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方法論記事

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

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DOI：

10.3791/59163

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2019年3月20日

 ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM-GH Pitié-Salpétrière

この記事について

サマリー

マウス小脳・髄鞘形成と中枢神経系検査のメカニズムを調査するため適切な免疫組織化学的染色ミエリン鞘からスライス培養切片を準備する方法をご紹介します。

要約

ミエリンは神経系、グリア髄によって生成された複合膜構造細胞、どの ensheathes 軸索と高速電気伝導を容易に。ミエリンの変質は、機能的障害に関連付けられているが、様々 な神経疾患で発生する示されています。ここで、元の詳細な説明は提供 vivo マウス脊髄小脳スライス、いくつかの数週間、さらにラベルを貼ってミエリンを視覚化するために文化で維持できるから成る。

概要

ニューロンは、その環境と生成と他の細胞に電気的な刺激の伝達を保証する軸索からの入力を受け取る樹状の区画を占める高偏極のセルです。急速な伝播と情報のタイムリーな配信は、神経系の適切な機能のために不可欠です。脊椎動物、それは軸索伝導速度1を増加できるの髄鞘によって促進されます。髄鞘は、すなわち中枢神経系 (CNS) におけるオリゴデンドロ サイトおよび末梢神経系 (PNS) にシュワン細胞髄グリア細胞によって生成される膜の圧縮された層によって形成された特殊な構造です。中枢神経系と、PNS の両方で、axoglial 相互作用ドライブ軸索の専門領域の形成: Ranvier のノードとその周辺のドメイン、paranodes、および juxtaparanodes2。髄鞘、節間、電位依存性ナトリウム チャネル (Nav) の濃縮小さな無髄ドメインに対応している Ranvier のノードと代替絶縁軸索のセグメントです。高濃度と Ranvier のノードで Navチャネルの急速な活性化、活動電位と一緒にミエリン鞘の絶縁の特性の再生、効率的かつ高速跳躍伝導を確保、3軸索に沿って神経インパルス。

神経インパルスの伝導速度を加速する上で、その役割のほか髄グリア細胞は軸索、その長期的な整合性を確保してその生存4,5に参加する代謝サポートを提供します。さらに、明らかになったで近年そのミエリンが動的に従っておそらく規制とさまざまな神経システム機能の可塑性に参加して、生涯変調します。分布、数、長さ、および軸索に沿って髄鞘の太さの調整可能性がありますつまりさまざまなネットワーク6,7、8を微調整する斬新な方法を表します。したがって、ミエリンの進化的獲得は感覚、運動および認知機能の重要なプロセスと軸索とグリアの相互作用摂動をますます発達への貢献として考慮するか神経を取得疾患9。

脂質 (70%) の割合が高いの特定の機能を持つ、ミエリン組成を特徴づけられています。タンパク質 (30%) と比較してください。対照的に他の細胞内膜系の10。しかし、ミエリン脂質とは異なりミエリン蛋白のほとんど、髄鞘、ミエリン塩基性タンパク質 (MBP)、ミエリンプロテオリピドタンパク質 (PLP)、2'、3' 環状ヌクレオチド 3'-ホスホジエステラーゼ (CNP)、ミエリン関連糖蛋白 (MAG) などに特化ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ)、PMP 22、P010。髄鞘を染色するさまざまな組織学的方法はルクソールの高速青11などの脂質組成スーダン黒い B12ベイカーの酸ヘマチン法13と同様、14を汚す銀に基づいて存在しています。それにもかかわらず、これらのアプローチでは、十分なコントラストと個々 の繊維を視覚化する解像度の常に許可しています。ミエリンを検出するための代替アプローチ ミエリン蛋白に対する免疫組織化学化です。様々 な抗体を高い特異性ミエリン特異的抗原をターゲットし、有髄の構造を検出する日常的に使用することができます。抗体抗原の相互作用はすることができます一次抗体に対して指示、適切な蛍光顕微鏡による可視化の蛍光体に結合された二次抗体を使用してさらに明らかにしました。ここでは、神経組織アーキテクチャのよい保存可能モデル ex vivo 小脳スライスのミエリンを染色する免疫プロトコルについて述べる。また、組織とプルキンエ細胞 (小脳の唯一の有髄ニューロン) のサイズは電気生理学的研究のための古典的なモデルをそれら、彼らは同様に固定またはライブ イメージングの研究を行うことが理想的。

