マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

Summary

本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。

Abstract

内毛細胞(IH)は、リボンシナプスを介してスパイラル神経節ニューロン(SNS)に音響信号を伝達します。いくつかの実験的研究は、毛髪細胞シナプスが感音難聴(SNHL)の初期ターゲットである可能性があることを示しています。このような研究は、IHCとSGN間の異常なシナプス伝達をもたらすリボンシナプス数、構造、または機能の変化を指す人工内科的な「シナプトパシー」の概念を提案している。内膜シナプトパシーは不可逆的であるが、聴覚閾値には影響しない。騒音誘発実験モデルでは、特定の周波数領域におけるIHCシナプスへの制限損傷が、シナプトパシーを特異的に引き起こす環境要因と、この内耳を乱す生理的影響を同定するために用いられる。回路。ここでは、成体マウスにおける特定の周波数領域における人工内科形態および機能を解析するためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、特定の周波数領域の人工的な局在化は、コクレオグラムデータと組み合わせて場所周波数マップを使用して行われ、その後、リボンシナプスの形態学的特性がシナプスを介して評価される免疫染色。リボンシナプスの機能状態は、聴覚脳幹応答(ABR)波Iの振幅に基づいて決定される。本報告は、このアプローチが、新しい治療介入の開発に役立つ可能性のある人工内接管機能不全の病因およびメカニズムに対する理解を深めるために使用できることを示している。

Introduction

約20\u201220,000 Hzの範囲の周波数は、人間によって聴覚刺激として知覚することができる。人間の聴覚は通常、1,000 Hz付近で最も敏感であり、若年成人の平均音圧レベルは20μPa(すなわち、音圧レベル[dB SPL]の0デシベル)である。いくつかの病理学的状態では、難聴は特定の周波数に制限されます。例えば、騒音性難聴(NIHL)の初期段階では、「ノッチ」(すなわち、聴力閾値の上昇)を4kHz¹のオーディオグラムで観察することができる。哺乳類の人工内来の人工内陸部に沿って、剛性と質量のグラデーションは指数関数的な周波数マップを生成し、高周波音検出を人工内陸部の基部に、頂点2で低周波検出します。確かに、基底膜に沿って内々の場所周波数マップがあり、トノトピック組織2、3として知られているものにつながる。基底膜上の各所定の場所は、通常、特性周波数3、4と呼べられている1つの特定の音周波数に対してのみ最高の感度を有するが、他の周波数に対する応答も観察することができる。

現在までに、聴覚系における正常な機能、病理学的プロセス、および治療効果を調べるには、様々なマウスモデルが用いられてきた。マウスの菌管内の生理学的パラメータの正確な知識は、難聴のこのような研究のための前提条件です。マウスのコクレアは、解剖学的に異なる周波数領域に対応する頂点、中間、基底ターンに分割されます。Müllerらは、内膜核における聴覚神経アフェントを標識して、その対応する末梢内性部位を分析することにより、生体内の通常マウスに内因性の場所周波数マップを確立^{することに}成功した。7.2~61.8kHzの間隔で、バジラー膜の全長の90%から10%の間の位置に相当する、マウスの心状位頻度マップは、単純な線形回帰関数によって記述することができ、との関係を示唆する特徴^周波数5の内陸部ベースと対数からの正規化された距離。実験室マウスでは、場所周波数マップを使用して、特定の周波数範囲内の聴覚閾値と、バジラー膜6に沿った相対領域における欠損毛細胞の数を示すコクレオグラムとの関係を調べることができる。重要なことに、場所周波数マップは、末梢聴覚外傷を有するマウスの特定の内気周波数位置における毛髪細胞のリボンシナプスへの損傷など、最小限の構造的損傷を調査するための測位システムを提供する7 ^、8.

