Method Article

マウスにおける脳幹誘発応答オーディオメトリーにおけるデータ獲得と分析

DOI:

10.3791/59200

⸱

May 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

In This Article

Summary

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脳幹誘発応答オーディオメトリーは、臨床神経生理学における重要なツールである。今日では、脳幹誘発応答オーディオメトリーは、薬理学的および遺伝的動物モデルの両方を含む基礎科学および前臨床試験にも適用される。ここでは、聴覚脳幹応答をマウスで正常に記録および分析する方法の詳細な説明を提供します。

Abstract

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脳幹誘発応答オーディオメトリー(BERA)は、臨床神経生理学における中心的な関連性である。視覚的に誘発された電位(VEP)や身体感覚誘発電位(EP)などの他の誘発電位(EP)技術として、聴覚誘発電位(AEP)は、同一刺激の繰り返し提示によって引き起こされる。その後平均化された脳波(EEG)応答は、明確な正(p)および負(n)の偏向をもたらす。ヒトでは、個々のピークの振幅と遅延の両方を使用して、基礎となる神経回路の同期および伝導速度の変化を特徴付けることができます。重要なことに、AEPは、薬理学的および遺伝的動物モデルにおける聴覚機能を同定し、特徴付けるために、基礎科学および前臨床科学にも適用される。さらに、薬理学的検査と組み合わせた動物モデルは、感音難聴(例えば、年齢または騒音誘発性難聴)の治療における潜在的な利益を調査するために利用される。ここでは、クリックとトーンバーストアプリケーションを使用してマウスの聴覚脳幹誘発応答(AVAR)を記録する方法の詳細かつ統合的な説明を提供します。このプロトコルの具体的な焦点は、実験前の動物ハウジング、麻酔、ABR記録、ABRフィルタリングプロセス、自動ウェーブレットベースの振幅成長関数解析、および遅延検出です。

Introduction

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脳生理学の中心的な側面は、学習、記憶、感情的反応、または運動反応などの異なる固有または外因性の出力をもたらす環境情報を処理する能力です。様々な実験的および診断的アプローチを使用して、刺激関連ニューロン回路内の個々のニューロン細胞型またはクラスター/アンサンブルの電気生理学的応答性を特徴付けることができます。これらの電気生理学的手法は、マイクロ、メソ、マクロスケール1の異なる時空間寸法をカバーしています。マイクロスケールレベルには、培養または急性解離ニューロン1を使用して、異なるパッチクランプモードでの電圧および電流クランプアプローチが含まれます。これらのインビトロ技術は、個々の現在のエンティティとその薬理学的変調2、3の特徴付けを可能にする。しかし、本質的な欠点は、マイクロおよびマクロ回路の情報統合と処理に関する全身情報の欠如です。この障害は、培養ニューロンだけでなく急性脳スライス4においても同時に細胞外多電極記録を可能にする多電極アレイなどのメソスケールのインビトロ技術によって部分的に克服される。5.マイクロ回路は、特定の程度(例えば海馬)に脳のスライスで保存することができるのに対し、長距離相互接続は通常6を失う。最終的に、神経回路内の機能的相互接続を研究するために、マクロスケール上の生体内電気生理学的手法における全身的な選択7である。これらのアプローチには、とりわけ、ヒトおよび動物モデル1の両方で行われる表面(硬膜外)および深部(脳内)脳波記録が含まれる。脳波シグナルは、興奮性入力8の一般的な優位性にもかかわらず、主に阻害または興奮することができる異なる皮質層のピラミッド状ニューロン上の同期シナプス入力に主に基づいています。同期時に、細胞外電界における興奮ポストシナプス電位ベースのシフトを合計して、表面電極を用いて頭皮に記録するのに十分な強度の信号を形成する。特に、個々の電極からの検出可能な頭皮記録は、1万個のピラミッド型ニューロンの活動と、アンプ、フィルタリングプロセス(ローパスフィルタ、およびフィルタリングプロセスを含む技術的なデバイスと処理ツールの複雑な武装装置の活動を必要とします。ハイパスフィルター、ノッチフィルタ)、および特定の導体特性を有する電極。

