Method Article

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

DOI:

10.3791/59189

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May 10th, 2019

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1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Otology, Shengjing Hospital of China Medical University

In This Article

Summary

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本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。

Abstract

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内毛細胞(IH)は、リボンシナプスを介してスパイラル神経節ニューロン(SNS)に音響信号を伝達します。いくつかの実験的研究は、毛髪細胞シナプスが感音難聴(SNHL)の初期ターゲットである可能性があることを示しています。このような研究は、IHCとSGN間の異常なシナプス伝達をもたらすリボンシナプス数、構造、または機能の変化を指す人工内科的な「シナプトパシー」の概念を提案している。内膜シナプトパシーは不可逆的であるが、聴覚閾値には影響しない。騒音誘発実験モデルでは、特定の周波数領域におけるIHCシナプスへの制限損傷が、シナプトパシーを特異的に引き起こす環境要因と、この内耳を乱す生理的影響を同定するために用いられる。回路。ここでは、成体マウスにおける特定の周波数領域における人工内科形態および機能を解析するためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、特定の周波数領域の人工的な局在化は、コクレオグラムデータと組み合わせて場所周波数マップを使用して行われ、その後、リボンシナプスの形態学的特性がシナプスを介して評価される免疫染色。リボンシナプスの機能状態は、聴覚脳幹応答(ABR)波Iの振幅に基づいて決定される。本報告は、このアプローチが、新しい治療介入の開発に役立つ可能性のある人工内接管機能不全の病因およびメカニズムに対する理解を深めるために使用できることを示している。

Introduction

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約20\u201220,000 Hzの範囲の周波数は、人間によって聴覚刺激として知覚することができる。人間の聴覚は通常、1,000 Hz付近で最も敏感であり、若年成人の平均音圧レベルは20μPa(すなわち、音圧レベル[dB SPL]の0デシベル)である。いくつかの病理学的状態では、難聴は特定の周波数に制限されます。例えば、騒音性難聴(NIHL)の初期段階では、「ノッチ」(すなわち、聴力閾値の上昇)を4kHz1のオーディオグラムで観察することができる。哺乳類の人工内来の人工内陸部に沿って、剛性と質量のグラデーションは指数関数的な周波数マップを生成し、高周波音検出を人工内陸部の基部に、頂点2で低周波検出します。確かに、基底膜に沿って内々の場所周波数マップがあり、トノトピック組織2、3として知られているものにつながる。基底膜上の各所定の場所は、通常、特性周波数3、4と呼べられている1つの特定の音周波数に対してのみ最高の感度を有するが、他の周波数に対する応答も観察することができる。

現在までに、聴覚系における正常な機能、病理学的プロセス、および治療効果を調べ....

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Protocol

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すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのNRC/ILARガイド(第8版)に従って行われました。研究プロトコルは、首都医科大学、北京、中国の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 動物の選択

  1. すべての実験のために、動物モデルとして成人C57BL/6Jオスマウス(生後8週間)を使用する。
    注:Cdh23のスプライス変異体を運ぶC57BL/6Jマウスは、聴覚系における加速老化を示し、生後6ヶ月の途中ターンでリボンシナプスの40%の損失と10%の損失として反映され、その後急速に続く18歳、19歳と全体の菌管内でこの損失の増加.従って、聴覚研究のために6ヶ月以上前のC57BL/6Jマウスを使用する場合は注意が必要です。マウスの他の株は、特定の実験目的に応じて使用することができる。
  2. 専門の診断ポケット耳鏡を使用してマウスを検査し、聴力評価の前に外耳または中耳病理を除外します。潜在的な徴候は、外部の聴覚管の流体または膿、局所組織の発赤および腫脹、および鼓膜穿穿止を含む。
    注:これはめったに遭遇しませんが、一度同定されたら、外耳または中耳疾患を持つマウスは除外されるべきである。

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Results

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ABR聴力検査は、麻酔下で10匹のC57BL/6Jマウス(生後8週間)について行った。Aバーは4、8、16、32、48kHzのトーンバースト刺激を用いて引き起こされた。各動物の聴覚閾値は、ABRで少なくとも1つの明確な波形を区別することによって視覚的に検出された。すべてのマウスは、刺激の頻度に応じて25〜70 dB SPLの間のトーンバーストに応答してABR閾値を示した。その結果、聴覚閾値が16kHz(図1)で最も低かったことが示され、他の補聴器では音響感度が有意に低下することが示唆された(図2)。地域。

全山骨は、立体解剖顕微鏡下で成体マウスの側骨から単離した(図2A)。聴覚上皮の全山は3つの部分に解剖され、その長さは測定され、最終的には心膜頂点からのパーセント距離に変換された。各コクレアターンの基底膜上の周波数位置は、前述の5,6(.......

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Discussion

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コクレアシナプトパシーは、2時間31の100 dB SPLで8\u201216 kHzオクターブ帯域ノイズによって誘発された一時的閾値シフト(TTS)を有する成体マウスで最初に特徴付けられたので、研究者は、様々なシナプトパシーの効果をますます調査してきました。サルやヒトを含む哺乳類32,33.騒音暴露に加えて、いくつかの他の条件は、他のいくつかの条件が、内膜シナプトパシー(例えば、老化、脱毒性薬物の使用、および遺伝的変異)に関連しており、超閾値オーディションの短期的な中断につながり、その後不可逆的である。聴神経の変性。菌管点侮辱の初期段階では、シナプトパシーは特定の周波数位置でしばしば起こり、特にIHCシナプスへの損傷が選択周波数領域24,31に制限される実験モデルにおいては、したがって、我々のプロトコルは、特定の周波数領域におけるシナプス形態および機能の調.......

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Disclosures

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著者は、開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

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この研究は、中国国立自然科学財団(81770997、81771016、81830030)によって支援されました。北京自然科学財団と北京教育委員会(KZ201810025040)の共同資金プロジェクト。北京自然科学財団(7174291);。中国ポストドクター科学財団(2016M601067)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
塩酸ケタミンGutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, ChinaH35020148100 mg/kg
塩酸キシラジンSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAX-125110 mg/kg
TDT 生理装置Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
SigGen/BioSig softwareTucker-Davis Technologies, Alachua,フロリダ州、米国聴覚生理学システムIII
電気パッド楽しい11072931136
デュモン鉗子 3#Fine Science Tools、ノースバンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ0203-3-PO
デュモン鉗子 5#Fine Science Tools、ノースバンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ0209-5-PO
ステレオ解剖顕微鏡ニコン株式会社、東京、日本SMZ1270
ヤギ血清ZSGB-BIO、北京、中国ZLI-9021
抗グルタミン酸受容体2、細胞外、クローン 6C4Millipore Corp.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国MAB397マウス 
精製マウス抗CtBP2BD Biosciences, Billerica, MA, USA612044マウス 
Alexa Fluor 568 ヤギ抗マウス IgG1抗体Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21124ヤギ
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG2a 抗体Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21131ギ
ZSGB-BIOを含む封入剤ZLI-9557
共焦点蛍光顕微鏡Leica Microsystems, Wetzlar,ドイツTCS SP8 II
Image Pro Plus softwareMedia Cybernetics, Bethesda, MD, USAversion 6.0
プロフェッショナル診断ポケット耳鏡Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,ChinaHS-OT10
針電極Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China102920 mm, 28 G
クローズドフィールドスピーカーTucker-Davis Technologies、アラチュア、フロリダ州、米国CF1
ペット ヤDAPI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduc....

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