小脳のスライスは、プルキンエ細胞髄鞘形成、ex vivo (DIV in vitro で 6-7 日)15の 1 週間によって大抵達成されるプロセスの早期発生に対応する時間を P9 P10 マウスから生成されます。このモデルは脱髄性疾患多発性硬化症 (MS) などを調査するため適応 myelinotoxic 複合リゾホスファチジルコリンにより (または、リゾレシチン、LPC)、小脳スライスで大規模な脱髄を誘起すること、さらに、自発的な検査16,17が続いています。内因性検査培地から LPC 除去後 2 日から行われます、ほぼ完全に週後の治療です。

このプロトコルの完了小脳スライス文化準備、脱髄のピークに達する 2 日続いて完全に有髄のスライスを取得する週彼らの完全に別の週に半日を含む approximatively 3 週間はかかる検査。さらに、免疫組織化学は、2 日間で完了できます。ここで説明されているプロトコルは、標準 6 マウスの子犬のくずに適応され、計画の実験に使用される動物の数に関する適応する必要があります。

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プロトコル

動物を含むすべての作業は、制度政策と UPMC、INSERM、フランスと欧州共同体の理事会指令 86/609/EEC によって確立されたガイドラインを遵守しました。

1. 調製培と文化を挿入します (ハンズオン時間 ≈ 10-15 分)

注:無菌条件下で流文化フードでこの手順を実行します。

  1. 50% から成っている培養液 40 mL を準備 BME、25% ハンクの平衡塩溶液 (1 x)、熱不活化 25% 馬の血清、2 mM グルタミン誘導体、100 IU/mL ペニシリン-ストレプトマイシンと 4.5 mg/mL D-グルコースを添加しました。7.4 に pH を調整します。
  2. フィルター-50 mL プラスチック注射器に適応 0.22 μ m のフィルターを通しての滅菌培地。
    注:培は、少なくとも 1 週間の 4 ° C で保存できます。
  3. 6 子犬の標準的なごみの 2 つの滅菌 6 ウェル プレートを使用します。各プレートのカバーを取り外し、ウェルあたり培養液 1 mL を加えます。
  4. それぞれの個々 のウェルに滅菌ピンセットでプラスチックの端を保持することによって 1 つの文化の挿入を配置します。プレートに戻ってカバーを置きます。
    注:1 匹の子犬 (6-8) から収集した小脳スライスは、2 つの膜 (膜挿入 1 回あたり 3-4 小脳スライス) に派遣することができます。

2. 解離媒体の作製 (ハンズオン時間 ≒ 5 分)

注:無菌条件下で流文化フードでこの手順を実行します。

  1. 4.5 mg/mL D-グルコースと 1 x ペニシリン-ストレプトマイシン (100 IU/mL) を添加した Gey の平衡塩溶液から成っている解剖中の 100 mL を準備します。
  2. フィルター - 0.22 μ m のフィルター ユニットを培地を滅菌します。
    注:郭清培地は、少なくとも 1 カ月の 4 ° C で保存できます。
  3. 60 mm 細胞培養皿に冷たい郭清培地 5 mL を追加します。1 つ 60 mm 細胞培養ディッシュ切り裂かれるそれぞれの子犬を準備します。
  4. 使用するまで氷の上郭清料理をしてください。

3. 解剖材料の調製 (≈ ハンズオン時間 15 分)

  1. 100% エタノールでベンチをクリーンアップします。
  2. 郭清のすべてのツール、かみそりの刃、組織チョッパーのプラスチック プラットフォーム 100% エタノールに殺菌します。
  3. 組織チョッパーにかみそりの刃とプラスチックのプラットフォームを修正し、300 μ m の切断厚を調整します。
  4. 解剖を開始する前にすべてのエタノールが蒸発したことを確認します。