ほとんどの実験動物種(すなわち、マウスおよびラット)では、ヒトベースの頭皮EEGアプローチは技術的には適用できない。 10、11.げっ歯類では、表面(頭皮)電極または皮下電極は、このように心電図によってひどく汚染され、主に高品質の脳波記録を不可能にする筋電図アーティファクト9、11、12.自由に動くマウスとラットを無気力に使用する場合、硬膜外電極を介して皮質から直接記録するか、または深い脳内構造から直接記録し、感知先端の直接的な物理的接続を確保することが必須である。シグナル発生神経細胞クラスターへの鉛/埋め込み電極の。これらのEEGアプローチは、拘束されたテザリングシステムのセットアップまたは非拘束型埋め込み型EEG無線テレメトリアプローチ9、10、11のいずれかを使用して行うことができます。どちらのテクニックも長所と短所があり、発作感受性/発作活性、概日リズム、睡眠アーキテクチャ、振動活動、および同期の質的および定量的特性評価において貴重なアプローチとなり得る。時間周波数分析、ソース分析など9、10、13、14、15、16、17を含む。

テザリングシステムと無線テレメトリは、それぞれ拘束/半拘束または非拘束条件下での脳波記録を可能にしますが、関連する実験条件はABR録音の要件と一致しません。後者は、拡声器と実験動物の定義された位置と制御された音圧レベル(SPL)で時間をかけて繰り返し提示される定義された音響刺激に対する要求。これは、拘束条件下での頭部固定または麻酔18、19に続くことによって達成することができる。実験ストレスを軽減するために、動物は通常ABR実験中に麻酔されるが、麻酔はABR19、20を妨げる可能性があると考えられるべきである。

一般的な特徴として、脳波は50〜100μVの電圧範囲で異なる周波数を構築し、背景周波数と振幅は実験動物の生理的状態に大きく依存します。覚醒状態では、振幅が低いβ(β)およびγ(γ)周波数が優勢である。動物が眠くなったり眠くなったりすると、α(α)、θ(θ)、デルタ(δ)周波数が発生し、EEG振幅21の増加を示す。感覚チャネル(例えば、音響経路)が刺激されると、情報伝搬は末梢および中枢神経系を介して神経活動を介して媒介される。このような感覚(例えば、音響)刺激は、いわゆるEPまたは誘発応答を引き起こす。特に、イベント関連のポテンシャル(ERP)は、EEG(つまり、数マイクロボルトのみ)よりも振幅がはるかに低くなります。したがって、単一の刺激に基づく個々のERPは、より高い振幅EEGの背景に対して失われます。したがって、ERPの記録は、同一の刺激(例えば、ABR記録のクリック)の繰り返し適用と、その後の平均化を必要とし、EEGバックグラウンドアクティビティおよびアーティファクトを排除する。ABR記録が麻酔動物で行われる場合、ここで皮下電極を使用することは容易である。

主に、AEP には、通常は AR または BERA に関連する短遅延 PS、さらに中間待機時間の PS (中間待機応答 [MLR]) や長時間の EP22などの後続の可能性が含まれます。重要なことは、聴覚情報の情報処理における妨害は、しばしば神経精神疾患(脱筋疾患、統合失調症等)の中心的な特徴であり、AEP改変に関連する23,24 、25.行動調査は機能障害を明らかにすることができるのに対し、AEP研究は、特定の神経解剖学的構造に関連する聴覚機能障害の正確な時空間分析を可能にする26。

ABRは、早期、短遅延の音響的に、通常、中程度から高い強烈なクリックアプリケーションで検出され、最大7つのABRピーク(WI-WVII)が発生する可能性があります。最も重要な波(W I-WV)は、次の神経解剖学的構造に関連している:WIは聴神経(遠位部、内耳内)に関係する。WIIに人工内核(聴覚神経の近位部分、脳幹終端);優れたオリバリー複合体(SOC)にW III;WIVから横レムニスカス (LL);WVは、反対側27上の劣ったコリキュラス(IC)内の側レムニスカス(LL)の終了に対する(補足図1)。なお、WII-WVは、それらに寄与する上昇聴覚経路の複数の解剖学的構造を持つ可能性が高い。特に、聴覚管のピークと基礎構造の正確な相関関係は、まだ完全には明らかになっていない。

聴覚では、ABEはスクリーニングおよび診断ツールおよび外科監視28、29のために使用することができる。難痛、高paccusis、およびアナクシス(例えば、加齢性難聴、難聴性難聴、代謝および先天性難聴、変形による非対称難聴および難聴)の同定のために最も重要である。奇形、怪我、新生物)28.ABEは、多動性、知的障害児、または従来のオーディオメトリー(例えば、ADHD、MS、自閉症などの神経・精神疾患の場合など)に応答できない他の小児のスクリーニングテストとしても関連しています29,30)と人工内耳28の開発と外科的フィッティングで.最後に、ARSは、抗てんかん薬31、32などの神経精神薬の潜在的なイト毒性副作用に関する貴重な洞察を提供することができる。

