腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

サマリー

頭頸部扁平上皮癌同所性同種モデルマウスを開発するための再現可能な方法をご紹介します。腫瘍免疫の浸潤、リンパ節転移、貧しい分化壊死を含む病気の臨床的病理組織学的機能について示します。担癌マウスでは、嚥下障害、顎の変位、減量など臨床的に関連する症状を起こします。

要約

頭頸部扁平上皮癌 (各種) は、再発や治療の失敗の高い有病率と衰弱や致命的な病気です。良い治療戦略を開発し、治療抵抗性に貢献する腫瘍内微小環境因子の理解が重要です。疾患のメカニズムを理解し、療法を改善する最大の障害は、人間 HNSCCs の積極的な転移の性質のようなマウスの細胞の欠如をされています。さらに、マウス モデルの大多数は高血管密度や血管豊富なリンパ系、粘膜の常在菌を含む頭頸部領域の重要な生理機能を欠いている腫瘍の皮下した絵を採用しています。本研究の目的は、開発、各種の実験モデルの特徴です。我々 は 2 つの遺伝的に異なるマウスの細胞とマウスの頬の粘膜で確立された腫瘍を採用しています。我々 は、コラゲナーゼの消化法確立された腫瘍から単一セルの最適なリカバリを最適化します。紹介データは、リンパ節に転移する腫瘍は高度に血管をマウスに開発を示しています。単一セル多重質量フローサイトメトリー解析は、すべての免疫細胞の大半を表す骨髄細胞と多様な免疫集団の存在を示しています。本研究で提案するモデルは、がん生物学、腫瘍免疫学、新規治療薬の臨床開発のアプリケーションを持っています。ひと疾患の臨床的特徴を同所性モデルの類似性は強化された翻訳と患者のアウトカムを改善のためのツールを提供します。

概要

各種は全世界で 5 番目に多い悪性腫瘍で、600,000 以上の患者と毎年診断¹。化学療法と放射線療法 (RT) を含む積極的な治療にもかかわらずヒトパピ ローマ ウイルス (HPV) 感染なし各種患者全体の生存 (OS) 率 50% 以下 5 年²後も残ります。これは主に起因する非常に複雑な腫瘍微小環境、頬粘膜、舌、口、鼻腔、口腔、咽頭の底を含む頭頸部領域内でいくつかの異なる解剖学的サイトから腫瘍が発生することも、中咽頭・下咽頭。また、頭頸部領域高度血管柄付きし、³体のすべてのリンパ節の約半分が含まれています。頭頸部腫瘍の生物学を調査し、研究の大半は、腹部の腫瘍モデルに依存します。このようなモデルは、腫瘍組み込みメカニズムに洞察力を提供できるが、ネイティブの頭頸部微小環境不足かなりそのような所見の並進の可能性に影響を与えます。口腔腫瘍を誘導するために使用されている方法の 1 つは、発がん性物質 9, 10-ジメチル-1, 2-benzanthracene (DMBA)⁴への暴露を介してです。ただし、このメソッドに関連付けられている長いプロセスは、ラットとハムスターではなくマウスで腫瘍を誘発する、結果として得られる腫瘍分化 Scc^5,6の組織学的特徴の多くを持っていません。Carcinogen4-ニトロキノリン 1-オキシド (4-NQO)、水溶性キノロン誘導体、マウス口腔腫瘍口頭で適用されたときに起因したが、また長い露出時間 (16 週) および限られたに苦しんでの導入率内およびバッチ間を取るマウス^7,8,9。臨床的に関連するモデルを開発するためには、いくつかのグループにはドライバーの癌遺伝子や癌抑制遺伝子、TP53、TGFB、KRA、HRAS、SMAD4 の¹⁰の操作を含む遺伝子組み換えモデルが利用されています。これらのモデルは既知のドライバー遺伝子を腫瘍に洞察力を提供することができますが、人間 HNSCCs の複雑な不均一性を要約するだろうではないです。

この作品では、マウスで扁平上皮癌細胞の粘膜接種を実行する実現可能性を実証します。接種した細胞は注入から 1 週間以内積極的な腫瘍に発展します。人間 HNSCCs と同様に、腫瘍はリンパ節に転移します。病気の組織学的および臨床的特徴を特徴付ける、腫瘍免疫微小環境への洞察を提供しています。各種のこの直交異方性モデルががん生物学、腫瘍免疫学と臨床研究でのアプリケーションを持っていることを提案します。免疫回避、腫瘍の進行や治療抵抗性転移のメカニズムは提案されたモデルを使用して対処することができます臨床的意義の領域を表します。