4. CerebellumDissection とセクション準備 (ハンズオン時間 ≈ 1 頭につき 15-20 分)

  1. 双眼顕微鏡の下で冷たい解剖媒体を含んでいる 60 mm 細胞培養皿の 1 つ配置し、トップ プレートを削除します。
  2. (動物の目に触れることを避ける慎重に) 70% エタノールでヘッドの毛皮を綿棒し、承認された手順に従って大きな鋭いはさみを使用して動物の首をはねます。
    注:小脳のスライスは、任意の特定のセックスやひずみバイアスなし P9 P10 マウスから生成されます。
  3. マウス銃口にあがると、首から頭の正中線に沿って皮膚をカットするのにためのハサミを使用します。
  4. 頭を保持して頭蓋骨を公開するには、頭の下に腹側の皮膚を折り返し、指の間の皮膚の 2 つのひだをしぼりひねり。
  5. 後頭に小さなはさみをゆっくり挿入を切り、頭蓋骨を 1 つ側に向かって切開を水平、すべて頭部の頭蓋骨の周りをカットすることによって。並列とは頭蓋骨に近い切断、脳組織の損傷を防ぐため、できるだけハサミの先端を維持します。
  6. 罰金ストレート鉗子による頭蓋骨の背の部分を取得します。頭蓋骨の背の部分を慎重に持ち上げ、ながらカット (半透明灌漑膜周囲の脳組織) の付着の髄膜脳組織の損傷を避けるために小さなはさみで必要な場合。
  7. 慎重に微細ストレート鉗子を紹介 (またはまたヘラを使用して) 腹側の頭蓋骨と脳の間優しく脳が狂うし、小さなハサミで光と三叉神経を切る。
  8. お皿のすぐ上、頭を逆さま回す冷たい解剖媒体を含んでいる 60 mm 細胞培養ディッシュに重力によってドロップする脳を助け、必要な場合、小さなハサミで最後の癒着をリリースします。
  9. 微細鉗子を使用して、皿の底に横たわって腹側と背側研究者は、脳をオリエンテーションします。
  10. 双眼顕微鏡の下で損傷を受けることができると前脳の側脳を固定し、菱脳は触れないでください罰金ストレート鉗子を使用します。脳 (前面 - と中脳、図 1Aaの回路図を参照してください) の残りの部分から別の菱脳微細ストレート鉗子を使用して。菱脳の残りの部分から小脳を区切るためには、小脳の下小脳脚をカットする微細鉗子を使用 (図を参照してください図 1Aa')。
  11. 小脳が分離すると、慎重を離れて引き裂く罰金ストレート鉗子を用いた髄膜 (回路図を参照してください図 1Aa').
  12. 小脳を優しく良いカーブタイプ鉗子で保持し、チョッパーのかみそりの刃を垂直にプラスチックのプラットフォーム上を背側に配置 (図 1 bbの模式図を参照)。
  13. 任意の過剰を吸引ピペット 1 mL で合わせられる生殖不能の薄い端のピペット チップを使用して小脳周囲郭清中の (図 1 bbの模式図を参照)。
  14. 小脳がフラット、産むことを伸ばし、一度断面 (図 1 bbの図参照) 中に最適な矢状のスライスを取得するプラットフォームに配置を確認します。
  15. 組織のチョッパーで小脳の 300 μ m 厚の矢状セクションをスライス (回路図を参照してください図 1 bb ')。力と刃の速度は、サイトに最適化しなければなりません。
  16. 軽くスライスした小脳に解剖中のドロップを追加します。1 mL ピペットにワイドボア ピペット チップを使用して、ゆっくりとスライスした小脳を吸引し、冷たい解剖媒体を含んでいる 60 mm 細胞培養皿に転送 (の回路図を参照してください図 1 bb ')。
  17. 各小脳スライス間 100% エタノール組織チョッパーのプラスチック製プラットフォームをクリーンアップします。プラットフォームに次の小脳を配置する前に蒸発させるエタノールができます。
  18. 2 罰金ストレート鉗子 (または) を使用またはチタン針個々 のスライスを分離し、虫部から 6-8 スライスを選択 (図 1 ccの回路図を参照してください、 1 cc ')。
  19. 文化を挿入して 6 ウェル プレートを取るし、1 mL ピペットで合わせられるワイド口径のピペット チップを使用して、いくつかの郭清媒体と一緒に 1 つの文化の挿入にまで 4 選択したスライスを転送 (の回路図を参照してください図 1 cc ')。
  20. プッシュすると右の場所にそれらを軽く引いて郭清培地または鉗子を使用して、互いに接触することを避ける文化挿入途中でスライスを配置 (図を参照してください図 1 cc ')。
  21. 薄い端のピペット チップを使用してスライスを解剖中の任意の過剰を削除します。膜にスライスが平らになったことを確認 (図を参照してください図 1 cc ')。
  22. 膜上のスライスを追加した直後にインキュベーターに 6 ウェル プレートを配置します。

5 文化と脱髄をスライス (ハンズオン時間 ≈ 15-20 分)

注:無菌条件下で流文化フードでこの手順を実行します。

  1. スライス標本後は 3 日おきに予め温めておいたとバッファーの新鮮な培養液の井戸あたり 1 mL に培養培地を置き換えます。
  2. 脱髄、削除すべて培養液下に 6 日間の in vitro (DIV) 後文化を挿入し、事前に暖められた新鮮な培養液 0.5 mg/mL LPC を含むウェルあたり 1 mL を置き換えます。37 ° C、5% CO215-17 時間孵化させなさい。
  3. インキュベーション後、予め温めておいた培養液 1 mL を含む 25 mm のペトリ皿にそれらを置くことによって挿入を洗います。
    注:挿入は、媒体に接触するはずが、それによってカバーされません。
  4. すぐに新鮮な事前に暖められた培養液を含む新しい 6 ウェル プレートで文化挿入を転送します。
  5. スライス固定まで 2-3 日毎に予め温めておいた新鮮な培養液 1 mL に培養培地を置き換えます。

