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動物を含むすべての作業は、制度政策と UPMC、INSERM、フランスと欧州共同体の理事会指令 86/609/EEC によって確立されたガイドラインを遵守しました。
1. 調製培と文化を挿入します (ハンズオン時間 ≈ 10-15 分)
注:無菌条件下で流文化フードでこの手順を実行します。
- 50% から成っている培養液 40 mL を準備 BME、25% ハンクの平衡塩溶液 (1 x)、熱不活化 25% 馬の血清、2 mM グルタミン誘導体、100 IU/mL ペニシリン-ストレプトマイシンと 4.5 mg/mL D-グルコースを添加しました。7.4 に pH を調整します。
- フィルター-50 mL プラスチック注射器に適応 0.22 μ m のフィルターを通しての滅菌培地。
注:培は、少なくとも 1 週間の 4 ° C で保存できます。
- 6 子犬の標準的なごみの 2 つの滅菌 6 ウェル プレートを使用します。各プレートのカバーを取り外し、ウェルあたり培養液 1 mL を加えます。
- それぞれの個々 のウェルに滅菌ピンセットでプラスチックの端を保持することによって 1 つの文化の挿入を配置します。プレートに戻ってカバーを置きます。
注:1 匹の子犬 (6-8) から収集した小脳スライスは、2 つの膜 (膜挿入 1 回あたり 3-4 小脳スライス) に派遣することができます。
2. 解離媒体の作製 (ハンズオン時間 ≒ 5 分)
注:無菌条件下で流文化フードでこの手順を実行します。
- 4.5 mg/mL D-グルコースと 1 x ペニシリン-ストレプトマイシン (100 IU/mL) を添加した Gey の平衡塩溶液から成っている解剖中の 100 mL を準備します。
- フィルター - 0.22 μ m のフィルター ユニットを培地を滅菌します。
注:郭清培地は、少なくとも 1 カ月の 4 ° C で保存できます。
- 60 mm 細胞培養皿に冷たい郭清培地 5 mL を追加します。1 つ 60 mm 細胞培養ディッシュ切り裂かれるそれぞれの子犬を準備します。
- 使用するまで氷の上郭清料理をしてください。
3. 解剖材料の調製 (≈ ハンズオン時間 15 分)
- 100% エタノールでベンチをクリーンアップします。
- 郭清のすべてのツール、かみそりの刃、組織チョッパーのプラスチック プラットフォーム 100% エタノールに殺菌します。
- 組織チョッパーにかみそりの刃とプラスチックのプラットフォームを修正し、300 μ m の切断厚を調整します。
- 解剖を開始する前にすべてのエタノールが蒸発したことを確認します。
4. CerebellumDissection とセクション準備 (ハンズオン時間 ≈ 1 頭につき 15-20 分)
- 双眼顕微鏡の下で冷たい解剖媒体を含んでいる 60 mm 細胞培養皿の 1 つ配置し、トップ プレートを削除します。
- (動物の目に触れることを避ける慎重に) 70% エタノールでヘッドの毛皮を綿棒し、承認された手順に従って大きな鋭いはさみを使用して動物の首をはねます。
注:小脳のスライスは、任意の特定のセックスやひずみバイアスなし P9 P10 マウスから生成されます。
- マウス銃口にあがると、首から頭の正中線に沿って皮膚をカットするのにためのハサミを使用します。
- 頭を保持して頭蓋骨を公開するには、頭の下に腹側の皮膚を折り返し、指の間の皮膚の 2 つのひだをしぼりひねり。
- 後頭に小さなはさみをゆっくり挿入を切り、頭蓋骨を 1 つ側に向かって切開を水平、すべて頭部の頭蓋骨の周りをカットすることによって。並列とは頭蓋骨に近い切断、脳組織の損傷を防ぐため、できるだけハサミの先端を維持します。
- 罰金ストレート鉗子による頭蓋骨の背の部分を取得します。頭蓋骨の背の部分を慎重に持ち上げ、ながらカット (半透明灌漑膜周囲の脳組織) の付着の髄膜脳組織の損傷を避けるために小さなはさみで必要な場合。
- 慎重に微細ストレート鉗子を紹介 (またはまたヘラを使用して) 腹側の頭蓋骨と脳の間優しく脳が狂うし、小さなハサミで光と三叉神経を切る。
- お皿のすぐ上、頭を逆さま回す冷たい解剖媒体を含んでいる 60 mm 細胞培養ディッシュに重力によってドロップする脳を助け、必要な場合、小さなハサミで最後の癒着をリリースします。
- 微細鉗子を使用して、皿の底に横たわって腹側と背側研究者は、脳をオリエンテーションします。
- 双眼顕微鏡の下で損傷を受けることができると前脳の側脳を固定し、菱脳は触れないでください罰金ストレート鉗子を使用します。脳 (前面 - と中脳、図 1Aaの回路図を参照してください) の残りの部分から別の菱脳微細ストレート鉗子を使用して。菱脳の残りの部分から小脳を区切るためには、小脳の下小脳脚をカットする微細鉗子を使用 (図を参照してください図 1Aa')。
- 小脳が分離すると、慎重を離れて引き裂く罰金ストレート鉗子を用いた髄膜 (回路図を参照してください図 1Aa').