薬理学的またはトランスジェニックマウスモデルからヒトへの神経生理学的知識の翻訳の価値は、特にマウスおよびラット33の聴覚パラダイムにおけるERPのレベルにおいて、多くの設定で実証されている。 34、35。マウスおよびラットにおける聴覚情報処理の変化と関連するAEPに関する新しい洞察は、このようにヒトに翻訳することができ、聴覚、神経学的、および聴覚の特性とエンドフェノタイピングにおいて中心的に重要である。将来の神経精神疾患。ここでは、基本的な科学的、毒物学的、薬理学的な目的のために、ABEをマウスで正常に記録および分析する方法の詳細な説明を提供します。

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Protocol

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すべての動物の手順は、動物ケアに関するドイツ評議会のガイドラインに従って行われ、すべてのプロトコルは、動物のケアに関する地元の機関および国家委員会によって承認されました(ランデサムト・フュル・ナチュラル、ウムウェルト、ウンド・ヴェルブラウチャーシュツ、州ノースライン・ウェストファリア自然・環境・消費者省[LANUV NRW,ドイツ]のオフィス。著者らは、すべての動物実験が1996年に改正された実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所の健康ガイド(NIH出版物第80-23号)または英国の動物(科学的手順)法に従って行われたことをさらに証明します。1986および関連するガイドライン、または1986年11月24日(86/609/EEC)および2010年9月22日(2010/63/EU)の欧州共同体理事会指令。使用される動物の数とその苦しみを最小限に抑えるために具体的な努力がなされた(3R[置換、削減、および改良]戦略)。

1. 実験動物

  1. 実験動物と種の選択
    1. 特定のヒト疾患に関連する相同性、同位態、および予測可能性の要件を満たすげっ歯類/げっ歯類モデル(マウスまたはラット)でABR研究を行う。これは、翻訳神経科学の基本的な側面の面で特に重要です。
      注:利用可能なその他のマウスおよびラット株は、基本的な生理学的および病的特徴36、37、38の違いを示すことができることを考慮してください。これらのマウス/ラットライン関連の特異性は、実験計画で考慮する必要があります。
    2. 電気生理学的実験に影響を与える可能性のある生理学および薬理学におけるマウスおよびラット株特異的変化(例えば、麻酔性感作、概日リズム、[聴覚的]発作感受性、年齢、と遺伝的背景)39,40,41,42.
    3. スタディデザインに性別固有の階層を含めます。エスロスサイクルは、麻酔感受性、中心リズム、概日依存性、および発作活動(聴覚発作)および感覚(聴覚)情報処理43,44に深刻な影響を及ぼす可能性があることを覚えておいてください。,45.したがって、性別に固有の分析を行う。
      注:財政的および実験的能力が限られている場合は雄マウスに限定するが、通常サイクリング女性からの様々な神経生理学的パラメータは、雄46と比較して増加した変動性を示していないようだ。
  2. 動物ハウジングと取り扱い
    1. 動物施設内の個別に換気されたケージにマウスまたはラットを収容する。
    2. 実験動物を動物施設から、麻酔、ABR電極配置、ABR記録用の特別なラボルームにある換気キャビネットに移動します。
    3. 動物が標準的な環境条件の下で換気されたキャビネットに収容されていることを確認してください(すなわち、温度が21±2 °C、相対湿度50%、および従来の12/12 h光/暗いサイクル)。動物が順応し、その後の実験の少なくとも14日間、この概日パターンに適応できるようにします。
    4. 3-4のグループのハウジングマウスには透明ポリカーボネートケージタイプII(26.7 cm x 20.7 cmx 14.0 cm、面積410cm 2)を使用し、透明なポリカーボネートケージタイプIII(42.5 cm x 26.6 cm x 18.5 cm、800cm2の面積)を使用します。飲料水と標準的な食品ペレットへのアドリビタムアクセスを提供します。
    5. 分離は実験結果に影響を与える重度のストレスを及ぼす可能性があるとして、ABR記録の前後に実験動物の分離/分離を避けてください。したがって、麻酔、ABR電極の配置、およびABR記録に従って、動物を自宅のケージに戻します。
    6. 彼らは、特に聴覚研究で、様々な実験的な欠点の対象となるために、オープンハウジング条件を適用しないでください。換気キャビネットは、代わりに、感音難聴(例えば、騒音性難聴)につながる可能性のある実験的聴覚手順の前および間の音響ストレスから保護し、結果に影響を与えます。
    7. マウスとラット特有の衛生、麻酔、および技術機器を利用して、マウスとラットが互いの存在を感知できないようにして、ライバル種の相互感覚知覚が回避可能な交絡因子を生み出す可能性がある。