哺乳類の交響合管では、リボンシナプスは、シナプス前のリボン、IHC内のグルタミン酸を含む放出準備のシナプス小胞のハローをつなぎ合う電子密度の突起、およびSGNの神経末端上のポストシナプス密度で構成されています。グルタミン酸受容体⁹.人工内波音伝達の間、毛細胞束のたわみはIHC脱分極を引き起こし、IHCから後のアフェレント末端へのグルタミン酸放出を引き起こし、それによって聴覚経路を活性化する。この経路の活性化は、SGN¹⁰のレートコードに音誘発機械的信号の変換につながります.確かに、IHCリボンシナプスは、高い時間精度で数百ヘルツの速度で不確定な音伝送に非常に特化しており、音符号化の前シナプス機構にとって非常に重要です。これまでの研究では、リボンシナプスは、成人マウスの異なる周波数領域でサイズと数が大きく異なることを明らかにしている^11,12,特定のサウンドコーディングに構造的適応を反映する可能性が高い生存の必要性。最近、実験動物実験は、内膜シナプトパシーが、騒音性難聴、加齢性難聴、遺伝性難聴を含む複数の形態の聴覚障害に寄与することを実証している。^14.従って、特定の頻度領域におけるシナプス数、構造、および機能の相関変化を同定する方法は、聴覚発達および内耳疾患の研究においてますます採用され、より生成されたモデルを用いて遺伝的または環境変数の実験的操作^15,16,17.

本報告では、成体マウスにおける基底膜の特定の周波数領域におけるシナプス数、構造、機能を解析するためのプロトコルを提示する。コクレア周波数局在化は、特定の場所周波数マップを使用して、コクレオグラムと組み合わせて行われます。人工内科の正常な形態学的特徴は、シナプス前および後シナプス免疫染色によって評価される。コクレアリボンシナプスの機能状態は、ABR波Iの超閾値振幅に基づいて決定される。わずかな変更では、このプロトコルは、ラット、モルモット、および細菌を含む他の動物モデルにおける生理学的または病理学的状態を調べるために使用することができる。

Protocol

すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのNRC/ILARガイド(第8版)に従って行われました。研究プロトコルは、首都医科大学、北京、中国の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 動物の選択

1. すべての実験のために、動物モデルとして成人C57BL/6Jオスマウス(生後8週間)を使用する。
   注:Cdh23のスプライス変異体を運ぶC57BL/6Jマウスは、聴覚系における加速老化を示し、生後6ヶ月の途中ターンでリボンシナプスの40%の損失と10%の損失として反映され、その後急速に続く¹⁸歳、19歳と全体の菌管内でこの損失^の増加.従って、聴覚研究のために6ヶ月以上前のC57BL/6Jマウスを使用する場合は注意が必要です。マウスの他の株は、特定の実験目的に応じて使用することができる。
2. 専門の診断ポケット耳鏡を使用してマウスを検査し、聴力評価の前に外耳または中耳病理を除外します。潜在的な徴候は、外部の聴覚管の流体または膿、局所組織の発赤および腫脹、および鼓膜穿穿止を含む。
   注:これはめったに遭遇しませんが、一度同定されたら、外耳または中耳疾患を持つマウスは除外されるべきである。

