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方法論記事

インビボおよびインビトロ実験用グシュカン(GSK)顆粒の調製

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DOI:

10.3791/59171

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2019年5月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

この記事について

サマリー

この記事では、動物実験用のグシュカン顆粒およびインビトロ実験用血清を含むGSK顆粒の作業溶液を調製するための詳細なプロトコルを提供する。このプロトコルは、生体内およびインビトロ実験の両方の処方箋と同様に、漢方薬の薬理学的調査に適用することができます。

要約

伝統的な漢方薬は、閉経後骨粗鬆症(POP)などの多くの疾患を治療する代替方法としての役割を果たしています。中国で販売されている処方箋であるグシュカン(GSK)顆粒は、POPの治療に骨保護効果があります。体内に投与する前に、1つの標準的な調製手順が一般的に必要とされ、生ハーブからの活性成分の放出を促進し、薬理学的効果と治療結果を高めることを目的とする。本研究では、生体内およびインビトロ実験アッセイにおいてGSK顆粒を用いるための詳細なプロトコルを提案する。著者らはまず、生体内調査のための顆粒の動物に適した投与量を計算するための詳細なプロトコルを提供する:計量、溶解、貯蔵、および投与。次に、マイクロ CT スキャンのプロトコルと骨パラメータの測定について説明します。試料調製、マイクロCTマシンを実行するためのプロトコル、および骨パラメータの定量化を評価した。第3に、血清含有GSK顆粒が調製され、かつ、インビトロ破骨形成および骨芽形成のために薬物含有血清が抽出される。GSK顆粒を1日2回ラットに3日間連続して投与した。その後、血液を採取し、遠心分離し、不活性化し、濾過した。最後に、血清を希釈し、破骨形成および骨芽細胞形成を行うための使用を行った。ここで説明するプロトコルは、顆粒などの漢方薬の薬理学的調査のための参照と考えることができる。

概要

伝統的な中国医学(TCM)は、骨粗鬆症1、2を治療するための重要な補完的かつ代替的なアプローチの一つである。水の煎じりは、式3の基本的で最も一般的に使用される形態です。しかし、欠点も存在します:悪い味、キャリッジのための不便さ、短い貯蔵寿命と一貫性のないプロトコル、使用だけでなく、治癒効果を制限します。上記の欠点を避け、より良い効果を追求するために、顆粒が開発され、広く使用されている4.多くの研究は、顆粒5、6、7から1つ以上の有効な成分の薬理学的メカニズムを探索しているが、正確なメカニズムと基礎となる薬理学的プロセスはまだある識別が困難です。これは、1つの顆粒からあまりにも多くの有効成分が同時に類似または反対効果を発揮する可能性があるためです4.したがって、体内に送送る前に顆粒を調造する1つの標準プロトコルの開発は、治療結果に大きな影響を与えるだけでなく、生体内およびインビトロアッセイの両方にも必要とされる。

さらに、クリニックにおける顆粒の治癒効果は、インビトロまたはエクスビボ研究を用いて正確に同定することは困難であり、薬理学的メカニズムが複雑すぎるため課題を生み出します。これを解決するために、1980年代8年にタシノが薬剤含有血清の調製を最初に提案した。それ以来、多くの研究者が顆粒9、10、11を含む漢方薬に薬物含有血清を適用しました。現在、インビトロ調査のための薬物含有血清の選択は、生理学的条件を密接に模倣する1つの戦略とみなされている。

グシュカン(GSK)顆粒は、TCMの理論に照らして臨床実践に基づいて閉経後骨粗鬆症(POP)を治療するために開発された。GSK顆粒は、生体内の卵巣切除(OVX)マウスにおける骨損失を防ぎ、骨細胞性骨吸収を阻害し、骨芽細胞性骨形成を刺激する4。その結果、Li et al. 12は、GSK顆粒が骨形成を刺激するカルシウム受容体の活性を増強することによってOVXマウスにおいて骨保護効果を有することを見出した。GSK顆粒の骨保護効果と薬理学的効果を確認するために、著者らは、作業溶液および薬剤(GSK顆粒)含有血清の調製のための詳細な手順を提供する。さらに、この記事では、OVX誘発骨粗鬆症マウスモデルにおけるGSK顆粒および体外形成/骨芽形成におけるGSK顆粒含有血清の適用について説明する。