2. マウス麻酔

  1. 注射麻酔薬を用いて麻酔を行う。塩酸ケタミン(げっ歯類投与量:100mg/kg)と塩酸キシラジン(げっ歯類投与量:10mg/kg)の組み合わせを0.9%NaClまたはリンガー溶液で調味し、体重に基づいて動物を経頭に注入する。
    注:イソフランによる吸入ナルコシスは、ABR手順は通常、音減衰キュービクルとファラデーケージを必要とし、記録設定内の空間的な制限をもたらすので、お勧めしません。多くの麻酔薬はNMDAシステムに作用し、明らかにABR記録の結果に影響を与えますが、ABR記録における非麻酔抑制アプローチは、意識下での拘束手順が動物に劇的なストレスを引き起こすので推奨されません。ARSにおける重度の後続のアーティファクト形成。
  2. 尾のピンチ、足のピンチ、および呼吸数の監視を行うことによって、麻酔の深さのために慎重に動物を観察してください(マウス:150-220呼吸/分)。可能なガス抜きを確認し、必要に応じて対策を行います。
    注:異なるマウスラインまたは薬理学的マウスモデルは、麻酔に対して異なる感度を示すことができます。変異型マウス モデルについても同じことが当てはまります。気管内挿管は、この実験的な設定では必須ではなく、お勧めしません。挿管は気管および感染への外傷のリスクを増加させるので、ABRのプロシージャの間に気管内挿管の利点/危険は否定的である。

3. 異端の配置と計装の一般的な側面

  1. 動物の体のコア温度を維持するために、家庭的な加熱毛布を使用してABR記録中および後に補足的な暖かさを適用します。後者を 36.5~38.0 °C (98.6~ 100.4 °F) に保ちます。
    注:低体温症は、体積に対する体表面の比率が高いため、小さなげっ歯類の危険因子です(マウス本体表面= 10.5 x (gの重量)2/3; ラットの体表面 = 10.5 x (gの重量)2/3)体積に対する危険性があります。
  2. 角膜乾燥を避けるために、ABR記録プロセス全体の間に石油ベースの人工涙液のointmentまたは5%のdexpanthenolで動物の目を覆います。点滅する反射が完全に回復するまで、この手順を続行します。
  3. オートクレーブまたは消毒剤を使用して実験機器(材料の表を参照)を殺菌します。
    注:ガラスビーズが付いている熱ベースの外科器械の殺菌器の使用は推薦される。
  4. 正確なABR電極の配置のために、柔軟なまたは自立的な可動式ライトガイドを介して強烈な照明のための冷たい光源を持つ双眼外科拡大顕微鏡を使用する。
  5. 実験動物の取り扱いや実験中は、清潔なラボコート、フェイスマスク、ヘッドカバー、無菌手袋を使用してください。
    注: 最適な機器と備品はラボによって異なる場合があり、ラボ固有の標準と機関の基準を満たす必要があります。

4. ABR録画

注:ここで説明するプロトコルは、モノラルおよびバイノーラル録音用の市販のABRシステムに基づいています。重要なのは、対処する科学的な質問は、使用されるABRシステムの技術仕様を満たす必要があります。バイノーラル記録のABR分析は、例えば、聴覚経路における聴覚刺激の横コードを調査し、神経精神疾患における末梢横非対称性を研究するために使用することができる。