プロトコル

プロトコールに従った、承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) コロラド大学デンバー (プロトコル # 00250) の動物のすべてのプロシージャを行った。

1. 腫瘍細胞培養

注:B4B8、LY2 の細胞株は同所性同種各種腫瘍を生成に使用された: B4B8 腫瘍細胞が発がん性物質変換粘膜由来ケラチノ サイト (BALB/C マウス) から¹¹から派生しました。LY2 腫瘍細胞は自発的に変換された BALB/C ケラチノ サイト ライン (Pam 212)^12,13リンパ節転移から得られました。両方の細胞は、博士ナダラジャ Vigneswaran (UTHealth、ヒューストン、テキサス州、米国) によって提供された親切。

1. ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) F/12 10% 牛胎児血清 (FBS) および細胞ライン メンテナンスのため 1% 抗菌試薬を添加したを使用します。37 ° C、5% CO₂で無菌のインキュベーターでこれらの細胞株を維持します。セルは、15 箇所を超える前に接種に使用する必要があります。
2. 175 cm²細胞培養フラスコの 4 x 10⁶セルに 2 × 10⁶をプレートします。
   注:セルが 90% 未満を確認ストレス反応の誘導を避けるために合流。
3. インキュベーターからフラスコを削除し、洗浄セル 3 セルが 70% 合流 (~ 48 h) は、冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と x。
4. プレートの表面をカバーする十分な 0.25% トリプシンを使用してフラスコから細胞をデタッチします。
   1. これを行うには、70% コンフルエントの細胞を含む 175 cm²フラスコでトリプシンの 4 mL を分配します。37 ° C および 5% の CO₂の携帯文化のインキュベーターで 3-4 分のトリプシンで細胞を孵化させなさい。
   2. 細胞の剥離を確実に顕微鏡下で細胞を可視化します。
   3. トリプシン活性を中和するために政府短期証券を含む DMEM F/12 メディアの 12 mL を追加します。
5. 細胞懸濁液を吸引し、50 mL の円錐管に配置。
6. 3 x-4 逆さにすることでセルを格納筒を振る x。
7. 細胞懸濁液の 10 μ L の因数を混ぜて 10 μ L の微量遠心チューブにトリパン ブルーや、診断のセルをカウントできます。セルの合計数からトリパン ブルー陽性細胞数を引いてセル実行可能性を決定する、セルの合計数で割ります。
8. 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。
9. 1 x 10 の⁶セルがメディアの 50 μ L で存在するので、適切な音量での血清、抗生物質フリーの DMEM に細胞を再懸濁します。
   注:(経験的に決定) 生体内での細胞ラインの積極性に基づき、マウスあたり注射部位ごとの 1 x 10 の⁶セルは B4B8、LY2 の細胞のために適切と判断されました。
10. 氷の上細胞懸濁液を含むバイアルを配置します。
11. 氷の上事前解凍基底膜マトリックスを配置します。
    注:基底膜マトリックスは 4 ° C で一晩解凍しました。