2. 聴力評価

1. 塩酸ケタミン(100mg/kg)と塩酸キシラジン(10mg/kg)の混合物の精前注射を使用してマウスを麻酔する。痛みを伴う刺激(例えば、つま先ピンチ反射)を介して麻酔の深さを判断する。
   注:つま先ピンチ反射が完全に欠落しているとき、動物は聴覚検査のための麻酔の十分な深さに達した。両側ABR記録により多くの時間が必要な場合は、元の麻酔機を復元するために麻酔薬の低い投与量(元の投与量の5分の1)を投与する。これはマウスの死につながる可能性があるため、麻酔の過剰摂取を避けるように注意してください。
2. 熱調整加熱パッドを使用して、麻酔動物の体温を37.5 °Cに維持します。麻酔動物を電気的および音響的に遮蔽された部屋に置き、聴力検査を通して干渉を避ける。
   注:動物が完全に目を覚ますまで、全手順中に生理的温度を維持し、麻酔後の低体温による死亡を防ぐ。
3. 頭蓋骨の頂点(記録電極)に皮下針電極(20mm,28G)を配置し、測定された耳のピナの下のipsial視差領域(参照電極)、および反対方の耳下領域(接地電極)に、深さ3mmの位置を持つ。マウスヘッドの皮膚の下で、^{それぞれ20.}
4. 閉じたフィールドスピーカーを使用して、コーン型の先端を持つ2cmのプラスチックチューブを介して音響刺激を行います。先端を外耳^道21に取り付けます。
   注:記録および参照電極の電気インピーダンスが 3 kOhm 未満(通常は 1 kOhm)であることを確認します。インピーダンスが高い場合は、電極の挿入部位を変更し、電極をアルコールで洗浄するか、ABR波振幅の変化を避けるために電極を交換してください。
5. ABR 記録の場合、トーン ピップ (3 ミリ秒の継続時間、1 ミリ秒の上昇/下降時間、21.1/秒、周波数: 4~ 48 kHz) を生成し、5\u201210 dB SPL ステップ²⁰で SPL を 90 から 10 dB に減少させます。このステップでは、応答が増幅され(10,000回)、フィルタリング(0.1~3 kHz)、平均(1,024サンプル/刺激レベル)が得られます。
   注:ABは10 dBステップで各刺激レベルに対して収集され、しきい値の近くにさらに5つのdBステップが付いています。
6. 各周波数で、ABR しきい値を決定し、最小 SPL を参照し、目視検査によって明確に識別できる 1 つ以上の識別可能な波を持つ信頼性の高い ABR 記録を得る(図1)。
   注:波形の一貫性を確保するために、通常、しきい値の周りに低 SPL のプロセスを繰り返す必要があります。応答しきい値は、5 dB の減少が波形の消失につながる場合に、波形が観察できる最も低い刺激レベルです。

3. コクレア組織加工

1. ABR記録の後、子宮頸部脱臼を介して麻酔マウスを安楽死させ、それらを切断し、腹部側から雄牛を露出させ、鋭いはさみで開いて、人工内気にアクセスする。
2. 細かい鉗子を使用して、側頭骨を取り除き、ステーテープ動脈を切断し、楕円形の窓からステープを取り除き、丸い窓膜を破裂させる。針の先端(13mm、27G)を穏やかに回転させることによって、補管の頂点に小さな穴を作ります。
3. 4%(wt/vol)パラホルムアルデヒドを0.1Mリン酸緩衝生理食べ物(PBS、pH 7.4)で一晩4°Cで固定します。細かい先端のピペットを使用して、楕円形または円形の窓(入口として)と頂点(出口として)の開口部への適用を介して周部空間を通して静かに固定を洗い流します。
   注:一部のタンパク質は、免疫標識のためのエピトープの破壊を避けるために、短い固定期間を必要とします。このような場合、免疫組織化学の製造元の指示に応じて、室温(RT)で4%のパラホルムアルデヒドで骨を2時間インキュベートします。固定はまた、心筋血を除去するために心臓灌流を介して行うことができ、特に内耳属頭蓋症のマウスモデルにおいて、後の段階で非特異的な染色によるバックグラウンドノイズを回避する。
4. 残留パラホルムアルデヒドを除去するために、0.1 Mの冷たいPBSで5分間骨を3回すすいでください。10%エチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)で骨を脱石し、RTで4時間、または20rpmで水平シェーカーで穏やかに振る(24時間)4°Cで行います。EDTA は途中でリフレッシュできます。
   注:デカルカーション時間は、EDTAの濃度とユーザーの好みに応じて異なります。デカル化された組織は、後のステップで内気性の全マウントを分離する操作を容易にする靭性の一定の程度を維持する必要があります。時間骨は回転と10%EDTAでデカルシングすることができ、研究者はABRテストと固定実験の後に実験室を離れることができます。デカール化時間は4°Cで20〜30hの範囲内で柔軟です。
5. EDTA から 0.1 M PBS に 1 つのデカール化された時間骨を転送します。#3、#5デュモン鉗子および27 G針を使用して、頂点、中間および基底の内気管領域を順番に解剖し、ステレオ解剖顕微鏡下で骨から分断する(前述の22)。かみそり刃を使用して螺旋状靭帯に沿って一連の小さな切り傷を行い、テクト膜とライスナーの膜を取り除きます(図2)。
   注:解剖されたコクレアが無傷である限り、このプロセスは個々のオペレータの通常のプロトコルに従って変更することができる。
6. さらに、スパイラルリムを含む残りの聴覚上皮を個々の心状旋回(頂点、中間、フック領域を有するベース)に解剖し、全マウント製剤を行う。
7. 小顕微鏡の40倍の油目的の下で、IHCの立体に沿って調節することができる眼ピースに置かれる250 μmのスケールとバジラーの膜の長さを測定する。
8. すべてのセグメント長(セグメントあたり250μm)を加算して各コクレアターンの長さを計算し、各ターンの長さを合計して、バシラー膜の全長を同時に得ます。
9. フック領域を含むバジラー膜の全長を、コクレア頂点からの距離に基づくパーセンテージに変換します(0%は、内陸部頂点を指し、100%をコクレアベースにします)。
10. 対数関数 (d(%) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f)を使用して、この距離をコクレア特性周波数に変換し、周波数の傾きが 1.25 mm/オクターブで、d はコクレア頂点からの正規化距離であるkHzの周波数)、前述の5、6.従って各病管ターン上のバシラー膜の対応する領域における周波数範囲を獲得することができる。