  1. プリアンプに接続されたマイクと処理システム(材料の表を参照)を正しい位置にある音減衰キュービクルの中に置くことによって、録音の各日に刺激周波数のキャリブレーションを実行します。実験的なマウスの耳が配置される方向。
    1. キャリブレーションの少なくとも5分前にマイクに接続されているプリアンプをオンにして、システムの平衡化を可能にします。
    2. オシロスコープの電源を入れます。
    3. プリアンプに接続されたマイクを音減衰キュービクルの中に置き、実験的なマウスの耳を模倣します。
    4. 市販の処理および取得ソフトウェアを開きます (資料表を参照)。
    5. ソフトウェア内のキャリブレーションCal200Kファイルを選択して、キャリブレーション構成モードを有効にし、実験条件に従ってパラメータを選択します。
    6. プロセッサー・システムを使用して、キャリブレーション・プロシージャーを実行します。SPL制限、周波数範囲、および分布の観点から、マイクとスピーカーの技術仕様が調和していることを確認します。
    7. 定義済みのクリック刺激プロトコルを選択して開始します。
    8. シングルクリックSPL(好ましくは最大SPL)を実行して、オシロスコープのオンラインファストフーリエ変換(FFT)によって解析された音刺激のスペクトルが要件(実質的なエネルギー範囲)に一致することを確認します。
    9. あらかじめ定義されたトーンバースト刺激プロトコルを対象範囲(例えば、1~42 kHz)で選択して開始します。
    10. オシロスコープとオンラインFFTを用いて、記録された音響試験刺激の周波数スペクトルを確認する。
      注:刺激周波数とSPLが許容範囲内であることを保証するために、システムと刺激周波数の毎日のキャリブレーションが必要です。
  2. 麻酔マウスを音響発泡体で裏打ちされた音減衰キュービクルの中に入します。
    注:キュービクル全体は、外部の電気的干渉からABR記録を保護し、ノイズから保護するために、ファラデーケージ(カスタムメイドのメッシュメタルまたは商用のもの)で覆われるべきです。
  3. モノラル脳幹誘発聴覚電位の記録については、頂点に皮下ステンレス鋼電極を挿入し、ピナの軸(正の[+]電極)と右または左のピナの心室(負の[-]電極)に応じて測定する耳。バイノーラル記録の場合は、負極を左右のピネーに配置します。動物の股関節に地面電極を配置します(補足図1)。
    1. 挿入の前に、電極の皮下固定が保証されるようにステンレス鋼電極の先端にフック形状を形成する47。
  4. 各記録の前にすべての電極のインピーダンス測定を実行し、適切な電極の位置/導電性を確認します。4チャンネルヘッドステージのインピーダンスチェックボタンを使用して、各電極インピーダンスレベルを確認します。
    注: インピーダンスは 5 kΩ 未満にする必要があります。
  5. 単一のスピーカー(周波数帯域幅、例えば、1-65 kHz)を使用して自由フィールド条件下でA整を記録し、動物のロストラム(マウスの中間軸に垂直なスピーカーのリーディングエッジ)の反対側に10cm配置します。キャリブレーション中にスピーカーとマイクの間の選択した特定の距離に応じて、マウスヘッド/マウスの耳の位置がキャリブレーションマイクの位置であることを確認します。
    注:フリーフィールドの条件の代わりに、耳のチューブも使用することができます。ただし、これらの設定で SPL を決定するには、特別な予防措置とテストが必要です。
  6. 自己プログラムまたは市販のソフトウェアを使用して、クリックとトーンバーストの刺激プロトコルをプログラムします(材料の表を参照)。以下に示す個々の刺激パラメータは、関連するグラフィカルユーザーインターフェイスに追加する必要があります。
    1. クリック刺激エンティティの構成から始めます(すなわち、100 μsの持続時間刺激と交互の極性[結露と希釈の切り替え]と定義された実質的なエネルギー)。この刺激エンティティを使用して、クリックしきい値、左右耳の ABR 対称性、ABR W (I - IV) 振幅、および W (I - IV) のレイテンシを後で分析および決定します。
    2. ソフトウェアを起動し、構成ウィンドウを使用してクリック刺激パラメータを追加します。[実行]をクリックしてプロトコルを実行します。
    3. ハンエンベロープの上昇と下降時間をそれぞれ1.5ミリ秒(ゲート/ランプ時間持続時間)と交互に極性の4.5ミリ秒のトーンバースト(一時的な正弦波パルス)である第2の刺激エンティティの構成を続けます。特に低周波トーンバーストの場合は、最低トーンバースト時間が 3 ミリ秒と考えられます。この刺激を使用して、すべてのジェノタイプの周波数特異的聴覚閾値を分析および識別します。
    4. 手順 4.6.2 と同様に、コンフィギュレーション ウィンドウを使用してトーンバースト刺激パラメータを追加し、[実行] をクリックしてプロトコルを実行します (製造元48が述べたように)。
    5. トーンバーストスタディの場合、科学的な質問に応じてテストされる適切な周波数範囲をプログラムします(例えば、6kHzステップで1〜42 kHzから)。適用される周波数範囲がスピーカーの技術能力を満たしていることを確認します(この場合、フリーフィールドまたはクローズドフィールドの条件で周波数帯域幅が 1 ~ 65 kHz のマルチフィールド磁気スピーカー)。
    6. 平均化の場合、シーケンシャル音響刺激(クリックまたはトーンバースト)の数を、例えば20Hzのレートで300倍に設定します。
    7. クリック時の 5 dB ステップとトーン バーストの 10 dB ステップの SPL を 0 dB から 90 dB まで増やします(SPL モードを増やします)。
      注: SPL モードの増加と減少の両方について説明しています。SPLステップサイズは、科学的な質問のために適応される場合があります。
  7. 個々の音響刺激発症前の5ミリ秒のベースライン期間(ABRベースライン前)から始まり、10ミリ秒のABRセクションを別の10ミリ秒ベースライン(ポストABRベースライン)で超える25ミリ秒のABRデータ取得期間を決定する(補足図1)).
  8. 6極バターワースフィルタを使用して、ABRデータ集録(例えば、24.4 kHz)とバンドパスフィルタ(ハイパス:300Hz、ローパス:5kHz)に適切なサンプリングレートを適用します。必要に応じてノッチフィルタを有効にします。
    注:サンプリングレートとフィルタ特性は、実験的要件のために適応される場合があります。
  9. 皮下電極から記録された生体電気信号をヘッドステージに移し、さらに適切な増幅(例えば20倍)を有するプリアンプに進みます。
  10. 特定の ABR システム処理ソフトウェアを使用して、スピーカー制御と ABR の取得、処理、平均化、およびデータ管理を調整します。
  11. ABR プロトコル全体(クリックおよびトーンバースト呼び出しされた聴覚しきい値、ピーク振幅、ピークレイテンシ分析など)を約 45 分以内に実行してみてください。これは、100/10mgケタミン/キシラジンを経過膜に使用する深いナルコシスの時間に対応する。
  12. 動物を麻酔し、実際の記録を実行する前に、刺激のプレゼンテーションと取得、フィルタ設定などのキャリブレーション、プログラミング/調整が期待どおりに動作していることを確認します。

