Lck:eGFP遺伝子導入ゼブラフィッシュの T リンパ球、高い GFP を表現・ T 細胞の開発と急性リンパ性白血病の研究に使用されています。この行より低いレベルでlckを表現研究 B 細胞に使用できます。このプロトコルでは、 lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞の浄化について説明します。
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方法論記事
Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、リンパ球の開発を研究する強力なモデルです。哺乳類のようなD. 形態学は、B および T リンパ球を含む適応免疫システムを所有しています。ゼブラフィッシュ リンパ球産生の研究は困難D. 学セル表面のマーカーを認識する抗体一般に利用できないため、複雑に B 系列を含む異なるリンパ球集団の分離と性状セルです。系統特異蛍光式と形質転換線は、このような課題を回避するために使用します。遺伝子組換えlck:eGFPラインD. 学T 細胞の開発、研究に使用されている、モデル T 細胞の開発と急性リンパ性白血病 (T オール) にも利用されています。Lck:eGFP魚は、T 系列の分析に広く使用されている、B 細胞を研究するために使用されてしていません。最近、低レベルとはいえ多くのゼブラフィッシュ B 細胞がまたlckを表現我々 発見。その結果、 lck:eGFP B 細胞同様に GFP の低レベルを表現します。この発見に基づき、今回lck:eGFPゼブラフィッシュから B 系細胞を浄化するためのプロトコルを開発しました。本手法は、 lck:eGFP魚や二重遺伝子組換えrag2:hMYC; などの関連行から B 細胞を浄化する蛍光活性化細胞選別機 (FACS) を利用する方法をについて説明しますlck:eGFP魚。これらの行は、B 細胞、特に未熟な B 細胞、低ですが検出可能なレベルで特急 GFP は高い GFP を発現する T 細胞と区別されるべきそれらを許可します。B 細胞は骨髄、胸腺、脾臓、血液や他の組織から分離することができます。このプロトコルは、浄化D. 学B 細胞、B 細胞、B リンパ球の悪性腫瘍のようなトピックに焦点を当てた研究を可能にする新しい方法を提供します。
概要
ゼブラフィッシュでは、遺伝的手法を用いた研究の脊椎動物の開発を促進する遺伝的操作性, 高産卵、光透光性および急速な発展などの強力な属性を提供しています。魚類と哺乳類の造血の共有の機能と共に、これらの利点によりD. 学成人期にわたって幼生の初期の外観から、リンパ球産生やリンパ球機能の in vivo 解析に最適。哺乳類と共有されている保存されている遺伝的プロセスに依存して血ゼブラフィッシュの開発と適応免疫システムにこれらを拡張します。さらに、リンパ球の開発を支配する分子メカニズムは、ゼブラフィッシュと哺乳類1間著しく保存されます。
過去 2 年間、トランスジェニックD. 学そのラベルの特定血液系統とこれらの系統の欠損突然変異系統は、2,3,4,5を作成されています。Lck:eGFP形質転換線、これらの 1 つはドライブ GFP 式6にゼブラフィッシュ リンパ球の蛋白質チロシンのキナーゼ (lck) プロモーターを使用します。T 系列の前駆体と成熟した T リン....
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プロトコル
ゼブラフィッシュを含むすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) オクラホマ大学健康科学センターによって承認されました。
1. 遺伝子組換えlck:eGFP 魚から非悪性 B および T リンパ球を分離します。
- 魚システム水で 0.02 %tricaine (MS-222) を使用して魚を麻酔します。
- ゼブラフィッシュと他の魚類14の鰓腔の背内側面に位置する蛍光 thymi の 2-6 ヶ月魚を確認します。(470/40 励起波長と 525/50 排出フィルター) GFP を検出する落射蛍光顕微鏡を使用します。
- ロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI) 含む 1% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン ・ ストレプトマイシン (並べ替えメディア) x フィルター滅菌 1 の 50 mL を事前に準備します。未使用並べ替えメディアは、2 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
- 0.2% を含むビーカーに置くことで、魚を安楽死させる氷浸漬法による Tricaine、約 5 分間続きます。弁蓋部 (ギル) の動きの停止によって死を確認します。
- ペトリ皿に euthanized の魚そして GFP+ thymi
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結果
フローサイトメトリー分析して GFPloおよび GFPこんにちは細胞胸腺、骨髄、腎臓、 lck:eGFPトランスジェニックゼブラフィッシュの脾臓から分離する FACS を使いました。1 歳 3 か月の魚の分析では、胸腺に大抵 GFP+のリンパ球が含まれているを明らかにしました。GFP+細胞主、2 部フェリー編ら17に記載されたリンパ門に限られていた。2 つの異なる GFP+集団、GFPloと GFPこんにちは胸腺で観察できます。GFPlo細胞がより少なく豊富、胸腺リンパ球 (表 1) ~ 40% を表す間、GFPこんにちはリンパは 〜 60% の高い割合を表されます。哺乳類とは異なり魚造血骨髄は、骨内ではなく、腎臓内にローカライズされます。GFP (
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ディスカッション
開発、B 系列ラベル3,4 D. 学モデルにこれを追加するlck:eGFP遺伝子導入ゼブラフィッシュから B 細胞を分離するためのプロトコルを提供しています。幾分意外にも、GFPlo B 細胞のこの行の識別は、2004 年にその説明から見過ごされている行った。一般的に、lckは T 細胞に固有の6と見なされますが、最近の研究が見つかりました予期しないlck式ナチュラル キラーによって、骨髄性細胞、B 細胞18,19に示すように同様。ゼブラフィッシュ B 細胞が GFPlo中古 B、世間知らずと成長した B の我々 の発見と一致して人間の細胞はまた、 LCK11,
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開示事項
著者は利害の衝突を宣言しません。
謝辞
私たちはゼブラフィッシュのケアのためのミーガン マローン-ペレスと OUHSC の流れの cytometry コアに感謝したいと思います。この作業は、車輪、科学の進歩と技術 (HRP-067)、NIH/日の出 INBRE パイロット プロジェクト賞 (P20 GM103447) オクラホマ センター現代希望からの補助金によって支えられました。大会では、E.L. & テルマ ゲイロードの寄附で小児血液腫瘍学の子供の病院財団が保持しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 35 &マイクロ;mメッシュ | Sefar フィルター技術 | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL ポリスチレン丸底チューブ 細胞ストレーナーキャップ付き | ファルコン コーニング ブランド | 352235 | |
| 50 mL 円錐管 | VWR 国際 | 525-0448 | |
| AZ APO 100 蛍光顕微鏡 | ニコン | ||
| Cytoflex | ベックマン・コールター | ||
| DS-Qi1MC カメラ | ニコン | ||
| エチル3-アミノ安息香酸メタンセスルホン酸;MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Σ | P4333 | |
| 乳棒 マイクロチューブ ホモジナイザー | 電子顕微鏡 科学 | 64788-20 | |
| プラスチック トランスファー pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | グティエレス他、2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
参考文献
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Jo....
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再版と許可
