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方法論記事

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

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DOI：

10.3791/59215

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2019年3月5日

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering and KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

この記事について

サマリー

HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR からさらに分析できます。

要約

タンパク質キナーゼ (PKR) rna は生得の免疫反応蛋白質のメンバーであるし、ウイルス Rna の二重鎖の二次構造を認識します。ウイルスの二本鎖 Rna (二本) にバインドされると、PKR は二量体化とそれに続く自己リン酸化を受けます。リン酸化 PKR (pPKR) はアクティブになり、真核生物の開始因子 2 (神経: Eif2) グローバル翻訳を抑制する α サブユニットのリン酸化を誘導します。増加する証拠を PKR を細胞周期の間に生理学的な条件の下で、または感染せず様々 なストレス条件下で起動できるかを示唆しています。しかし、pkr からの RNA の活性剤の私達の理解はキャプチャし、二本の pkr から相互作用を分析する標準化された実験方法の不足のために限られました。ここでは、提案する実験的具体的に豊かにし、PKR を分析するためのプロトコルは HeLa 細胞を用いた細胞周期中に Rna をバインドします。我々 は、PKR RNA 複合体を修正し、免疫沈降で分離するホルムアルデヒドの効率的な架橋アクティビティを利用します。PKR co 沈澱 Rna は、高スループット シーケンス ライブラリを生成するさらに処理することができます。PKR と相互作用する細胞二本鎖 rna の 1 つの主要なクラスは、重鎖と光鎖 Rna の相補的な相互作用による分子鎖 Rna として存在できますミトコンドリア Rna (mtRNAs) です。これらの二重 mtRNAs の strandedness を勉強するには、本鎖固有 qRT PCR のためのプロトコル。私達のプロトコルは PKR バインド Rna の解析に最適化されますが、細胞二本や他の dsRNA の結合蛋白質の RNA インターアクターを研究する簡単に変更できます。

概要

プロテインキナーゼ rna (PKR)、として知られている真核生物の開始因子 2 α キナーゼ 2 (EIF2AK2) はよ特徴付けられた蛋白質キナーゼ Rna によって提供される情報を伝送します。それは真核生物の翻訳開始 2 サブユニット α (神経: Eif2) に属するキナーゼ家族とグローバル翻訳1を抑制して感染への応答でセリン 51 で神経: Eif2 を廃止します。このコンテキスト PKR は PKR 活性化と自己リン酸化2のプラットフォームを提供するウイルスの二本鎖 Rna (二本) によってアクティブ化されます。神経: Eif2、に加えて PKR できますもをリン酸化 p53、インスリン受容体基質 1、阻害剤 B、c 6 月 N 末端キナーゼ (JNK) 多数信号伝達経路3,4、5の活動を規制するには 6。

PKR はもともとポリオ ウイルスの伝染の間にポリオ ウイルスの二本7、8を認識することによって神経: Eif2 をリン酸化するキナーゼとして同定されました。PKR は昨今は免疫応答を超えて多面的な役割を果たすことと多くの人間の病気でその異常活性化や故障はございません。アクティブ/Phosphorylated PKR (pPKR) はアポトーシス中によく見られる、変性疾患、特にハンチントン病などの神経変性疾患、パーキンソンのおよびアルツハイマー病9 患者の共通の特徴 ,,1011,12,13。また、PKR は代謝ストレスや熱衝撃14,15,16,17など様々 なストレス条件下で作動します。その一方で、PKR 阻害は高められた細胞増殖とも悪性転化18,19の結果します。PKR 関数はまた正常な脳機能に重要なと pPKR のレベルとして細胞周期の間に高架 M 相20,21,22時。このコンテキストで pPKR はグローバルな翻訳を抑制する適切な細胞分裂20に必要なキーの分裂シグナル伝達システムへの手がかりを提供しています。また、pkr からの持続性の活性化は中国のハムスターの卵巣の細胞周期の停止細胞23G2/m 期で起因しました。その結果、PKR のリン酸化は、21M/G1 遷移中に急速な不活性化を確保するため負帰還ループによって調整されます。