2. 細胞注入マウス

1. 細胞: 基底膜マトリックス (各 50 μ L) の 1:1 の混合物を準備します。
2. 最初にセルを追加します。その後、徐々 にピペットの基底膜マトリックス。気泡を導入することは避けてください。混合物は動物の注入する直前に行ったことを確認します。長期間の基底膜マトリックス セルの追加は、細胞マトリックスの混合物は、混合物を厳密に振る困難の沈降で起因できます。これはマウスの腫瘍サイズでかなり変動をなります。
3. 優しく混ぜます。氷のマトリックスを含むすべての手順が実行されますを確認します。基底膜マトリックスは、常温で重合します。
4. 接種の注射器を準備します。
5. セル/地階膜マトリックス液 100 μ L で 0.5 mL インスリンは注射器 (23 G) をロードします。
6. 基底膜マトリックス重合を避けるために氷の上の注射器を保ちます。
7. イソフルランと酸素 (2.5%) 商工会議所にそれらを置くことによってマウスを麻酔します。
8. マウスが深く (つま先ピンチに反応の欠如を確保する) で注射を実行する前に麻酔を確認します。
9. 右または左頬部に針を挿入します。これは口の両側に利用できるオープン スペースによって行われます。
10. マウスの舌が方法ではないことを確認します。
    注:舌腫瘍で起因するが、舌をつつくは簡単です。必要な場合は、舌を反対側に移動します。
11. 注射器を口腔内の頬部に平行に保つために。
12. 注入、注射器を引いて、ゆっくりと 10 ° の角度で注射器を挿入する準備ができたら。
13. 期間 5 のセル/地階膜マトリックス懸濁液 100 μ L を注入 s。
14. 追加の 5 の場所に注射器を保持すべての材料を確保するための s を注入します。
    注:制御 nontumor ベアリング マウスの腫瘍細胞なし、(前述) 血清無料メディアとマトリックスの混合物を注入すること。
15. 注射器をそっと引き出します。
16. 残りのマウスで上記の手順を続行します。
17. 腫瘍は肉眼的に表示を開始するまでの 1 週間は、(50-200 mm³ B4B8、LY2 のセル)。

3. マウスを監視

1. 腫瘍細胞の注入後 1 週間でノギスを使用して最初の測定を実行します。外部のキャリパーを使用して腫瘍体積を計算するために最大の縦径 (長さ) では最大横径 (幅) を決定し、変更された楕円体式^14,15を使います。
   
2. 腫瘍体積 (1 x-2 x 毎週定期的に) の正規キャリパ測定を実行し続けます。
3. 餌に腫瘍の成長の効果を評価するために動物の体重を測定します。

4. 腫瘍の収穫

1. 実験的エンドポイントに達したとき適切な措置 (例えば、CO₂窒息、斬首刑、または頚部転位) を使用して動物を安楽死します。
   注:マウスが瀕死の状態となった場合における、エンドポイントに到達した (の減量 > 初期重量、グルーミング、悪液質の欠如の 15%) および/または腫瘍径 1,000 mm³に達した場合。
2. 首の地域で長い正中線切開を作成することによって動物を解剖を開始します。
   1. 皮膚をつかみ、皮膚を切るにはさみを鋭い鈍い鉗子を使用します。
3. 腫瘍を覆っている皮膚の下で軽くはさみを挿入し、皮膚にはさみを押すことによって空気のポケットを作成します。
4. 皮膚が十分に腫瘍から戸建、ドレイン リンパ節 (DLNs) を識別し、腫瘍リンパ節の存在によって混同を避けるためにそれらを切除します。
   注:大きな腫瘍が達するか、DLN をカバーします。実行される分析の種類によってそのままリンパ節の分離はアッセイ結果が歪曲になります腫瘍への免疫細胞の流出を避けるために不可欠です。
5. ボリューム全体を取り外すまで腫瘍の境界をカットします。

5. 腫瘍下流のアプリケーションの処理

1. 下流組織検査室温で 10% ホルマリンで腫瘍を配置します。Overfixation を避けるためには、70% エタノール、ホルマリンを交換してください。流れフローサイトメトリー解析のため下記のとおり腫瘍を処理します。
   注:組織は、overfixation することができます染色の特定の種類の問題になる前に 72 h のホルマリンで保存できます。
2. 1-2 mm に腫瘍をカット-サイズの作品を剃刀や鋭いはさみを使用します。
3. コラゲナーゼ III と 50 mL のコニカル チューブのカットの腫瘍部分を配置 (1 サンプルあたり 4,250 台)、DNase 私 (サンプルあたり 0.1 mg)、トリプシン ・ インヒビター (サンプルあたり 1 mg)。
4. 揺れ 10 分ごとに 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。
   注:サンプルは、ジッパーのついた袋、90% エタノールで殺菌し、携帯文化のインキュベーターで配置で配置できます。
5. 30 分後、ハンクの 20 mL 平衡塩溶液 (HBSS) と 300 x gで 5 分でスピンを追加します。
   注:HBSS は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ナトリウム リン酸水素、ナトリウムりん酸一、ブドウ糖で構成されます。
6. 上澄みを廃棄し、赤血球 (RBC) 換散バッファーの 2-3 mL にペレットを再懸濁します。厳密のピペットします。
   注:RBC の換散バッファーは、塩化アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、ナトリウムで構成されます。
7. 常温で 2 分間インキュベートします。
   注:長い潜伏は他の細胞への毒性することができます。
8. 換散バッファーの効果を中和するために HBSS の 20 mL を追加します。
9. 300 x gで 5 分で遠心し、上清を捨てます。
10. HBSS の 10 mL にペレットを再懸濁します。
11. 70 μ m ナイロン落を通じて解決策を渡すし、300 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。
12. 5.8-5.10 の手順を繰り返し、任意の追加の残骸が懸濁液から取除かれるように 40 μ m ナイロン落を細胞懸濁液を渡します。

