HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR からさらに分析できます。
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この記事について
サマリー
要約
タンパク質キナーゼ (PKR) rna は生得の免疫反応蛋白質のメンバーであるし、ウイルス Rna の二重鎖の二次構造を認識します。ウイルスの二本鎖 Rna (二本) にバインドされると、PKR は二量体化とそれに続く自己リン酸化を受けます。リン酸化 PKR (pPKR) はアクティブになり、真核生物の開始因子 2 (神経: Eif2) グローバル翻訳を抑制する α サブユニットのリン酸化を誘導します。増加する証拠を PKR を細胞周期の間に生理学的な条件の下で、または感染せず様々 なストレス条件下で起動できるかを示唆しています。しかし、pkr からの RNA の活性剤の私達の理解はキャプチャし、二本の pkr から相互作用を分析する標準化された実験方法の不足のために限られました。ここでは、提案する実験的具体的に豊かにし、PKR を分析するためのプロトコルは HeLa 細胞を用いた細胞周期中に Rna をバインドします。我々 は、PKR RNA 複合体を修正し、免疫沈降で分離するホルムアルデヒドの効率的な架橋アクティビティを利用します。PKR co 沈澱 Rna は、高スループット シーケンス ライブラリを生成するさらに処理することができます。PKR と相互作用する細胞二本鎖 rna の 1 つの主要なクラスは、重鎖と光鎖 Rna の相補的な相互作用による分子鎖 Rna として存在できますミトコンドリア Rna (mtRNAs) です。これらの二重 mtRNAs の strandedness を勉強するには、本鎖固有 qRT PCR のためのプロトコル。私達のプロトコルは PKR バインド Rna の解析に最適化されますが、細胞二本や他の dsRNA の結合蛋白質の RNA インターアクターを研究する簡単に変更できます。
概要
プロテインキナーゼ rna (PKR)、として知られている真核生物の開始因子 2 α キナーゼ 2 (EIF2AK2) はよ特徴付けられた蛋白質キナーゼ Rna によって提供される情報を伝送します。それは真核生物の翻訳開始 2 サブユニット α (神経: Eif2) に属するキナーゼ家族とグローバル翻訳1を抑制して感染への応答でセリン 51 で神経: Eif2 を廃止します。このコンテキスト PKR は PKR 活性化と自己リン酸化2のプラットフォームを提供するウイルスの二本鎖 Rna (二本) によってアクティブ化されます。神経: Eif2、に加えて PKR できますもをリン酸化 p53、インスリン受容体基質 1、阻害剤 B、c 6 月 N 末端キナーゼ (JNK) 多数信号伝達経路3,4、5の活動を規制するには 6。
PKR はもともとポリオ ウイルスの伝染の間にポリオ ウイルスの二本7、8を認識することによ....
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プロトコル
1. ソリューションおよびセルの準備
- ソリューションの準備
- 細胞培養液の 500 ml ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) の牛胎児血清 (FBS) の 50 mL を追加することによって HeLa 細胞培養のためメディアを準備します。
注: 抗生物質は、細胞培養液に追加できますが、我々 は抗生物質を使用しないでください。 - 0.1% パラホルムアルデヒド解散 1 で 4% (w/v) パラホルムアルデヒド x Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) ホット プレート上、希は暖房装置を持つ 1x PBS を追加して 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒドの 30 mL をすること。
注意: ヒューム フードのすべての手順を実行、パラホルムアルデヒド ソリューションを沸騰しないように注意してください。0.1% 溶液を光から保護し、4 ° C で保存ソリューションを使用して、1 ヶ月以内。
注: 最後の 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒド溶液の pH は約 7 をする必要があります。 - FCLIP の換散バッファーの準備: トリス-HCl (pH 7.5) 20 mM 15 mM 0.1% (v/v) トリトン X-100, 10 ミリメートルの EDTA、0.5% (v/v) ノニデット p40 (NP-40)、塩化ナトリウム 0.1% (v/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) とデオキシ ....
- 細胞培養液の 500 ml ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) の牛胎児血清 (FBS) の 50 mL を追加することによって HeLa 細胞培養のためメディアを準備します。
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結果
HeLa 細胞を細胞周期の S または M の段階で逮捕するプロセスの模式図を図 1に示します。M 相逮捕のサンプルでは、(図 2 a) 顕微鏡の下で円形の形をした細胞を明確に視覚化できます。細胞周期の停止の効率を調べる、FACS (図 2 b) を使用してセルの核の内容を分析できます。D7F7 抗体が immunoprecipitate PKR する優れた性能を示す免疫沈降効率テストの代表的なデータを図 3に示します。この免疫沈降効率の違いは、2 つの異なる PKR 抗体 (図 4) を使用した高スループット シーケンス ライブラリのクラス分布の相違に反映されてが可能性があります。さらに、PKR immunoprecipitate (図 5 a) の総細胞ライセート (図 5 b) 全体のしみの西部分析を使用して D7F7 抗体の特異性.......