GSK顆粒は、いくつかのハーブ13、14で構成され、生理生理生理生理に完全に溶解することができます。したがって、生理食は車両として機能する。シャム投与マウス(シャム)およびOVXマウスを、顆粒投与マウスと同じ量の生理生理生理生理を投与した。マウスに対するGSK顆粒の同等の用量は、Meeh-Rubner方程式15に基づいて計算された。この方程式は、安全な用量を得ることの利点を有するだけでなく、薬理学的効果を保証する 15.GSK顆粒の3つの用量は、次のように生成されました: (1) GSKL: OVX + 低用量GSK顆粒, 2 g/kg/日.(2)GSKM:OVX+中用量GSK顆粒、4 g/kg/日。(3) GSKH: OVX + 高用量 GSK 顆粒, 8 g/kg/日.GSKL、GSKMおよびGSKH群におけるマウスを、GSK顆粒を胃内投与した。ビタミンD3(125国際単位/錠剤)を含む炭酸カルシウム(600mg/錠剤)は、例えば、骨粗鬆症を治療および予防するための成熟した市販品(例えば、カルトレート[CAL])において、陽性対照として使用された。

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プロトコル

すべての実験手順は、上海大学TCM(SZY201604005)の機関動物ケアおよび使用委員会の承認を得て行われました。

1. GSK作業ソリューションの準備と管理

  1. マウスのGSK顆粒の同等の用量を計算します。
    1. Meeh-Rubner 方程式15に基づいて体表面を計算する : ボディ サーフェス = K x (体重 2/3)/1000、K 値は人間の場合は 10.6、マウスの場合は 9.1 です。人間の体重が70kgであると仮定すると、人体表面(m2)=10.6 x(702/3)/1000= 1.8 m2.マウスの体重が 20 g (0.02 kg; 1 か月齢、メス、C57/BL6 など) であると仮定すると、マウス本体表面 (m2)= 9.1 x (0.022/3)/1000 = 0.0067 m2.
    2. 計算されたボディ表面に基づいて、人間とマウスの体の変形比を計算します。人間:70キロ/1.8メートル2 = 39。マウス:0.02キロ/0.0067 m2 = 3。GSK顆粒 = 20 g/70 kg x 39/3 = 3.72 g/kg ≥ 4 g/kg。
    3. マウスあたり20gの体重に基づいて、マウスの同等の投与量を計算します:4 g/kg x 0.02 kg = 0.08 g。
    4. グループあたり20匹のマウスに基づいて3つの同等の用量を計算し、3ヶ月間持続する介入(90日):(1)GSKL(OVX+低用量GSK顆粒[2g/kg/日]):0.04gマウス/日x20マウスx90日=72g(2)GSKM(OVX+ -中用量GSK)日):0.08gマウス/日x 20マウスx 90日=144g=(3)GSKH(OVX+高用量GSK顆粒[8g/kg/日]):0.12gマウス/日x20マウスx 90日=216g。
      注:損失を相殺するために、実際にはGSK顆粒の20%を追加で準備します。
  2. 体重15に基づいてマウスあたりのGSK顆粒の体積を計算する:例えば、体積(V)=0.24 mL/マウス/日。
    注:マウスの胃内投与の体積は0.12 mL/10 gである。
  3. GSK顆粒の3用量の10日分の重量を量る。GSK顆粒の8g、16g、および24gの重量を量り、それぞれGSKL、GSKM、およびGSKHとして機能します。
  4. ステップ1.1.1および1.1.2のステップのようにMeeh-Rubner方程式15に基づいてマウスのビタミンD3(CAL)を含む炭酸カルシウムの同等の用量を計算する:CAL投与量= 2錠/70 kg x 39/3 = 0.372錠/kg ≥ 0.4錠/kg。
  5. マウスあたり20gの体重(例えば、1ヶ月齢、雌、C57/BL6)に基づいて、マウスのCALの同等の投与量を計算します:0.4錠/kg x 0.02 kg = 0.008錠。次に、グループあたり20匹のマウスに基づいてCALの同等の用量を計算し、3ヶ月間持続する介入(90日):0.008錠x20 x 90 = 14.4錠。CAL(1.6錠)の10日間分の重量を量る。
  6. 解散
    1. 50 mLチューブにGSK顆粒の8gを入れます。48 mLの生理生理生理生理生理とシェイクチューブを加えて完全に溶解させます。
      注:完全な溶解のための標準は、堆積物の不在です。完全な溶解は、ガベジ針が作業溶液を引き出し、スムーズにそれを排出することができれば、さらに確認することができます。
    2. GSK顆粒の16gと24gでステップ1.5.1を繰り返します。
    3. CALの1.6錠(10日分)を50mLチューブに入れます。48 mLの生理生理生理生理生理とシェイクチューブを加えて完全に溶解させます。
      注:働く解決は-4 °Cで貯え、10日ごとに準備することができる。
  7. 胃内投与
    1. マウスの背面(生後1ヶ月、メス、C57/BL6)をマウスを前方に向けてつかみ、その位置にしっかりととどまるようにします。投与の前に2-3分間マウスを静かにしてください。
      注: 研究者がマウスの前面をはっきりと見えるようにしてください。特に新しい研究者のために、マウスの咬傷を防ぐために手袋を着用してください。
    2. GSK顆粒の作業溶液にガバゲ針(サイズ:#12、40mm)を入れ、作業溶液の0.24 mLを引きます。
    3. ガバゲ針が胃に届くまで、口の片側を通してマウスにガバゲ針を入れます。
      注:ガバゲ針が胃に達したことを確認するには:(1)ガバゲ針は抵抗感に遭遇する。一方、マウスは、ゲージ針が食道の物理的狭窄を通過する前に嚥下する作用を示す。(2)作業液を約0.5mLのマウスに注入し、1分間待ちます。マウスから溶液が出てこない場合は、ガバゲ針が胃に届いていることを意味します。
    4. GSK顆粒(0.24 mL/マウス)の作動溶液を胃に注入し、ガバゲ針を引き出します。マウスをケージに戻します。
    5. CAL 溶液でステップ 1.6.4 を繰り返し、マウスごとに 0.24 mL の CAL 溶液を注入します。
      注: CAL ソリューションの体積は、ステップ 1.2 のように計算されます。