- 小脳を優しく良いカーブタイプ鉗子で保持し、チョッパーのかみそりの刃を垂直にプラスチックのプラットフォーム上を背側に配置 (図 1 bbの模式図を参照)。
- 任意の過剰を吸引ピペット 1 mL で合わせられる生殖不能の薄い端のピペット チップを使用して小脳周囲郭清中の (図 1 bbの模式図を参照)。
- 小脳がフラット、産むことを伸ばし、一度断面 (図 1 bbの図参照) 中に最適な矢状のスライスを取得するプラットフォームに配置を確認します。
- 組織のチョッパーで小脳の 300 μ m 厚の矢状セクションをスライス (回路図を参照してください図 1 bb ')。力と刃の速度は、サイトに最適化しなければなりません。
- 軽くスライスした小脳に解剖中のドロップを追加します。1 mL ピペットにワイドボア ピペット チップを使用して、ゆっくりとスライスした小脳を吸引し、冷たい解剖媒体を含んでいる 60 mm 細胞培養皿に転送 (の回路図を参照してください図 1 bb ')。
- 各小脳スライス間 100% エタノール組織チョッパーのプラスチック製プラットフォームをクリーンアップします。プラットフォームに次の小脳を配置する前に蒸発させるエタノールができます。
- 2 罰金ストレート鉗子 (または) を使用またはチタン針個々 のスライスを分離し、虫部から 6-8 スライスを選択 (図 1 ccの回路図を参照してください、 1 cc ')。
- 文化を挿入して 6 ウェル プレートを取るし、1 mL ピペットで合わせられるワイド口径のピペット チップを使用して、いくつかの郭清媒体と一緒に 1 つの文化の挿入にまで 4 選択したスライスを転送 (の回路図を参照してください図 1 cc ')。
- プッシュすると右の場所にそれらを軽く引いて郭清培地または鉗子を使用して、互いに接触することを避ける文化挿入途中でスライスを配置 (図を参照してください図 1 cc ')。
- 薄い端のピペット チップを使用してスライスを解剖中の任意の過剰を削除します。膜にスライスが平らになったことを確認 (図を参照してください図 1 cc ')。
- 膜上のスライスを追加した直後にインキュベーターに 6 ウェル プレートを配置します。
5 文化と脱髄をスライス (ハンズオン時間 ≈ 15-20 分)
注:無菌条件下で流文化フードでこの手順を実行します。
- スライス標本後は 3 日おきに予め温めておいたとバッファーの新鮮な培養液の井戸あたり 1 mL に培養培地を置き換えます。
- 脱髄、削除すべて培養液下に 6 日間の in vitro (DIV) 後文化を挿入し、事前に暖められた新鮮な培養液 0.5 mg/mL LPC を含むウェルあたり 1 mL を置き換えます。37 ° C、5% CO215-17 時間孵化させなさい。
- インキュベーション後、予め温めておいた培養液 1 mL を含む 25 mm のペトリ皿にそれらを置くことによって挿入を洗います。
注:挿入は、媒体に接触するはずが、それによってカバーされません。
- すぐに新鮮な事前に暖められた培養液を含む新しい 6 ウェル プレートで文化挿入を転送します。
- スライス固定まで 2-3 日毎に予め温めておいた新鮮な培養液 1 mL に培養培地を置き換えます。
6 免疫組織化学 (ハンズオン時間 ≒ 1:30-2 h)
注:6.1 の手順を実行します。6.3 に.下ヒューム フード。パラホルムアルデヒド (PFA) 博覧会を回避し、適切な操作と保護のための製品安全データシートを参照してください。