5. ABR分析

  1. クリックとトーンバースト呼び起こされた ABR ヒアリングしきい値分析
    1. 目視検査/推定49、50、51、52 による ABR しきい値決定における潜在的な不整合を回避するために、以前のパブリケーションに基づいて自動しきい値検出を実行します。
    2. 信号対雑音比 (SNR) を計算する 3 つの異なるタイム ウィンドウ (TW) を定義します:TW1 (0 ~ 5 ミリ秒)、TW2 (5 ~ 15 ミリ秒)、および TW3 (15 ~ 25 ミリ秒) (補足図1)。
    3. AEPが観測されない2つの異なるTW(TW1およびTW3)内のベースラインのノイズ標準偏差を計算します。この計算は、自己プログラムされたソフトウェアを使用して行うことができます。
    4. TW1および TW3のプールされたデータの平均と標準偏差の両方を設定する ABR レコード内の各 SPL 測定値を計算します。
    5. 対応する計算平均ですべての記録サンプルを個別にリセットして、DC オフセットを削除します。
    6. 聴覚しきい値決定の場合は、ABR 応答時間枠 (TW2)の少なくとも 1 つの波振幅値 (W I-WIV)が以前に計算された標準偏差の 4 倍を超えた最小 SPL (dB) を特定します。
      注: 最大 SPL でのクリックおよび周波数しきい値解析で ABR 波が検出されなかった場合、公称しきい値レベル 100dB が耳に割り当てられます。
  2. ABR波振幅と波遅延解析
    1. メキシコのハットウェーブレットを使用してウェーブレットベースのアプローチを行い、連続ウェーブレット変換(CWT)ベースのデフォルトウェーブレットを使用して、正(p)波(ピーク)と負(n)波(ピット)の時間順連動を決定します。パターンマッチングアルゴリズム52(補足図1)。
      1. 数学的には、CWT は次の53のように表されます。
        figure-protocol-1
        ここで、s(t)は信号であり、aは尺度であり、bは翻訳であり、(t)は母波ブレレットであり、b(t)はスケーリングおよび翻訳されたウェーブレットであり、Cは2D行列である。ウェーブレット係数。
    2. 最初は、各 ABR ランの 55 dB 測定を使用して、CWT に渡される各波の最適なスケール パラメータを識別し、その結果、すべての n 波に対して 0.5~4、すべての p 波に対して 0.5~6、WIVの 0.5~12 の 3 つのクラスが発生します。サンプル内の波。
      注:55 dB SPLは、波が一般的にここで最も顕著であり、確実に検出することができるとして選択されました。
    3. すべてのクラスを証明して、55 dB の測定値すべて内で W I-WIVの正しい時間的同一位置を確実に検出します。
    4. 55 dB測定内の正確な時間的順序でABR W I-WIVを決定するために、pピークとnピーク(ピット)は、以前に識別されたピークの相対的な位置を使用して固定シーケンスで識別され、その後のスキャン。
    5. 9 つのピークがすべて 55 dB で識別されたら、ピーク 1 ~ 9 の識別が繰り返される前に、隣接する音圧測定 (50 dB および 60 dB) の時間検索フレームの開始点として関連値を使用します。
    6. この方法で、可能であれば、すべての dB レベル (55-0 dB および 60-90 dB) の p-ピークと n ピークを決定します。p-ピークとnピークがウェーブレット解析によって識別されなくなったら、その時間的配置は、前のdBレベルで識別された他のピークにピークの時間的オフセットを計算することによって設定されます。
    7. テンポラル オフセットを現在のデシベル レベル内の他の p-ピークと n ピークに適用すると、平均が最も近い近似値と見なされる未定義ピークの最大 8 つの決定された時間位置になります。
    8. すべての波の振幅成長関数とレイテンシー比較(W I-WIV)を評価するために、関連するnピークの時間枠内の各pピークの最大振幅と平均待ち時間を特徴付ける。
    9. その後、自己プログラムされた自動ウェーブレットツールに基づいてすべての結果を視覚的にチェックし、必要に応じて、厳密な包含/品質基準を満たしていない場合は、統計から個々のABR実行を除外します。
      注: Aバーの自動分析と目視検査の両方で、二重盲検アプローチをお勧めします。