4. 免疫蛍光染色

1. 解剖後、各菌管を別々の2.5 mL遠心管に入れ、10%ヤギ血清/PBS/0.1%のトリトンX-100を回転子のRTで1時間回回してインキュベートします。
2. 解剖顕微鏡下で200μLピペット先端を用いて各チューブから上記のブロッキング/透過性溶液を取り出し、5%ヤギ血清/PBS/0.1%のトリトンX-100をローター上の4°Cで一晩希釈した一次抗体で試料をインキュベートします。
   注:人工シナプスリボンの免疫標識のために、シナプスマーカーマウス抗カルボキシル末端結合タンパク質2IgG1(CtBP2、RIBEYE足場タンパク質のBドメインを標識、1:400)および後粘膜マーカーマウス抗グルタミン酸受容体2を使用する。IgG2a (GluR2, AMPA受容体のサブユニットを標識, 1:200)²³.
3. 0.1 Mの冷たいPBSで5分間3回リンスし、残留一次抗体を除去し、5%ヤギ血清/PBS/0.1%トリトンX-100で希釈した二次抗体で検体をインキュベートし、回転子の暗闇の中で2\u20123 hのRTで試料をインキュベートします。
   注:ヤギの抗マウスAlexa Fluor 568(IgG1,1:500)およびヤギの抗マウスAlexa Fluor 488(IgG2a,1:500)を用いて適切な二次抗体混合物を調製し、ステップ4.2で使用される一次抗体に相補的である。シナプスリボンの標識効率を向上させるには、特異的な二次抗体を選択することをお勧めします。一部のラボは、GluR2免疫^標識24を増加させるために二次抗体によるインキュベーションを拡張する。
4. 0.1 M PBSで5分間3回洗い出し、残留二次抗体を除去し、2.5 mL遠心管から0.1 M PBSを含む35mmプレートに試料を移します。
5. 4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を含む取り付け媒体をスライド上に置き、検体をPBSから取り付け媒体に移します。スライド上にカバースリップの1つのエッジを配置し、カバースリップが穏やかに落ちるようにリリースします。
   注:毛髪細胞が上向きに向き、手順中に折り畳みやねじれが起こらないようにするために、ステレオ解剖顕微鏡下に内包標本を取り付けます。
6. スライドを一晩4°Cのスライドボックスに入れ、スライドを乾燥させ、レーザー共焦点顕微鏡の下で画像を撮影します。