2. マイクロCTスキャン

  1. Tイビア収穫と準備
    1. 90日目の介入の翌日に80mg/kgケタミンの300 mL/100gでマウスを精経内麻酔する。つま先の針のピンチを使用して、マウスが完全に麻酔されているかどうかを確認します。応答がない場合は、麻酔が成功した場合を示します。その後、子宮頸部脱臼でマウスを殺す。
    2. タックで泡の両腕と脚でマウスを固定します。
    3. 近位から遠位端まで脚のはさみ(サイズ:8.5cm)とピンセット(サイズ:10cm)で皮膚を切り取り、脛骨を収穫します。
    4. 直ちに脛間を70%エチルアルコールに入れ、3回洗います。
  2. マウスの左脛をスポンジフォームで包み、サンプルチューブ(直径35mm、長さ140mm)に入れます。
    注:標本の長い軸は、サンプルチューブの長軸と一緒にする必要があります。脛下の近位端が上方に向かっていることを確認します。
  3. マイクロCT 80スキャンマシンの実行
    1. 室温でマイクロCT 80スキャン機を起動します。
    2. サンプルチューブをmicro-CT 80に設定し、ピクセルサイズ15.6μm、チューブ電圧55kV、チューブ電流72μA、積分時間200ms、空間分解能15.6μm、ピクセル解像度15.6μm、画像マトリックスのスキャンを開始します。2048 x 2048
      注:キャンセルス骨は、事前スキャンによって皮質骨と区別されます。脛骨のスキャン領域は、脛骨高原の下5mmから遠位端までのカンセラ骨面積として定義される。
  4. 骨パラメータの定量化
    1. 断面スキャンを完了したら、左脛下の画像を取得します。
    2. 密度しきい値を 245−1000に設定します。マイクロCT評価プログラムV6.6を使用して、骨ミネラル密度(BMD)、全容積(BV/TV)以上の骨量(BV/TV)、線維柱帯骨数(Tb.N)、線維柱帯骨厚(Tb.Th)、骨線維柱帯骨分離(骨線維骨分離(Tb.Sp)。