PKR の広い範囲の機能にもかかわらず PKR 活性化の私達の理解は、キャプチャし、PKR をアクティブにすることができます二本を識別する標準化されたハイスループット実験的アプローチの不足のため制限されています。前の研究は、PKR を二本 2 倒立 Alu 反復 (IRAlus)20,24が、細胞周期の間にまたはの下で PKR をアクティブにすることができます追加の細胞二本鎖 rna の存在の可能性によって形成されるやり取りできること示されています。ひと細胞におけるストレス条件は探検でした。RNA 結合タンパク質 (RBP) の RNA インターアクターを識別するに従来のアプローチは、クロスリンク RNA RBP 錯体25,26,27に紫外光を使用します。最近の研究はマウス システムのこの UV 架橋アプローチを適用し、核小体低分子 Rna が代謝ストレス16の間に PKR 活性化を調節することが識別されます。ホルムアルデヒドの高架橋効率を活用することにより28HeLa 細胞の細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を識別する方法を提案します。同様のアプローチは、シュタウフェン Drosha29,30,31など他の dsRBPs を研究に適用されています。短い散在させていて核要素 (正弦波)、長い散在核要素 (ライン)、内在性レトロ ウイルス要素 (ERV) とも α サテライト Rna など PKR が非翻訳 Rna のさまざまな種類と対話できるとわかった。また、PKR がミトコンドリア Rna (mtRNAs)、重鎖と光の相補的な相互作用を介してどのフォームの分子間二本鎖 Rna28と対話できることを示した。最近の出版物は、さらにいくつかの mtRNAs が二重のフォームに存在し、dsRNA センサー32インターフェロンを誘発する分化関連タンパク質悪性黒色腫 5 などをアクティブにすることができます私たちのデータをサポートしました。もっと重要なは、表現と mtRNAs の細胞内局変調細胞周期の間に、様々 なストレスによって28PKR 活性化を調節する能力に重要な可能性があります。

この記事で提案する架橋結合する最近開発されたホルムアルデヒドと免役沈降法 (fCLIP) のための詳しいプロトコルを取り込み、細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を解析するメソッド。チミジンとノコダゾールを用いた細胞周期停止試料を準備する方法を示す.これらの Rna を識別する高スループット シーケンス ライブラリを準備する PKR バインド Rna とメソッドを特定する fCLIP プロセスを提案する.さらに、我々 は qRT PCR を使用して PKR バインド Rna を分析する手順の詳細を描きます。具体的には、mtRNAs の strandedness を分析するアンチセンス逆転写法を紹介します。記述されていたプロトコルは HeLa 細胞の PKR、最適化されますが、細胞周期サンプル、fCLIP、アンチセンス qRT PCR 解析の準備などの重要なステップは、携帯電話の二本を勉強するまたは他の dsRBPs の RNA インターアクターを識別するために簡単に変更できます。