5. コクレアリボンシナプスの形態学的評価

1. 3つのレーザーを用いた共焦点顕微鏡(405 nm UVダイオード、488nmアルゴンレーザー、561nmダイオードポンプ式ソリッドステート(DPSS)レーザーを使用してDAPIを励起する画像スライド(励起スペクトル409-464nm)、Alexa Fluor 488(励起スペクトル496-549)、Alexa Fluor 488(励起スペクトル496-549)とAlexa Fluor 488(励起スペクトル573-631 nm)、それぞれ。
2. 63倍の高解像度オイル浸漬レンズを使用して、各コクレアターンから8μmの距離にわたって共焦点Zスタックを取得します。
   注:一度定義したら、フォトマイクログラフをデジタイズするためのすべてのパラメータを保存し、すべてのスライドに均一に適用する必要があります。
3. シナプス穿刺数の場合は、Z スタック (0.3 μm ステップ サイズ) を IHC の全長にまたがるように設定し、すべてのシナプス穿クタを確実にイメージ化できます。
4. Z スタックにパンクタを含むイメージをマージして Z 軸投影を取得し、画像処理ソフトウェアにインポートします。
5. 特定の周波数領域における各Zスタックのシナプス合計数をIHCの数(DAPI核マニュアルカウントに等しい)で除算し、各IHCのシナプスパンクタ数を計算します。各特定の周波数領域で、9~11個のIHCを含む異なる顕微鏡場の3つの画像ですべてのシナプス穿クタを平均する。
   1. フリーハンド選択ボタンを使用して、各 IHC のバソラテラル領域を含む関心領域 (ROI) の概要を説明します。パンクタの自動定量化にはメジャー機能と、隣接するスポットを区別する集水域機能を使用します。
   2. 各自動計数の後、手動修正で目視検査を実行して、puncta カウントの信頼性を確保します。
      注:実験者は、スライドがコクレアの頂点、中間、または基底ターンから来るかどうかについて盲目のままである必要があります。
6. シナプス構造と分布を視覚的に評価し、鉛筆ツール(M) を使用して個々のIHC を手動で近傍から分離し、サイトスケラル アーキテクチャとシナプスローカリゼーションをより良く視覚化します。
7. シナプス前リボン(CtBP2)と後類性受容体パッチ(GluR2)の並置を検査するには、長方形マーキーツールでリボンの周りのボクセル空間を抽出し、作物によって個々のリボンを分離します。画像> 画像サイズをクリックして、これらのミニチュア投影のサムネイル配列を取得し、ペアのシナプス(CtBP2陽性とGluR2陽性のパンクタの密接に並置されたペアとして現れた)と孤児を識別するために使用することができます。リボン(ポストナプティックグルタミン酸受容体パッチを欠いている)(図3)。
   注:正常な人工内膜シナプスは、毛細胞内のシナプス前リボンの組み合わせ免疫標識として現れる(抗CtBP2)および聴覚神経末端上の後膜性グルタミン酸受容体パッチ(抗GluR2)25。一部のラボでは、3D モデリングと共に共焦点投影を使用して、シナプスパッチサイズまたはボリューム^26、27を定量化します。リボンシナプスの著しい損失の前に、サイズの変化を示すリボンまたは対対グルタミン酸受容体パッチなしは、シナプス機能障害27、28を示す可能性が高い。