6 免疫組織化学 (ハンズオン時間 ≒ 1:30-2 h)

注:6.1 の手順を実行します。6.3 に.下ヒューム フード。パラホルムアルデヒド (PFA) 博覧会を回避し、適切な操作と保護のための製品安全データシートを参照してください。

  1. それぞれの文化を持ち上げる使用鉗子はプラスチックの端を保持することによって挿入し、膜挿入下に培養液を各ウェルから削除します。
  2. 4 %2 mL を追加して 30 分間小脳スライスを修正 PFA 膜挿入に PBS pH 7.4 × 1 で。
    注:固定の時点は、髄鞘形成研究の段階に依存: 4 DIV は完全に有髄のスライスに 7 部の髄鞘の発症に対応します。LPC 治療の場合 9 DIV は、脱髄、検査の発症に 11 の DIV と完全に remyelinated スライスに 14 の DIV のピークに対応します。
  3. 3 回 10 分 2 mL の 1x PBS でスライスを挿入を洗います。
  4. 優しく押してメスまたはブラシを使用して 25 x 30 倍の倍率を使用して双眼顕微鏡下膜挿入からスライスを区切ります。また、膜からそれらを切り離すにスライスの損傷のリスクを避けるためには、まだ接続されているスライスを膜をカットするのにメスを使用します。
  5. 1x PBS、ブラシを使用してを含む 4 ウェル プレートのウェルにフローティングのスライスを転送します。
  6. 各ウェルから PBS を吸引し、-20 ° C、15 〜 20 分で予冷の 100% エタノールでスライスを孵化させなさい。この手順は、有髄線維の抗体の浸透を促進します。
  7. 100% エタノールを吸引し、簡単に室温で 10 分の 1 × PBS で 2 回し、PBS、× 1 で 1 回洗浄します。
  8. PBS の吸引し、1 × PBS、5 %ngs、室温で 0.3% 非イオン性洗剤非特異抗体固定サイトをブロックするを含む溶液で 30 〜 45 分のスライスを孵化させなさい。
  9. ブロッキング液を吸い出しなさい。洗濯は必要ありません。
  10. 4 ° C でソリューションをブロックで希釈した一次抗体とスライスを一晩インキュベートします。小脳切片スライスのミエリンを視覚化する MBP (鶏、1/150 またはマウス IGg2b, Smi99、1/200) または PLP (ラット、ハイブリドーマを培養、1/5、1/10) を使用して、抗体。
    注:同じスライスに 1 つ以上の抗原の発現を明らかにするダブルまたはトリプル汚損プロシージャを実行 (例として図 1を参照)。孵化を同時に実行するには、一次抗体が異なる種で作り出されるを確認します。異なる蛍光物質と結合した彼らの対応する二次抗体を使用して、(材料の表を参照してください節、パラノード マーカー18抗体)。
  11. 2 日目、10 分の 1 × PBS で 3 回スライスを洗浄します。
  12. 3 時間室温で暗闇の中で (1/500 希釈) ソリューションをブロックで希釈した二次抗体の孵化させなさい。
    注:抗体希釈とインキュベーション時間の最適化は、ここで記載されているものよりも他の抗体を使用する場合に要求されるかもしれない。
  13. 暗闇の中の 10 分の 1 × PBS の 3 回スライスを洗ってください。
  14. 双眼顕微鏡、スライド ガラスの上にスライスをマウントします。スライド上の 1 × PBS 100 μ L を置き、ブラシを使用して PBS にスライスを転送します。必要な場合、スライスを展開し、スライドにそれらを平らにします。PBS の任意の過剰を削除します。膜にまだ接続されているスライスを反応を実行すると、場合に、スライド ガラスの膜で、coverslip に直面してスライスをマウントします。
  15. ガラス基板上に直接実装中のドロップを置き、スライスを優しくカバーします。マウントされたスライドは、暗闇の中で 4 ° C で数ヶ月保存できます。