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プロトコル

1. ソリューションおよびセルの準備

  1. ソリューションの準備
    1. 細胞培養液の 500 ml ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) の牛胎児血清 (FBS) の 50 mL を追加することによって HeLa 細胞培養のためメディアを準備します。
      注: 抗生物質は、細胞培養液に追加できますが、我々 は抗生物質を使用しないでください。
    2. 0.1% パラホルムアルデヒド解散 1 で 4% (w/v) パラホルムアルデヒド x Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) ホット プレート上、希は暖房装置を持つ 1x PBS を追加して 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒドの 30 mL をすること。
      注意: ヒューム フードのすべての手順を実行、パラホルムアルデヒド ソリューションを沸騰しないように注意してください。0.1% 溶液を光から保護し、4 ° C で保存ソリューションを使用して、1 ヶ月以内。
      注: 最後の 0.1% (v/v) パラホルムアルデヒド溶液の pH は約 7 をする必要があります。
    3. FCLIP の換散バッファーの準備: トリス-HCl (pH 7.5) 20 mM 15 mM 0.1% (v/v) トリトン X-100, 10 ミリメートルの EDTA、0.5% (v/v) ノニデット p40 (NP-40)、塩化ナトリウム 0.1% (v/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) とデオキシ コール酸ナトリウム 0.1% (w/v)。40 mL にトリプル蒸留水 (TDW) を追加します。4 ° C でのストア
    4. FCLIP 洗浄バッファーを準備: トリス-HCl (pH 7.5) 20 mM 150 mM、0.1% (w/v) 0.1% (v/v) SDS、0.1% (v/v) トリトン X-100 0.1% (v/v) NP 40 塩化ナトリウム、10 ミリメートルの EDTA、デオキシ コール酸ナトリウム。TDW を 40 mL に追加します。4 ° C でのストア
    5. 4 x PK バッファーを準備: 400 mM トリス-HCl (pH 7.5)、200 mM の NaCl、40 ミリメートルの EDTA および 4% (v/v) SDS。TDW を 40 mL に追加します。常温で保存します。
    6. FCLIP 溶出バッファーを準備: PK バッファー、尿素、21 g、TDW 8.5 mL x 4 の 20 mL。新鮮な準備します。
    7. RNA 溶出バッファーを準備: 0.3 M NaOAc と 2% (w/v) SDS。常温で保存します。
    8. RNA のローディングの染料 × 2 の準備: 95% (v/v) ホルムアミド、0.05% (w/v) SDS 5 mM EDTA 0.025% (w/v) キシレンシアノール 0.025% (w/v) ブロモフェノールの青。-20 ° C にてストア
    9. 1 x TBE バッファーを準備: 0.089 M Tris ホウ酸塩と 0.002 M EDTA。500 mL の TBE バッファーを準備します。
  2. S または M 相逮捕細胞の調製
    1. 種子の 750,000 ~ または ~ 1,000,000 hela 細胞はそれぞれ S または M 相逮捕サンプルの細胞します。24 h の CO2を 37 ° C、5% で細胞を成長します。
    2. 2 mM チミジンで細胞を治療し、37 ° C で 18 h インキュベート
    3. PBS で 2 回細胞を洗浄します。新鮮なメディアを追加し、37 ° C で 9 時間インキュベート
    4. S 相逮捕細胞、2 mM チミジンとセルを扱います。M 相逮捕細胞 100 ng/mL ノコダゾールとセルを扱います。37 ° C と収穫の細胞で 15 時間孵化させなさい。
      注: 細胞周期サンプルの均質性は、FACS を使用して確認できます。