6. コクレアリボンシナプスの機能評価

1. 超閾値ABR波I振幅の分析のために90 dBのSPLで提示される各周波数刺激のすべてのABR波を収集します。
   注:神経生理学的および形態学的研究は、低い自発的率、高閾値繊維が特に老化および騒音暴露29、30に対して脆弱であることを実証した。リボンシナプスの単純な損失はABR閾値に影響を与えることはできませんが、一般的にABR波I振幅の大幅な減少をもたらします。低閾値繊維は、内膜神経線維28、29、31の総量活動に大きく寄与する。90 dB SPL の超閾値強度がここで選択されます。
2. オフライン解析プログラムを使用してピークからピークまでの波を決定します (図4)。ABR検定の各波Iは、開始正(p)偏向と後続の負(n)偏向で構成されます。ABR波I振幅は、Ip(波Iの正のピーク)とIn(波Iの負のピーク)29との電圧の差として定義される。
   注:病理学的状態では、音によって誘発されるSGNの総蓄積発症応答を反映するABR波Iの超閾値振幅に基づいて、内膜シナプトパシーを決定することができる。しかしながら、OHC機能不全のために損なわまない内接感は、この方法の前提条件である。

Results

ABR聴力検査は、麻酔下で10匹のC57BL/6Jマウス(生後8週間)について行った。Aバーは4、8、16、32、48kHzのトーンバースト刺激を用いて引き起こされた。各動物の聴覚閾値は、ABRで少なくとも1つの明確な波形を区別することによって視覚的に検出された。すべてのマウスは、刺激の頻度に応じて25〜70 dB SPLの間のトーンバーストに応答してABR閾値を示した。その結果、聴覚閾値が16kHz(図1)で最も低かったことが示され、他の補聴器では音響感度が有意に低下することが示唆された(図2)。地域。

全山骨は、立体解剖顕微鏡下で成体マウスの側骨から単離した(図2A)。聴覚上皮の全山は3つの部分に解剖され、その長さは測定され、最終的には心膜頂点からのパーセント距離に変換された。各コクレアターンの基底膜上の周波数位置は、前述の5,6(^...

Discussion

コクレアシナプトパシーは、2^時間31の100 dB SPLで8\u201216 kHzオクターブ帯域ノイズによって誘発された一時的閾値シフト(TTS)を有する成体マウスで最初に特徴付けられたので、研究者は、様々なシナプトパシーの効果をますます調査してきました。サルやヒトを含む哺乳類^32,33.騒音暴露に加えて、いくつかの他の条件は、他のいくつかの条件が、内膜シナプトパシー(例えば、老化、脱毒性薬物の使用、および遺伝的変異)に関連しており、超閾値オーディションの短期的な中断につながり、その後不可逆的である。聴神経の変性。菌管点侮辱の初期段階では、シナプトパシーは特定の周波数位置でしばしば起こり、特にIHCシナプスへの損傷が選択周波数領域24,31に制限される実験モデルにおいては、したがって、我々のプロトコルは、特定の周波数領域におけるシナプス形態および機能の調...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
塩酸ケタミン	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100 mg/kg
塩酸キシラジン	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-1251	10 mg/kg
TDT 生理装置	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software	Tucker-Davis Technologies, Alachua,フロリダ州、米国	聴覚生理学システムIII
電気パッド	楽しい	11072931136
デュモン鉗子 3#	Fine Science Tools、ノースバンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ	0203-3-PO
デュモン鉗子 5#	Fine Science Tools、ノースバンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ	0209-5-PO
ステレオ解剖顕微鏡	ニコン株式会社、東京、日本	SMZ1270
ヤギ血清	ZSGB-BIO、北京、中国	ZLI-9021
抗グルタミン酸受容体2、細胞外、クローン 6C4	Millipore Corp.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国	MAB397	マウス
精製マウス抗CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, USA	612044	マウス
Alexa Fluor 568 ヤギ抗マウス IgG1抗体	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21124	ヤギ
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG2a 抗体	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21131	ギ
ZSGB-BIO	を含む封入剤	ZLI-9557
共焦点蛍光顕微鏡	Leica Microsystems, Wetzlar,ドイツ	TCS SP8 II
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
プロフェッショナル診断ポケット耳鏡	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China	HS-OT10
針電極	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China	1029	20 mm, 28 G
クローズドフィールドスピーカー	Tucker-Davis Technologies、アラチュア、フロリダ州、米国	CF1