3. インビトロ実験用血清の調製

  1. 計算
    1. ラットの体重0.2kg(生後1ヶ月、雌、スプラーグ・ドーリー)に基づいて、GSK顆粒の投与量を計算します:ラットのヒト投与量/日x体重x K/体重=ラット=20g/70kg/日x 70kg x K(K= 0.018)/0.2kg=2g/kg/日。
      注:Kは、ヒトとマウス15の間の薬理学的変換係数である(K= 0.018)。
    2. ステップ 3.1.1 を繰り返し、次の投与量を計算します。.
      1. GSKL の投与量を計算する: 10 g/70 kg/日 x 70 kg x K/0.2 kg = 1 g/kg/日.
      2. GSKMの投与量を計算する: 20 g/70 kg/日 x 70 kg x K/0.2 kg = 2 g/kg/日.
      3. GSKL の投与量を計算する: 40 g/70 kg/日 x 70 kg x K/0.2 kg = 4 g/kg/日.
      4. CALの投与量を計算する: 2 錠 /70 kg/日 x 70 kg x K/0.2 kg = 0.2 錠/kg/日.
    3. GSK顆粒およびCALの総投与量を計算する。
      1. GSKLの総投与量を計算する: 1 g/kg/日 x 0.2 kg x 6 ラット x 3 日 = 3.6 g.
      2. GSKMの総投与量を計算します: 2 g/kg/日 x 0.2 kg x 6 ラット x 3 日 = 7.2 g.
      3. GSKHの総投与量を計算する: 4 g/kg/日 x 0.2 kg x 6 ラット x 3 日 = 14.4 g.
      4. CAL投与量 = 0.2 錠/kg/日 x 0.2 kg x 6 ラット x 3 日 = 0.72 錠を計算します。
        注:100mL培養培地(20%GSK顆粒含有血清)を調製するには、合計10mLのGSK顆粒含有血清が必要です。各ラット(6ラット/群)は、遠心分離後にGSK顆粒含有血清の1.5−2 mLを提供することが期待される。
    4. 体重15に基づいてラット当たりのGSK顆粒の体積を計算する:例えば、体積(V)=2 mL/ラット/日。
      注:ラットの胃内投与の体積は0.1 mL/10 gである。
  2. GSK顆粒の3用量の3日間の価値を量る。GSK顆粒の3.6g、7.2g、および14.4gの重量を量り、それぞれGSKL、GSKM、およびGSKHとして機能します。CALグループの重量は0.72錠。
  3. GSK顆粒の7.2 gを50 mLチューブに入れます。36 mLの生理生理生理生理生理とシェイクチューブを加えて完全に溶解させます。GSK顆粒の3.6 gと14.4 gでこれを繰り返します。
  4. GSK作動液の2 mLを用いて胃内投与のためのセクション1.6を繰り返す。
    注:血清を調作するために同じ量の生理食生(ラット当たり2mL)を投与し、インビトロアッセイのためのブランク対照群として機能する。
  5. GSK含有血清の調製
    1. GSK顆粒の最後の投与後に80mg/kgケタミン1hの300 mL/100gでラットを食内麻酔する。つま先の針のピンチを使用して、ラットが完全に麻酔されているかどうかを確認します。応答がない場合は、麻酔が成功した場合を示します。
    2. 皮膚と腹膜を切開した後、まっすぐな手術はさみを使用してラットの胸郭の底に腹部を露出させる。
      注:手術器具は、使用前に高温および高圧で殺菌する必要があります。外科区域は採血の間に70%のエタノールと殺菌されなければならない。
    3. 腹部大動脈の結合組織をティッシュペーパーで取り除き、血管をはっきりと露出させる。
    4. 10 mL、22 G注射器を使用して腹部大動脈から血液を採取する。その後、針を取り出し、血液を15 mLの滅菌チューブに移します。通常、1匹のラットから6−8mLの血液を得ることができる。
      注:各ラットは、血液を描画するときに生き続ける必要があります。一つの指標は、ラットが生きているときに腹部大動脈が脈動するということです。ネズミは採血後に死んでいる。
    5. チューブがチューブ内に凝固するまで、室温で30~60分間直立してください。次に、チューブを500−600 x gで20分間遠心分離し、1つのグループ(6匹のラット)からすべての上清(血清)を1つの50 mL無菌チューブに移し、混ぜ合わせるために振ります。
    6. 56°Cの水浴で30分間インキュベートして血清を不活性化し、0.22μm-poreサイズの親水性ポリエーテルスルホンシリンジフィルターを使用して血清を濾過します。長期使用(1年未満)のために-80 °Cで保管してください。
      注:濾過された血清は、インビトロ破骨形成および骨芽形成に使用することができる。
  6. アプリケーション
    1. インビトロ破砕形成
      1. L-グルタミン、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドを含む最小イーグル培地(α-MEM)との1:4の比率でGSK含有血清(GSKL、GSKM、GSKH)の3つの用量を希釈する。
        注:インビトロ破骨形成および骨芽形成のためのGSK含有血清の最終濃度が20%であることを確認してください。
      2. 希釈されたGSK含有血清(200 μL/ウェル)をステップ3.6.1.1から骨髄マクロファージ(BMS)に4−6週齢のC57BL/6マウスから骨形成に加え、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、10ng/mL)でBMを刺激する前述の核因子-κBリガンド(RANKL、100 ng/mL)の場合2.
    2. インビトロ骨芽形成
      1. 手順 3.6.1.1 を繰り返します。
      2. 希釈されたGSK含有血清(2mL/ウェル)を骨間葉系幹細胞(BMSC)に4−6週齢のC57BL/6マウスから添加し、前述の16として骨芽細胞を生成する。