2. ホルムアルデヒド架橋と免役沈降法

  1. セル収穫
    1. S の段階のサンプルでは、15 mL の円錐管に細胞スクレーパーと転送細胞を収集します。M 相サンプル、M 相逮捕細胞をデタッチし、15 mL の円錐管にそれらを転送する細胞培養皿の側面をタップします。
      注: M 相逮捕細胞の均一性を高めるため細胞スクレーパーを使用しないでください。
    2. 3 分削除のため室温で 380 x gで細胞上清を遠心し、再 1 ml の PBS 寒くて 1.5 mL 遠心チューブに転送の中断します。
    3. 遠心 10,000 x gで 4 ° C でセル 30 s. 削除の上清完全に。
  2. 架橋結合するホルムアルデヒド
    1. セルを修正するために室温で 10 分間 0.1% パラホルムアルデヒドの 750 μ L を追加します。
    2. 1 M のグリシンの 250 μ L を追加し、反応を抑制するために室温でさらに 10 分間インキュベートします。遠心 10,000 x gで 4 ° C でセル 30 s. 削除の上清完全に。
    3. 1 mL の PBS を再停止できます。遠心分離機の 10,000 のセル 30 s や削除、上清のための 4 ° C でg x。
    4. 0.2% (v/v) プロテアーゼ阻害剤と 2% (v/v) RNase 阻害剤を添加した fCLIP 換散バッファーの 400 μ L を再停止できます。氷上で 10 分間インキュベートし、ultrasonicator を用いた超音波照射します。
    5. ~ 150 mm の NaCl 濃度を調整する 5 M の NaCl の 11 μ L を追加します。簡単に渦と 21,130 x gで 4 ° C で 15 分間遠心上清を中古冷蔵 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
      注: は、入力サンプルとして新しい遠心管の上澄みの 40 μ L を保持します。4 ° C で入力のサンプルを保存します。
  3. 免疫沈降
    1. 1.5 mL 遠心チューブにプロテイン A ビーズの 20 μ L を追加します。
    2. 400 μ fCLIP 換散バッファーのビードを洗います。4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、慎重に fCLIP 換散バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
    3. 洗浄ステップを 3 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
    4. 再 fCLIP 換散バッファーの 300 μ L でビーズを中断します。~ 150 mm の NaCl 濃度を調整する 5 M の NaCl の 8.3 μ L を追加します。PKR 抗体の 10 μ L を追加し、4 ° C でローテーター上 3 時間インキュベート
    5. 4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、fCLIP 洗浄バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
    6. 洗浄ステップを 2 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
      注: は、渦のミキサーを使用しないでください。手で軽くチューブを反転します。
    7. ライセート 300 μ L を追加し、回転の 4 ° C で 3 時間インキュベートします。
      注: 長いインキュベーション時間増加の背景バインド可能性があります。
    8. 4 ° c で 1 分間削除 1,000 x gでビーズの上澄みを遠心し、fCLIP 洗浄バッファーの 400 μ L を追加します。優しく再反転 3 でビーズを中断 ~ 4 回。
    9. 洗浄ステップを 3 回繰り返します。最終的な洗浄の後、上清を完全に取り外します。
    10. FCLIP 溶出バッファーの 300 μ L を追加します。ビーズから PKR を溶出する 25 の ° C で 3 時間 thermomixer で孵化させなさい。
      注: fCLIP 溶出バッファー フレッシュを準備します。
    11. 常温 1,000 × gで遠心し、上清をきれいなシリコーン チューブに転送します。
      注: 微量遠心チューブも ok、ですが、デ架橋ステップ (ステップ 2.3.12) 中に蒸発を防ぐためにシリコーン チューブを優先します。
    12. プロティナーゼ K の 300 μ L (20 mg/mL) を追加し、65 ° C で一晩インキュベート
      注: 温水カバー蒸発を避けるために、thermomixer を使用します。
  4. RNA の抽出
    1. 1 h の 37 ° C で 30 s. 加温の酸フェノール クロロホルムおよび渦の 580 μ L を追加します。
    2. 渦 30 s と常温 12,000 × gで 10 分間遠心します。
    3. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム (例えば、Glycoblue) の 0.5 μ L と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
    4. ペレットの 1 h の 4 ° C で最大速度で遠心分離による沈殿物します。
      注: RNA/DNA ペレットが認められない場合は、RNA ・ DNA ペレットが観察されるまでクロムと追加 1 h 続行このステップの遠心分離機の追加 0.5 μ を追加します。
    5. 上澄みを除去し、75% エタノール 1 mL を加えます。4 ° C、12,000 × gで 5 分間遠心は洗浄ステップをあと 1 回繰り返します。清を完全に除去し、室温でペレットを乾燥します。
    6. 1 h の 37 ° C で 42 μ TDW、DNase 私はバッファリングの 5 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L、DNase I. 孵化の 2 μ L を追加します。
    7. TDW の 150 μ L、200 μ L 酸フェノール クロロホルムを追加します。常温 12,000 × gで 10 分間 30 s. 遠心の渦。
    8. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と 100% エチルアルコールの 1 mL の 20 μ L を追加します。-80 ° C で一晩インキュベートします。
    9. ペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
    10. 再 TDW の適切な量を中断します。