6. 術後ケアとABR後治療

  1. 彼らは意識を取り戻し、厳しい回復を維持することができるまで、継続的に動物を監視します。
  2. 完全に回復するまで、ABR記録を受けた動物を他の動物の会社に返却しないでください。
  3. 術後疼痛治療のためにカルプロフェン(マウス:1x 5-10 mg/kg、皮下;ラット:1x 2.5-5.0 mg/kg、皮下)を注入する。
    注:ABR記録電極が皮下に挿入されるので、長期的な疼痛治療は必要ありません。
  4. 術後は、食物摂取を容易にするために湿ったペレットを供給する。食品(体重/日の約15g/100g、約5g/24h)と水(体重/日の約15mL/100g、約5mL/24h)の消費量を注意深く観察してください。
  5. 彼らの通常の姿勢や行動の復帰のために密接に動物を監視します。
    注:エンロフロキサシンやトリメトプリム-スルホンアミドなどの抗生物質の全身投与は、皮下電極の配置が最小限の侵襲性に過ぎないため、ここでは推奨されません。局所的または一般的な炎症の兆候が生じない限り、抗生物質の適用は制限されるべきである。
  6. 動物の体重を制御することにより、ABR記録後のフォローアップ後の実験的な回復。

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Results

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クリックとトーンバースト呼び出しされた ABR 記録を使用して、聴覚しきい値の差、振幅の増加機能、および遅延比較を評価できます。SPL 増加モードでのクリック呼び起こし APL は、コントロールの図 1と、Ca v 3.2 T 型電圧ゲート Ca2+チャネル (Cav3.2+/-およびCa) に欠けている 2 つの例示的な変異マウスラインに示されています。v3.2 ヌル変異体 [Cav3.2-/-])上で概説したように、性別特異的な調査は、一般的に、ヒト54、55およびマウス56、57における聴覚パラメータの性特異的な相違のために...

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Discussion

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このプロトコルは、マウスにおける聴覚誘発脳幹応答を記録する方法の詳細かつ統合的な説明を提供する。これは、動物の前処理、麻酔、および潜在的な方法論的交絡因子に特に焦点を当てます。後者には、とりわけ、性別、マウスライン、年齢、および住宅条件が含まれます。これらの要因はすべて、感音難聴および聴覚情報処理の基本的な側面に影響を与える可能性があることに留意すべきである。したがって、聴覚プロファイリング研究の適切な階層化が必須である。

AEP録音のインストルメンテーションは、過去50~60年で飛躍的に進化し、今日では、技術の適用を強化し、簡素化した商用ABR記録システムが利用可能ですが、新たな落とし穴も導入しています。これらの側面のいくつかについてここで説明します。まず、ユーザーはABRシステム、すなわち、デスクトップまたはラップトップコンピュータ、プリアンプ、アンプ、電極入力ボックス、および潜在的なトランスデューサ(例えば、スピーカー、インサートイヤホン、supra-aural)で構成されるインストルメンテーションに慣れる必要があります。ヘッドフォン、および骨発振器)。特に、記録条件は中心的...