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結果

マイクロCT走査の結果は、OVXマウスが生理生理生理用分掌マウスと比較して有意な骨損失を示したことを示した(図1A)。GSK顆粒の介入(90日)は、特にGSKM群においてBMDを大幅に増加させた(図1B)。BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Thなどの骨構造パラメータを定量化した。GSK顆粒治療は、BMD、BV/TV、Tb.NおよびTb.Th増加したが、Tb.Sp(図1C)を減少させた。

塩酸塩耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色は、対照マウスと比較してOVXマウスにおける破骨球数の増加を示した(図2A)。GSK顆粒治療は、OVX群と比較してTRAP陽性破骨トラストを減少させた。これらの知見は、線維柱帯骨表面に対する...

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ディスカッション

TCM剤の顆粒は、製剤や処方箋のための一般的な選択肢の一つとなっています.GSK顆粒は、臨床経験またはTCM理論に基づいていくつかの漢方薬で構成され、副作用が少ないより良い治癒効果を発揮する4.水の煎じと比較して、顆粒はこれらの利点を有する:良い味、配達の利便性、長期貯蔵、標準的なプロトコルおよび一貫した治癒効果、ならびにより高い生産性。現在、顆粒は、TCMで最も一般的に使用される薬局の形成の一つです。しかし、薬理学的効果の根本的なメカニズムはまだめったに研究されていません。基礎となる薬理学的メカニズムを調査するために、顆粒の調製における重要なステップを決定する必要があります。

過去数十年の間に、漢方薬の1つ以上の代表的な有効成分は、通常、その構造的な明快さのために分子アッセイおよび薬理学的結果を実行するために使用されてきました。多くの調査は、TCMハーブ5、6、7から有効成分を用いた

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(81804116、81673991、81770107、81603643、81330085)、中国科学技術省革新的チームのためのプログラム(2015RA4002からWYJ)の助成金によって支援されました。中国教育省の革新的なチーム(IRT1270 to WYJ)、上海TCM医療センター(2017ZZ01010 to WYJ)、伝統的な中国医学計画の開発を加速する3年間の行動(ZY(2018-2020)-CCCX-3003からWYJへ、国家主要な研究開発プロジェクト(2018YFC1704302)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
α-MEMHyclone
laboratories		SH30265.018細胞培養用
&β;-グリセロリン酸ΣG5422骨芽細胞形成
カルトレート (CAL)WyethL96625動物介入
C57BL/6 マウスSLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		ランダムAinimal準備
デキサメトソームシグマD4902
メチルスルホキシシグマD2438細胞凍結
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)Sangon Biotech60-00-4treatmnet
ウシ胎児血清GibcoFL-24562培養
Gushukang顆粒カンチェン用companyin 中国Z20003255ハーブ処方
光学顕微鏡オリンパスBX50オリンパスBX50破骨細胞形成のための画像
L-アスコルビン酸 2-リン酸 スパンナグニーム スラット hyclrateシグマA8960-5G骨芽細胞形成
顕微鏡ライカDMI300Bオステオキャストと骨芽細胞
M-CSFPeprotechを想像してみてくださいAF-300-25-10破骨細胞&
Mu;icro-CTScanco
Medical AG&		mu;CT80レントゲン撮影マイクロトモグラフィー骨構造的鎮痛
RANKLPeprotech11682-HNCHF破骨細胞形成
Sprague DawleySLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		ランダム血清採取
酒石酸耐性酸性リン酸塩(TRAP)キットSigma-Aldrich387A-1KTTRAP 染色
ジドサンプル細胞

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