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結果

脊髄小脳スライス プルキンエ細胞染色とともに PLP GFP トランスジェニック マウス (図 2 b) だけでなく、野生型 P9 P10 C57black6 (WT) (図 2 a) から得られる代表的な髄鞘 immunostainings の例です。小脳スライス白質から脳内を活性化、フォリアの外周に向かってスライスの領域を追跡、プルキンエ細胞の髄鞘形成が 6 に 7 後実現主事業部7 DIV で完全脱髄の誘導は LPC 治療 (図 2Ci-ii) を介して可能です。次の脱髄、スライス自発的に remyelinate が完全に remyelinated (図 2Ciii) 脱髄のピーク後 6-7 日とします。

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ディスカッション

ここでは、我々 の元を生成するプロトコル詳細公開メソッド15,16,19後続のミエリン以前からマウス小脳脊髄スライス培養に対応する生体モデルの適応これらの製剤の免疫染色。この戦略では、健康と病的状態の高分解能髄鞘成分を可視化する可能性を提供しています。

小脳脊髄スライス培養 10 日齢のマウスからの撮影がほとんどの解剖を再現することができます、髄鞘化と検査プロセスの基礎となる分子 · 細胞メカニズムを調査するための確立された実験モデルと明確に定義された細胞アーキテクチャも成熟タイムライン17の保存だけでなく体内の対応する組織の機能。さらに、小脳スライス 2 週間培養後保存建築組織がある(図 1).トランスジェニック PLP GFP ひずみは脱髄検査研究

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開示事項

作者が競合する利益または矛盾した興味あります。

謝辞

原稿上の貴重なコメント、ショーン ・ フリーマン博士、博士ナタリー ゾル-Foulon と博士トーマス ・ ルーに感謝します。INSERM、ICM、ARSEP 補助金 R13123DD、(西暦) に ANR R17127DD FRM の交わり (西暦) に SPF20110421435 によって資金が供給されたこの仕事 (ティルソン) に FDT20170437332。セリスの細胞培養と icm に感謝しますクワント イメージング プラットフォーム。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BME媒体ThermoFisher Scientific41010026
Hank'S Balanced Salt Solution (10x HBSS)ThermoFisher Scientific14180046
GlutaMAX (100x)ThermoFisher Scientific35050038
Heat-inactivated Horse SerumThermoFisher Scientific26050088
Penicillin–ストレプトマイシン (10.000 IU/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Gey's 平衡塩溶液Sigma AldrichG9779-500ML
D-Glucose Solution (45%)Sigma AldrichG8769-100ML
リゾホスファチジルコリン (LPC)Sigma AldrichL4129-100MG
パラホルムアルデヒド (PFA)Electron Microscopy Sciences15714
無臭エタノール (100% エタノール)VWR Chemicals20821.330-20°Cで冷却。C
トリトン®X-100Sigma AldrichX100-500ML
10% Normal Goat Serum (NGS)ThermoFisher Scientific500622
Phosphate Buffer SolutionEuroMEDEXET330-ApH 7.4
Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)Merck Millipore06-896Dilution 1/300
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) 抗体 (Polyclonal, Chicken)Merck MilliporeAB9348Dilution 1/150
Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)Merck MilliporeNE1019Dilution 1/200
Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)Dr. K. Ikenakaからの贈り物;Okasaki, Japan希釈液 1/5 から 1/10
抗ナトリウムチャネル, Pan 抗体 (monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)Sigma AldrichS8809希釈液 1/150
抗 Caspr 抗体 (Polyclonal, Rabbit)Abcamab34151希釈液 1/500
ヤギ二次抗体 Conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405ThermoFisher ScientificDilution 1/500
フルオロマウントSouthernBiotech0100-20
ティッシュチョッパーMcIlwain
カミソリ刃
大型ハサミF.S.T14101-14
小型ハサミF.S.T91500-09
細直鉗子F.S.T91150-20
湾曲細鉗子F.S.T11297-00
細胞培養ディッシュ (60 mm および 100 mm)TPP
4-, 6-well 培養プレートTPP
ミリセル培養インサート (0,4 & micro;m、直径30 mm)Merck MilliporePICM0RG50
細胞培養インキュベーター37°C;C、5% CO2
ファインエンドピペットチップダッチャー134000CL
ワイドボアピペットチップサーモフィッシャーサイエンティフィック2079G
滅菌シリンジテルモヨーロッパ20または50mL
滅菌シリンジフィルターテルモヨーロッパ0.22 &マイクロ;m
ScalpelSwann-Morton0510
Brush
Microscope slidesRS France76 mm x 26 mm x 1.1 mm
Glass coverslipsRS France22 mm x 22 mm Kimtech
Sciences Tissue WipersKimberly-Clark Professional5511
双眼顕微鏡

参考文献

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