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Disclosures

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著者は何も開示していない。

Acknowledgements

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著者らは、クリスティーナ・コルブ博士(ドイツ神経変性疾患センター[DZNE])とロバート・スターク博士(DZNE)の動物飼育と動物の健康管理に対する支援に感謝したいと思います。この研究は、連邦薬物医療機器研究所(ブンデスチンスティトゥート・フュル・アルツネイミッテル・ウンド・メディジンプロドゥクテ、BfArM、ボン、ドイツ)によって財政的に支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RZ6用AEP/OAEソフトウェア(BioSigRZソフトウェア)Tucker-Davis Technologies (TDT)BioSigRZ
双眼手術用拡大顕微鏡Zeiss Stemi 20000000001003877、4355400000000、0000001063306、4170530000000、4170959255000、4551820000000、4170959040000、4170959050000
ケージ(マクロロン)Techniplast1264C、1290D
Carprox vet、50mg/mlVirbac Tierarzneimittel GmbHPZN 11149509
冷光源Schott KL2500 LCD9.705 202
コットンチップアプリケーター (滅菌)カール・ロスEH12.1
カスタムメイドメッシュメタル ファラデーケージ (ステンレス鋼、厚さ 2 mm、メッシュサイズ 1 cm)カスタムメイド
5% デクスパンテノール (Bepanthenアイ&ノーズクリーム)バイエルVital GmbHPZN:01578681
使い捨て皮下ステンレス鋼Needle
電極、27GA、12mm		ロチェスターエレクトロメディカル株式会社S03366-18
外科用ドレープシート(滅菌)HartmannPZN 0366787
エタノール、70%Carl Roth9065.5
1/4 ''フリーフィールドメジャーキャリブレーションマイクキットTucker-Davis Technologies(TDT)PCB-378C0
(滅菌)Unigloves1570
フ鉗子湾曲、鋸歯状FST11052-10
GraphPad Prism 6 ソフトウェア、V6.07GraphPad Prism Software, Inc.https://www.graphpad.com/
熱式手術器具滅菌器FST18000-50
ホメオサーミック
加熱ブランク		ThermoLux461265/-67
ケタネスト S (ケタミン)、25mg/mlファイザーPZN 08707288
リンガー」B.BraunPZN 01471434
MatlabソフトウェアMathWorks, Inc.
Medusa 4チャンネル ローインペデッド。ヘッドステージタッカー・デイビス・テクノロジーズ (TDT)RA4LI
Medusa 4チャンネル・プリアンプ/デジタイザータッカー・デイビス・テクノロジーズ (TDT)RA4PA
マイクPCB Pieztronics378C01
マルチフィールドスピーカー - ステレオタッカー・デイビス・テクノロジーズ (TDT)MF1-S
オシロスコープテクトロニクスDPO3012
Optibitインターフェース用光PC1エクスプレスカード)タッカー・デイビス・システムズ(TDT)PO5e
Askina Braucelパッド(セルロース吸収パッド)B.BraunPZN 8473637
プリアンプPCB Pieztronics480C02
RZ6マルチI/Oプロセッサシステム(BioSigRZ)タッカー・デイビス・テクノロジーズ(TDT)RZ6-A-PI
0.9%生理食塩水(NaCl、滅菌)B.BraunPZN:8609255
SigGenRZソフトウェアTucker-Davis Technologies (TDT)https://www.tdt.com/
Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + Waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0)The R Foundation, R Core Team 2015Open Source Software (自由配布可能)
防音キュービクルMed Associates Inc.ENV-018V
標準パターン鉗子、長さ 12cm および 14.5 cmFST11000-12、11000-14
ロイコシルクテープBSN medical GmbH & Co. KGPZN 00397109
組織鉗子- 1x2 歯 12cmFST11021-12
Uniprotect 換気キャビネットBioscapeTHF3378
換気キャビネットテクニプラスト9AV125P
キシラジン(ロンプン)、2%バイエルバイタルGmbHPZN 1320422
グローブグレーhttps://de.mathworks.com/products/matlab.html

References

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