グラフト狭窄組織気道交換に重大な障害を引き起こします。狭窄症の基になる細胞のメカニズムを調べるためには、エンジニア リング組織シード骨髄単核細胞 (BM MNC) で代用気管のマウスモデルを駆使します。ここでは、私たちプロトコルの足場製造、BM MNC 分離、移植はシード、および注入を詳しく説明します。
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方法論記事
シードとマウス モデルにおける合成組織設計気管移植片の移植
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
先天性またはセカンダリ セグメントを長い気管欠損に対する治療の選択肢は、歴史的に機能的な組織を置き換えることができないのため限られています。ティッシュ エンジニア リングは、3 次元足場に細胞シグナリング分子を統合する能力と潜在的なソリューションとして大きい約束を保持します。設計組織気管移植片 (TETGs) と最近の研究は、いくつかの成功を見ているが、その翻訳グラフト狭窄によって制限されており、崩壊を移植し上皮化を延期します。これらの問題を駆動機構を調査するために組織気管移植移植モデルマウスを開発しました。TETGs は、ペットと PU (20: 80% 重量) の混合物のエレクトロスピニング ポリマー ポリエチレンテレフタル酸塩 (ペット)、ポリウレタン (PU) を使用して構築されました。足場は、6-8 週から骨髄単核細胞を用いた播種-勾配遠心法によって古い c57bl/6 マウス。移植あたり 1000 万の細胞足場の内腔にシード, 3 番目と 7 番目気管リング間の注入の前に一晩インキュベートする許可。これらのグラフト狭窄所見を要約することが、組織学的解析と蛍光抗体法で 5 ケラチンとケラチン 14 の基底上皮細胞の欠如によって示されるように、上皮化を遅延しました。このモデルは、ホストの改造に関与する細胞および分子メカニズムを調査するためのツールとなります。
概要
長いセグメント気管欠陥を完全な気管軟骨輪と気管無形成と同様、外傷、悪性腫瘍、感染症などの稀な先天性の条件として提示できます。大人または小児の気管の長さの 30% で 6 cm を超える場合これらの欠陥は再建術によって処理されません。自家組織、脳死移植、人工気道を置き換える試みは、慢性感染、肉芽、機械の故障、および狭窄症に悩まされています。
設計組織気管移植片 (TETGs) 潜在的生涯免疫抑制療法の必要性を回避しながらこれらの問題に対応できます。過去 10 年間で TETGs は動物モデルでテストし、まれに思いやりの使用1,2,3の臨床的に利用されています。臨床と大規模な動物実験、設計組織気道交換から術後の回復必要戦闘狭窄する多数の介入 (として定義 > 50% の内腔狭小化) し、気道の開存性を維持します。TETG の追加作業は、細胞播種の選択、血管新生と足場設計の役割を評価することによってこの狭窄を削減を求めています。細胞播種選択肢とネイティブの気管の構造・機能の回復を目指した足場設計が主に呼吸の上皮細胞と軟骨細胞の様々 な吸収性、非吸収性、脱足場でシードに注目されています。可能性があります血管新生は、狭窄の開発で主要な役割を果たしている、他のグループは、体外または血行....
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プロトコル
ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 全国こども病院で承認されています。
1. 足場製造
- による高分子ナノファイバー前駆体溶液を準備: 1) 溶解 8 wt % ペット 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol と 2) 3 wt % PU 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol 室温で溶解することにより 60 ° c とのソリューションを加熱します。
- 冷却、ペットと PU (20: 80) の最終的なポリマーの混合物を作成するソリューションを結合します。
- PET:PU 液でいっぱい 60 mL の注射器に 20 G 鈍い先端針を利用したステンレス鋼の棒 (直径 1 mm) に PET+ PU ソリューション +14 に高電圧 DC 電源供給セットを使用して針、別の高電圧 DC 電源に kV 供給-3 に設定 Electrospin kV、5 mL/h の流量と 20 cm のヒント-基板距離。繊維堆積時 350 rpm にロッドを回転させます。
- 300 μ m の目的足場壁の厚さが達成されるまでは、エレクトロスピニングを続けます。ロッド、足場をスライドし、任意の残留溶媒を除去するためには一晩を真空下でそれを保持します。
- 注入前に 350 mJ/cm2の紫外線光....