3. シーケンス ライブラリの準備

  1. rRNA 除去
    1. 再手順 2.4.10 を TDW 28 μ から RNA ペレットを中断します。
      注: 最大総 RNA 量未満 5 μ g をする必要があります。
    2. RRNA を削除する rRNA 除去キットのリファレンス ・ ガイドによって提供される手順に従います。
    3. RRNA をクリーンアップ磁気ビーズの 160 μ L の追加によって Rna を枯渇しました。
      1. 〜 15 回のピペッティングして混合し、15 分間室温でインキュベートします。
      2. 磁気バーにチューブを接続し、上清を除去します。
      3. 80% エチルアルコールの 300 μ L を付加し、ビーズ、磁気バーにまだ接続されている間インキュベートする 30 秒。
      4. 新鮮な 300 μ L ソリューションでエチルアルコールを置き換えます。空気は乾燥室温で 12 分間磁気バーのビーズです。
      5. 再 TDW とミックスの 12 μ L で 15 回のピペッティングでビーズを中断します。
      6. 磁気バーのビーズを添付し、きれいな PCR チューブに上清を移動します。
    4. 断片化されたリボソーム Rna (Rrna) の枯渇はキット rRNA によって提供される手順を使い果たします。
    5. 磁性ビーズおよび繰り返し手順 3.1.3.1 に 3.1.3.6 110 μ L の追加によって Rna をクリーンアップします。
  2. RNA のラベリングとアダプターの結紮
    1. RRNA 枯渇 Rna 上 10 x CIAP バッファーの 2 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L と南極のアルカリホスファターゼの 2 μ L を追加します。1 h の 37 ° C で、その後、脱燐酸化酵素を不活化する 5 分の 65 ° C を孵化させなさい。
    2. 10 x PNK バッファーの 3 μ L、RNase 阻害剤 1.5 μ L、1.5 μ T4 PNK 酵素、r-ATP の 0.8 μ L と 1.7 μ TDW を追加します。50 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    3. 10 mM ATP の 1.5 μ L を追加し、さらに 40 分の 37 ° C で孵化させなさい。
    4. RNA 溶出バッファーの 170 μ L の追加によって反作用を停止します。
    5. 常温 12,000 × gで 10 分間 30 s. 遠心の酸フェノール クロロホルムおよび渦の 200 μ L を追加します。
    6. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに最上位のレイヤーを転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と 100% エチルアルコールの 1 mL の 20 μ L を追加します。-80 ° C で一晩インキュベートします。
    7. RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。再 TDW の 4.5 μ L で中断および RNA 読み込み染料 × 2 の 9 μ L を追加します。
    8. 95 ° C、5 分および 10% 尿素ページのゲルにロードでサンプルを加熱します。
    9. 40 分間 370 V でゲルを実行します。
      注: は、事前サンプルをロードする前に 90 分の 370 V でゲルを実行します。
    10. 〜 100-500 塩基領域でゲルをカットして、ゲルを破る。
    11. 0.3 M の NaCl の 700 μ L を追加し、4 ° C で回転で一晩インキュベートします。
    12. 列と室温での最高速度で 5 分間遠心するソリューションに転送します。
    13. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに溶出液を転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
  3. 3' アダプター結紮
    1. RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