6. 細胞染色およびデータ集録

1. HBSS の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
2. 1.7 の手順で説明するように診断または自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
3. 総細胞数と汚損のため適切な濃度を決定します。
   注:流れの cytometry の汚損のための理想的な細胞濃度は 100 万の細胞。たとえば、96 ウェル プレートで染色が実行され、1000 万セルがある場合は、ウェルあたり 100 万の細胞の 1 つの mL とプレート 100 μ L のサンプルを再懸濁します。
4. FcγIII と FcγII 受容体の免疫グロブリンの nonantigen 的結合を防止するためには、1: 100 の濃度で Fc ブロック (CD16/CD32) を追加します。室温で 5 分間インキュベートします。

結果

LY2 と B4B8 の細胞増殖の in vitro における評価の結果、両方の細胞があると同様の 2 倍時間 (21 h と 23 h、それぞれ)。生体内で、両方の細胞 (図 1 a) 接種後 1 週間以内 1 つ、明白な質量を形成しました。LY2 腫瘍を有するマウスの顎は腫瘍の負担 (図 1 a) のための 3 週間によって転置されました。コントロール マウスの腫瘍細胞を受信しませんでしたが予想通りの腫瘍を開発していません。LY2 腫瘍は B4B8 腫瘍と比較して高率で成長しました。担癌マウスは 632 ± 10 mm³ 162 ± 4 mm³ B4B8 腫瘍 (図 1 b) と比較して LY2 で 21 日に平均腫瘍体積。マウス顎変位を急速に出展は、摂食・嚥下 (図 1) による減量を開...

ディスカッション

腫瘍微小環境の特性を厳密な解析から腫瘍の進行・転移のメカニズムの理解と効果的な治療法の開発のための重要な戦略を表しています。頭頸部がんは頭頸部領域内の複数の解剖学的サイトから発信することができます複雑な病気です。疾患のメカニズムを理解し、療法を改善する最大の障害は、人間 HNSCCs の積極的な転移の性質のようなマウスのマウス細胞の不足をしています。さらに、多数のマウスモデルは皮下移植腫瘍血管密度が高く、広範なリンパ血管と粘膜の常在菌を含む頭頸部領域の重要な生理学的機能が無いを採用しています。

本研究では、マウスの各種の実験モデルを特徴とします。我々 はいくつかの理由、画像誘導、ノギス、粘膜の植物内での腫瘍の存在を使用して腫瘍の成長を評価する能力を必要とせず地域へ簡単にアクセスを含む腫瘍接種のサイトとして頬粘膜を選んだ、周囲のリンパ管の存在と再現性の容易さ。頬粘膜細胞の注入は簡単ですが、針と浸透深さの位置決め、皮膚から穿刺を防止し、細胞が皮下に注射していないことを確認重要です。頬の領域に完全に平行ですが、口腔内で針を挿入し、注入する準備ができたら、10 ° 以上の角度で傾斜をお勧め...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラゲナーゼIII	:ワージントンバイオケミカルコーポレーション
DNase I	ワージントン バイオケミカル
FC Block (CD16/32)	BD Biosciences	553141	クローン2.4G2
フローサイトメトリー染色バッファー	eBioscience	00-4222-26
HBSS	ThermoFisher Scientific	14175079	カルシウム、マグネシウム、フェノなし
赤 Helois マスサイトメーター	Fluidigm	NA
マトリゲル膜マトリックス	コーニング	CB-40234B
MRIスキャナー	Bruker	NA	7.4 Tesla
RBC 溶解バッファー	BioLegend	420301
トリプシン阻害剤	Worthington Biochemical Corp.

LS004183LS006328LS002830