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結果
TETG 播種および注入の概略図を図 1に示します。骨髄は c57bl/6 マウスから収穫され、の in vitro培養します。BM 多国籍企業は、密度遠心分離によって分離され、シード、TETG に。シードの TETGs は、同系 c57bl/6 受信者マウスに移植されました。
図 2は、製造工程 PET:PU TETG 足場の概要です。PET:PU ソリューションは、300 μ m とルーメン ネイティブ マウスの気管を近似する 1 mm 直径の最終的な TETG の壁の厚さを達成するために 20 G の鈍針にエレクトロスピニングをでした。TETG の表面は、アニメーションの単核細胞の走査型電子顕微鏡画像で見ることができます。
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ディスカッション
設計組織気管マウス モデルの開発は臨床 TETGs; 翻訳が限られている点を理解する上で不可欠であります。すなわち移植崩壊、狭窄と遅延上皮化4.これらの制限に貢献するいくつかの要因には、移植材料、製造プロセス、足場設計および細胞播種プロトコルの選択が含まれます。このモデルは、それらに影響を与える細胞および分子メカニズムを理解するためにこれらの要因の高速評価できます。
我々 がここで示したをグラフト狭窄 (図 5) を要約するモデルの能力と同様に、上皮細胞 (図 4) の存在モデルの使用の成功は注入プロセスの間にいくつかのキーの手順と異なります。まず、初期の切開とマウスの気管の分離の間に損傷を避けるために不可欠または気管食道溝にある隣接する反回神経のストレッチです。ネイティブ気管切除時にもう一つの重要な要因は、気管に後方に座っている食道への損傷を避けるためです。
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開示事項
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
謝辞
グラフィック デザインのロバート ・ ストラウス ・研究情報ソリューション支援全国の小児病院で技術革新部門を認識したいと思います。この作品は、NIH (米国 K08HL138460) からの助成金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9%塩化ナトリウム注射 | APP医薬品 | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc血清ピペット | ファルコン | 357551 | |
| 18G 1.5in。ニードル | BD | 305190 | |
| 1mL シリンジ | BD 309659 | ||
| 24 ウェルプレート | コーニング | 3526 | |
| 25cc 血清ピペット | ファルコン | 356535 | |
| 25G 1in.ニードル | BD | 305125 | |
| 50ccチューブ | BD352070 | ||
| アルコール準備パッドフィ | ッシャーヘルスケア | NDC 69250-661-02 | |
| リル(エンロフロキサシン)溶液 | バイエルヘルスケア、LLCNDC | 0859-2267-01 | |
| ブラックポリアミドモノフィラメント縫合糸、9-0 | ロスサージカルインスツルメンツコーポレーション | T05A09N10-13C57BL | |
| 6、女性 | ジャクソン研究所 | 664 | 6-8週齢 |
| エン酸緩衝液pH 6.0 20倍濃縮 | サーモフィ | ッシャー5000 | |
| トラクターF.S.T | 17000-04 | ||
| チップアプリケーター | フィッシャー科学 | 23-400-118 | |
| サイトケラチン14モノクローナル抗体 | サーモフィッシャーMA5-11599 | ||
| デュモン #5 鉗子 | F.S.T | 11251-20 | |
| デュモン #5/45 鉗 | F.S.T | 11251-35 | |
| デュモン #7 ファイン鉗子 | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 ラット抗マウス抗体 | バイオ・ラッド | MCA497R | |
| フィコール | シグマ | 10831-100mL | |
| 細ハサミ シャープ鈍 | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrandのプレミアムカバーメガネ | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield 封入剤 | DAPI | Abcam ab104139 | |
| ヤギ抗マウスIgG二次抗体 Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| ヤギ抗ウサギIgG二次抗体 Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| ヤギ抗ラットIgG二次抗体 Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| ヨウ素調製パッド | プロフェッショナル ディスポーザブル インターナショナル Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| ケラチン5ポリクローナル抗体、精製 | バイオレジェンド | 905501 | |
| ケタミン塩酸塩注射 | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| マイクロアドソン鉗子 | F.S.T | 11018-12 | |
| 顕微鏡 | ライカ | M80 | |
| 不織布スポンジ | Covidien | 441401 | |
| 眼科軟膏 | Dechra 獣医製品 | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (ポリエチレンテレフタレート&ポリウレタン) 足場 | ナノファイバーソリューション | カスタムオーダー | |
| シャーレ | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 ミディアム | Gibco | 11875-093 | |
| TISH ニードルホルダー/鉗子 | Micrins | MI1540 | |
| トリマー | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingenの春はさみ | FST15008-08 | ||
| 温水recirculator | ゲイ | マーTP-700 | |
| キシラジン無菌溶液 | Akorn動物の健康 | NDC 59399-110-20 |
参考文献
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proo....
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