    2. 再 TDW の 6.5 μ L の RNA ペレットを中断し、1 μ 10 μ M 3' アダプターを追加します。
    3. PCR チューブに溶液を移および 2 分の 70 ° C で孵化させなさい。
    4. 10 x 結紮バッファーの 1 μ L、RNase 阻害剤 0.5 μ L および T4 RNA リガーゼ 2 の 1 μ L を追加します。1 h、6 h、25 ° C そして 22 ° C、6 h 28 ° C の孵化させなさい。
    5. 95 ° C、5 分で 12 μ L の RNA ローディングの染料と熱 × 2 を追加します。
    6. ゲルの浄化 3' 3.2.9 へ 3.2.13 で説明するように、アダプターが Rna を結紮します。
  4. 5' アダプター結紮
    1. RNA のペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。
    2. 再 TDW の 4.2 μ L の RNA ペレットを中断し、5 μ M 5' アダプターの 1 μ L を追加します。
    3. PCR チューブに溶液を移および 2 分の 70 ° C で孵化させなさい。
    4. 10 x リガーゼ バッファー、RNase 阻害剤, 0.8 μ 10 mM ATP、T4 RNA リガーゼ 1 0.8 μ の 0.4 μ L の 0.8 μ L を追加します。1 h、6 h、25 ° C そして 22 ° C、6 h 28 ° C の孵化させなさい。
  5. 逆のトランスクリプションおよび PCR の拡大
    1. 5' アダプター結紮 Rna は 4 μ M の逆のトランスクリプションのプライマーの 1 μ L を追加します。2 分の 70 の ° C で、すぐに 4 ° C に冷却
    2. 5 x FS バッファーの 4 μ L、2.5 mM dNTP の 4 μ L、0.1 M の DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素の 1 μ L の 1 μ L を追加します。50 ° c 1 時間、70 ° C、15 分間インキュベートします。
    3. PCR の拡大を準備します。
      1. RT 製品のミックス 1 μ、25 μ M RPI プライマーの 1 μ L、25 μ M RP1 プライマーの 1 μ L、HF バッファー、2.5 mM dNTP の 4 μ L、インスタレーション、32.5 μ x 5 の 10 μ L、忠実度の高いポリメラーゼの 0.5 μ L。
      2. 11 の PCR プログラムを実行 〜 13 サイクル。
        注意: PCR のためのプログラムは: 98 ° C、30 秒ホット スタート、10 98 ° C で s、60 ° C、30 s と 45 のための 72 ° C s 増幅、および 5 分の 72 ° C。11-13 サイクルに拡大のステップを繰り返します。
    4. 磁気ビーズと次の手順 3.1.3.1 に 3.1.3.6 40 μ L を使用が、DNA を溶出する TDW の 10 μ L の PCR の製品をクリーンアップします。
    5. 10 x DNA ローディングの染料の 2 μ L を追加します。6% アクリルアミドのゲルにサンプルをロードし、30 分間 200 V で実行します。
    6. 室温で 5 分間 Sybr ゴールド (0.01% (v/v) 1 x TBE バッファー) で染色します。
    7. 室温で 5 分間 1 x TBE バッファーの染色解除。
    8. ~ 200-700 塩基領域でゲルをカットして、ゲルを破る。
    9. 0.3 M の NaCl の 700 μ L を追加し、DNA を溶出する室温で一晩インキュベートします。
    10. すべてのロードに列と室温での最高速度で 5 分間遠心します。
    11. きれいな 1.5 mL 遠心チューブに溶出液を転送します。3 M NaOAc、クロム、0.5 μ と等量のイソプロパノールの 1/10 量を追加します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
    12. DNA ペレットを沈殿させる、2.4.4 に 2.4.5 の手順で説明するよう 75% エチルアルコールを洗ってください。再 TDW の 20 μ l を中断します。
    13. シーケンサーを使用してサンプルを分析します。

