り付けステージの Y 軸ノブを手動で調整して、サンプルがビューの中央に配置できるようにステージを移動します (図 3B)。ステージを90°回転させ、同じことを行います。ステージ 360° を回し、サンプルがすべての方向からビューの中心にあることを確認します。
  5. X軸に沿ってステージをX線ビームソースに向かって動かすには、X軸ボタン(図3A)をクリックしてサンプルを拡大し、必要に応じてビューに収まるように調整します(図3C)。
  6. ステージ360°を回し、必要に応じて調整して、サンプルがすべての方向からビュー内に収まるようにします。
  7. 表 1に示すように、スキャン条件を調整します。
  8. スキャンを開始します。所要時間は約10分です。

5. 画像の再構築

  1. microCTシステムのアクセサリソフトウェア(「材料の表」を参照)を起動し、スキャンしたデータを開きます。
  2. 自動シフト値計算ボタンをクリックして、スキャン中のサンプルの回転軸の違いを調整します(図4A:緑色のボックス)。
  3. オレンジ色の矢印を回転させて画像の向きを調整します(図 4B)。向きが変更された場合は、手順 5.2 を繰り返します。
  4. エリアタブ(図4C:マゼンタボックス)をクリックし、サンプルが存在しない領域をトリムします(図4C:黄色のボックス)。
  5. 再構成タブ(図4D:マゼンタボックス)をクリックし、次のようにフィルタを設定してノイズを除去します。リングアーティファクト削減フィルタ:中央値フィルタ-3;ノイズ除去フィルタ:平均フィルタ-1。
  6. 再構成ボタンをクリックして再構成を実行します(図4D:緑色のボックス)。
  7. 白黒の値を黒と白の値 0、白の値 250 (図4D: 青いボックス) に設定して、画像の明るさとコントラストを調整します。
  8. 保存ボタンをクリックして、再構築された TIFF イメージ データセットを 8 ビット TIFF として保存します。TIFF ファイルの名前を次のように変更します: Date_sample_resolution (μm)_number.tiff.
    注: このスタディの元のマイクロCTデータセットは、Figshare リポジトリ、doi:10.6084/m9.figshare.767083736で利用できます。

6. データ分析

  1. データ分析ソフトウェアを起動し (資料の表を参照)、データベースアイコン (図 5A:magenta ボックス) をクリックして TIFF ファイルのインポートを有効にし、図5Bに示すボックスをオフにします。
  2. インポートアイコン (図 5C: マゼンタ ボックス) をクリックし、セクション 5 に保存されているデータセットを選択し、[開く]をクリックします。
  3. コピーリンクボタン(図5D)をクリックしてデータをインポートします。
  4. 2Dビューアアイコンをクリックして 2D 断面を表示します (図 5C: 青いボックス)。
  5. 3D ビューアタブ(図5E:マゼンタボックス)をクリックし、スキャン時に解像度値を入力してデータセットを調整します(この調査では0.018でした[図5F])。
  6. 明るさ/コントラストアイコンをクリックします(図5E緑色のボックス)。表示されている 2D イメージ内でカーソルを移動し、ウィンドウ レベルとウィンドウ幅を変更して、明るさとコントラストを調整します (図 5G)。
  7. スクロールバーを動かして他の断面画像を確認します(図5G:ボックス)。
  8. 向きアイコン (図 5E: 青いボックス) をクリックして断面の向きを変更し、すべての向き (図 5H)で画像を確認します。
  9. 表示された画像をクリックし、[エクスポート] タブを選択して断面画像を保存します。

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結果

25%ルゴル溶液でサンプルを染色した後、A.エクイナ(アントゾア、クニダリア)、ハーモトホーsp.(ポリチャエタ、アネリダ)、X.ジャポニカ(ゼノトゥルベリダ、ゼナコエロモルファ)にマイクロCTイメージングを行った。染色は、すべての検体の内部構造のコントラストを高め、内部軟部組織の観察を可能にしました(図6)。過去のレポートと一緒に 6,7,16,19,22,23,24,25,

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ディスカッション

本研究で用いられる海水中の10%(v/v)ホルマリン溶液などのホルマリンを用いる固定剤は、多様な海洋無脊椎動物の形態を保存することが知られており、マイクロCTイメージング18、24、25に多く使用されている。 ,26,28,30,33.しかし、近年、一部の国ではこの化学物質の使用制限が厳しくなっており、パラホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなどの代替品が使用される場合があります。スキャン後にDNAを抽出する計画がある場合は、DNAを断片化することが知られているので、ホルマリンを固定剤として使用することを避けた方が良いです。この場合、70%エタノールなどのDNAを保存する固定剤...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

白石敏彦氏のご支援と研究環境の提供に感謝申し上げます。A.エクイナに関するアドバイスをしてくれた柳健介と泉隆人、そしてハーモトホーの標本に関するアドバイスを田中正夏に感謝します。下田海洋研究センター、筑波大学、三崎海洋生物学ステーションのスタッフの皆様に、サンプルコレクションのご協力を賜りますようお申し上げます。英語編集の編集(www.editage.jp)に感謝します。この研究は、JSPS若手科学者支援(A)(JP26711022)と日本海洋生物学会JAMBIOの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
250ml 三角フラスココーニングCLS430183
5ml サンプリングチューブ ST-500BIO-BIK103010
50ml ポリプロピレンチューブグライナー バイオワン インターナショナル227261
60mm 未処理皿岩城1010-060
アガロースプロメガV3125
エコロジカルグレードチップ (ブルー)1000 &マイクロ;lBMBioBIO1000RF
エタノール和光純薬工業057-00451
ホルマリン和光純薬工業061-00416
ヨウ和光純薬工業094-05421
塩化マグネシウム六水和物和光純薬工業135-00165
OsiriX DICOMビューアPixmeo SARLOsiriX MD v10.0https://www.osirix-viewer.com
パラホルムアルデヒド和光純薬工業163-25983
葉柄針AS ONE2-013-01
Pipetman P200 マイクロピペットGILSONF123601
Pipetman P1000 マイクロピペットGILSONF123602
ヨウ化カリウム和光純薬工業166-03971
精密ピンセット 5DUMONT0302-5-PS
QuickRack MultI フィットチップ(黄) 200ulソレンソン10660
カミソリ刃フェザーFA-10
リングピンセットNAPOXA-26
実体顕微鏡ライカMZ95
X線マイクロCT画像装置コムスキャンテクノScanXmate-E090S105
素

参考文献

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