- それぞれの文化を持ち上げる使用鉗子はプラスチックの端を保持することによって挿入し、膜挿入下に培養液を各ウェルから削除します。
- 4 %2 mL を追加して 30 分間小脳スライスを修正 PFA 膜挿入に PBS pH 7.4 × 1 で。
注:固定の時点は、髄鞘形成研究の段階に依存: 4 DIV は完全に有髄のスライスに 7 部の髄鞘の発症に対応します。LPC 治療の場合 9 DIV は、脱髄、検査の発症に 11 の DIV と完全に remyelinated スライスに 14 の DIV のピークに対応します。
- 3 回 10 分 2 mL の 1x PBS でスライスを挿入を洗います。
- 優しく押してメスまたはブラシを使用して 25 x 30 倍の倍率を使用して双眼顕微鏡下膜挿入からスライスを区切ります。また、膜からそれらを切り離すにスライスの損傷のリスクを避けるためには、まだ接続されているスライスを膜をカットするのにメスを使用します。
- 1x PBS、ブラシを使用してを含む 4 ウェル プレートのウェルにフローティングのスライスを転送します。
- 各ウェルから PBS を吸引し、-20 ° C、15 〜 20 分で予冷の 100% エタノールでスライスを孵化させなさい。この手順は、有髄線維の抗体の浸透を促進します。
- 100% エタノールを吸引し、簡単に室温で 10 分の 1 × PBS で 2 回し、PBS、× 1 で 1 回洗浄します。
- PBS の吸引し、1 × PBS、5 %ngs、室温で 0.3% 非イオン性洗剤非特異抗体固定サイトをブロックするを含む溶液で 30 〜 45 分のスライスを孵化させなさい。
- ブロッキング液を吸い出しなさい。洗濯は必要ありません。
- 4 ° C でソリューションをブロックで希釈した一次抗体とスライスを一晩インキュベートします。小脳切片スライスのミエリンを視覚化する MBP (鶏、1/150 またはマウス IGg2b, Smi99、1/200) または PLP (ラット、ハイブリドーマを培養、1/5、1/10) を使用して、抗体。
注:同じスライスに 1 つ以上の抗原の発現を明らかにするダブルまたはトリプル汚損プロシージャを実行 (例として図 1を参照)。孵化を同時に実行するには、一次抗体が異なる種で作り出されるを確認します。異なる蛍光物質と結合した彼らの対応する二次抗体を使用して、(材料の表を参照してください節、パラノード マーカー18抗体)。
- 2 日目、10 分の 1 × PBS で 3 回スライスを洗浄します。
- 3 時間室温で暗闇の中で (1/500 希釈) ソリューションをブロックで希釈した二次抗体の孵化させなさい。
注:抗体希釈とインキュベーション時間の最適化は、ここで記載されているものよりも他の抗体を使用する場合に要求されるかもしれない。
- 暗闇の中の 10 分の 1 × PBS の 3 回スライスを洗ってください。
- 双眼顕微鏡、スライド ガラスの上にスライスをマウントします。スライド上の 1 × PBS 100 μ L を置き、ブラシを使用して PBS にスライスを転送します。必要な場合、スライスを展開し、スライドにそれらを平らにします。PBS の任意の過剰を削除します。膜にまだ接続されているスライスを反応を実行すると、場合に、スライド ガラスの膜で、coverslip に直面してスライスをマウントします。
- ガラス基板上に直接実装中のドロップを置き、スライスを優しくカバーします。マウントされたスライドは、暗闇の中で 4 ° C で数ヶ月保存できます。