4. qRT PCR を使用して相互作用の pkr からの Rna の解析

  1. 方法 1: ランダムな hexamer 逆のトランスクリプション
    1. 再手順 2.4.10 を TDW 8.5 μ から RNA ペレットを中断し、ソリューションを PCR チューブに転送します。
    2. 100 μ M のランダムな hexamers の 0.5 μ L と 2.5 mM dNTP の組合せの 4 μ L を追加します。
    3. 熱ソリューション 65 ° c 5 分のため、すぐには、少なくとも 1 分間氷の上孵化させなさい。
    4. ミックス反応: 5 x SSIV バッファーの 4 μ L、100 mM DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 1 μ L の 1 μ L。RNA 溶液に反応混合物を追加します。
    5. 10 分、50 ° C 10 分の 23 ° c 混合物をインキュベートし、80 ° C, 10 分。
    6. リアルタイム PCR を用いた cDNA を分析します。
      注: リアルタイム PCR のためのプログラムは: 95 ° C、3 分ホット スタート、95 ° C、5 s と 60 ° C、10 増幅、および 95 ° C、30 秒 s、65 ° C、30 s、および 95 ° C、30 メルトの s。40 サイクルに拡大のステップを繰り返します。
  2. 方法 2: 鎖固有の逆のトランスクリプション
    1. 逆のプライマーのマスター ミックスを調製: CMV プロモーター配列を含む遺伝子特定の逆のトランスクリプション プライマーの同量は続く 〜 20 ヌクレオチド遺伝子特定シーケンスのミックス。
      注: 結合されたすべての遺伝子特定 RT プライマー濃度は 4 μ M です。
    2. 再手順 2.4.10 を TDW 8.5 μ から RNA ペレットを中断し、ソリューションを PCR チューブに転送します。
    3. 逆のトランスクリプションのプライマーの 4 μ M のマスター ミックスと 2.5 mM dNTP の組合せの 4 μ L の 0.5 μ L を追加します。
    4. 熱ソリューション 65 ° c 5 分のため、すぐには、少なくとも 1 分間氷の上孵化させなさい。
    5. 5 x SSIV バッファーの 4 μ L、100 mM DTT、RNase 阻害剤の 1 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 1 μ L の 1 μ L を混合することによって反応液を準備します。RNA プライマー ミックスに反応液を追加します。
    6. 50 ° C 10 分、10 分の 80 ° C でソリューションを孵化させなさい。
    7. リアルタイム PCR を用いた cDNA を分析します。
      注: リアルタイム PCR のためのプログラムは、方法 1 で説明したものと同じです。

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結果

HeLa 細胞を細胞周期の S または M の段階で逮捕するプロセスの模式図を図 1に示します。M 相逮捕のサンプルでは、(図 2 a) 顕微鏡の下で円形の形をした細胞を明確に視覚化できます。細胞周期の停止の効率を調べる、FACS (図 2 b) を使用してセルの核の内容を分析できます。D7F7 抗体が immunoprecipitate PKR する優れた性能を示す免疫沈降効率テストの代表的なデータを図 3に示します。この免疫沈降効率の違いは、2 つの異なる PKR 抗体 (図 4) を使用した高スループット シーケンス ライブラリのクラス分布の相違に反映されてが可能性があります。さらに、PKR immunoprecipitate (図 5 a) の総細胞ライセート (図 5 b) 全体のしみの西部分析を使用して D7F7 抗体の特異性...