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ディスカッション
S または M 相逮捕のサンプルを準備するプロセスを図 1に示します。S 期の細胞を逮捕、逮捕高効率 (図 1 a) を確保する間に 9 h のリリースで 2 回チミジンと細胞を扱ってチミジンの二重ブロック メソッドを使用しました。チミジンと一度セルを扱って M 相の逮捕のため 9 h のリリースに続いて、ブロック prometaphase (図 1 b) 細胞にノコダゾールを適用します。細胞周期のサンプルを準備する 1 つの重要なステップは、最初のチミジン ブロック後リリースのステップです。チミジンを完全に削除するには、少なくとも 2 回新鮮な PBS のセルを洗浄するが重要です。不適切な洗浄および残留チミジン増加の不均質性と減少した細胞で起因できます。M 相逮捕の成功は、円形の細胞 (図 2 a) 数の増加に基づいて視覚的に確認できます。ただし、M 相サンプルはまだ彼らの形態に基づく多くの間期細胞.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 韓国政府科学省と ICT (NRF 2016R1C1B2009886) によって資金を供給によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA、pH 8.0 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | AM9260G | |
| 1 M トリス、pH 7.0 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9855G | |
| 1 M トリス、pH 8.0 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | AM9855G | |
| 1.7 mL 微量遠心チューブ | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA ローディングバッファー | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL コニカルチューブ | SPL | 50015 | |
| 3' アダプター | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3 | ||
| M 酢酸ナトリウム pH 5.5 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9740 | |
| 5' アダプター | 5'-GUU CAG AGU UCU ACU GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9760G | |
| 50 mL コニカルチューブ | SPL | 50050 | |
| 酸フェノールクロロホルム、pH 4.5 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9722 | |
| アジャンクール AMPure XP | ベックマンコールター | A63881 | 磁気ビーズ DNA/RNA クリーンアップ |
| 南極アルカリホスファターゼ | ニューイングランド バイオラボ | M0289S | |
| 抗DGCR8 | 自社製 | ||
| 抗PKR (D7F7) | 細胞シグナル伝達技術 | 12297S | |
| 抗PKR (ミリ) | ミリポア EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| ブロモフェノールブルーナトリウム塩 | Sigma-aldrich | B5525 | |
| 子牛腸内アルカリホスファターゼ | TaKaRa | 2250A | |
| 細胞スクレーパー 25 cm 2 ポジション | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV プロモーター シーケンス | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco | ||
| の修正イーグル培地 | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP 混合物 (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| エタノール、絶対、ACS グレード | アルファ エーザー | A9951 | |
| ウシ胎児血清 | メルク | M-TMS-013-BKR | |
| ホルムアミド | メルク | 104008 | |
| グリシン | バイオベーシック | GB0235 | |
| グリコブルー コプレシピタント (15 mg/mL) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9516 | |
| イソプロパノール | メルク | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA 枯渇キット | ニューイングランドバイオラボ | E6318 | rRNA枯渇キット |
| ノコダゾール | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| 正常ウサギIgG | 細胞シグナル伝達技術 | 2729S | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCRフォワードプライマー(RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACCG GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCRインデックスリバースプライマー(RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'PCR | ||
| チューブ、フラットキャップ付き、0.2mL | Axygen | PCR-02-C | |
| リン酸bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| スイングアウトローター付きPlateFuge微量遠心分離機 | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR プライマー 配列: CO1 ヘビー | フォワード/リバース: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:CO1ライト | フォワード/リバース:5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:CO2ヘ | ビーフォワード/リバース:5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGGGGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:CO2ライト | フォワード/リバース:5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:CO3ヘビーフォ | ワード/リバース:5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:CO3ライト | フォワード/リバース:5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:CYTB Heavy | Forward/Reverse:5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:CYTB Light | Forward/Reverse:5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:GAPDH | フォワード/リバース:5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:ND1ヘビー | フォワード/リバース:5&プライム;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&プライム;/5&プライム;-CGCAAATGGGGGGTAGGCGTG-3&プライム; | ||
| qPCRプライマー配列:ND1ライト | フォワード/リバース:5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:ND4ヘビー | フォワード/リバース:5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:ND4ライト | フォワード/リバース:5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:ND5ヘビー | フォワード/リバース:5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:ND5ライト | フォワード/リバース:5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:ND6ヘビー | フォワード/リバース:5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCRプライマー配列:ND6ライト | フォワード/リバース:5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| ランダムヘキサマー | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| 組換えRnase阻害剤(40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RTプライマー配列:CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RTプライマー配列:CO2ヘビー5 | ′-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RTプライマー配列:CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RTプライマー配列:CO3ヘビー5 | ′-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RTプライマー配列:CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACCACCACCACCCCCTAG-3′ | ||
| RTプライマー配列:CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGGGGGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RTプライマー配列:CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCCCCACCCCC-3′ | ||
| RTプライマー配列:GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGGCTCGGCT-3′ | ||
| RTプライマー配列:ND1ヘビー5 | &プライム;-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&プライム; | ||
| RTプライマー配列:ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RTプライマー配列:ND4ヘビー5 | &プライム;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&プライム; | ||
| RTプライマー配列:ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RTプライマー配列:ND5ヘビー5 | ′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RTプライマー配列:ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RTプライマー配列:ND6ヘビー5 | &プライム;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RTプライマー配列:ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCCCC-3′ | ||
| シリコン処理ポリプロピレン 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| デデシル硫酸ナトリウム | Biosesang | S1010 | |
| デオキシコール酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase 阻害剤 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM2694 | |
| SuperScript III 逆転写酵素 | サーモフィッシャーサイエンティフィック 18080093 | ライブラリー調製用逆転写酵素 | |
| SuperScript IV 逆転写酵素 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 18090010 | qRT-PCR |
| SYBR金核酸 gl染色 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S11494 | |
| T4 ポリヌクレオチドキナーゼ | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA リガーゼ 1 (ssRNA リガーゼ) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNAリガーゼ2、切り捨てられたKQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTAバッファー(TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| UltralinkプロテインAセファロースビーズ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 22810 | プロテインAビーズ |
| 超音波処理装置 | バイオラプター | ||
| 尿素 | バイオベーシック | UB0148 | |
| ボルテックスミキサー | ダイハンサイエンティフィック | VM-10 | |
| キシレンシアノール | シグマ・アルドリッチ | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL、3.3 μM) | パーキンエルマー | BLU502A100UC |
参考文献
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMil....
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