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ディスカッション

S または M 相逮捕のサンプルを準備するプロセスを図 1に示します。S 期の細胞を逮捕、逮捕高効率 (図 1 a) を確保する間に 9 h のリリースで 2 回チミジンと細胞を扱ってチミジンの二重ブロック メソッドを使用しました。チミジンと一度セルを扱って M 相の逮捕のため 9 h のリリースに続いて、ブロック prometaphase (図 1 b) 細胞にノコダゾールを適用します。細胞周期のサンプルを準備する 1 つの重要なステップは、最初のチミジン ブロック後リリースのステップです。チミジンを完全に削除するには、少なくとも 2 回新鮮な PBS のセルを洗浄するが重要です。不適切な洗浄および残留チミジン増加の不均質性と減少した細胞で起因できます。M 相逮捕の成功は、円形の細胞 (図 2 a) 数の増加に基づいて視覚的に確認できます。ただし、M 相サンプルはまだ彼らの形態に基づく多くの間期細胞...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 韓国政府科学省と ICT (NRF 2016R1C1B2009886) によって資金を供給によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTA、pH 8.0サーモフィッシャーサイエンティフィAM9260G
1 M トリス、pH 7.0サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9855G
1 M トリス、pH 8.0サーモフィッシャーサイエンティフィAM9855G
1.7 mL 微量遠心チューブAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA ローディングバッファーTaKaRa9157
15 mL コニカルチューブSPL50015
3' アダプター5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3
M 酢酸ナトリウム pH 5.5サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9740
5' アダプター5'-GUU CAG AGU UCU ACU GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClサーモフィッシャーサイエンティフィックAM9760G
50 mL コニカルチューブSPL50050
酸フェノールクロロホルム、pH 4.5サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9722
アジャンクール AMPure XPベックマンコールターA63881磁気ビーズ DNA/RNA クリーンアップ
南極アルカリホスファターゼニューイングランド バイオラボM0289S
抗DGCR8自社製
抗PKR (D7F7)細胞シグナル伝達技術12297S
抗PKR (ミリ)ミリポア EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
ブロモフェノールブルーナトリウム塩Sigma-aldrichB5525
子牛腸内アルカリホスファターゼTaKaRa2250A
細胞スクレーパー 25 cm 2 ポジションSarstedt83.183
CMV プロモーター シーケンス5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco
の修正イーグル培地WelgeneLM001-05
dNTP 混合物 (2.5 mM)TaKaRa4030
エタノール、絶対、ACS グレードアルファ エーザーA9951
ウシ胎児血清メルクM-TMS-013-BKR
ホルムアミドメルク104008
グリシンバイオベーシックGB0235
グリコブルー コプレシピタント (15 mg/mL)サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9516
イソプロパノールメルク8.18766.1000
NEBNext rRNA 枯渇キットニューイングランドバイオラボE6318rRNA枯渇キット
ノコダゾールSigma-AldrichM1404
正常ウサギIgG細胞シグナル伝達技術2729S
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich6148
PCRフォワードプライマー(RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACCG GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCRインデックスリバースプライマー(RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'PCR
チューブ、フラットキャップ付き、0.2mLAxygenPCR-02-C
リン酸bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
スイングアウトローター付きPlateFuge微量遠心分離機Benchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR プライマー 配列: CO1 ヘビーフォワード/リバース: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:CO1ライトフォワード/リバース:5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:CO2ヘビーフォワード/リバース:5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGGGGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:CO2ライトフォワード/リバース:5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:CO3ヘビーフォワード/リバース:5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:CO3ライトフォワード/リバース:5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:CYTB HeavyForward/Reverse:5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:CYTB LightForward/Reverse:5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:GAPDHフォワード/リバース:5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:ND1ヘビーフォワード/リバース:5&プライム;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&プライム;/5&プライム;-CGCAAATGGGGGGTAGGCGTG-3&プライム;
qPCRプライマー配列:ND1ライトフォワード/リバース:5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:ND4ヘビーフォワード/リバース:5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:ND4ライトフォワード/リバース:5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:ND5ヘビーフォワード/リバース:5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:ND5ライトフォワード/リバース:5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:ND6ヘビーフォワード/リバース:5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCRプライマー配列:ND6ライトフォワード/リバース:5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
ランダムヘキサマーThermo Fisher ScientificSO142
Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL)TaKaRa2270A
組換えRnase阻害剤(40 U/μL)TaKaRa2313A
Ribo-Zero rRNA Removal KitIlluminaMRZH116rRNA Removal Kit
RotatorFINEPCR, ROTATOR AGD1.5-32
RT primer sequence: CO1 Heavy5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′
RTプライマー配列:CO1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′
RTプライマー配列:CO2ヘビー5′-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′
RTプライマー配列:CO2 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′
RTプライマー配列:CO3ヘビー5′-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′
RTプライマー配列:CO3 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACCACCACCACCCCCTAG-3′
RTプライマー配列:CYTB Heavy5′-CGCAAATGGGGGGGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′
RTプライマー配列:CYTB Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCCCCACCCCC-3′
RTプライマー配列:GAPDH5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGGCTCGGCT-3′
RTプライマー配列:ND1ヘビー5&プライム;-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&プライム;
RTプライマー配列:ND1 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′
RTプライマー配列:ND4ヘビー5&プライム;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&プライム;
RTプライマー配列:ND4 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′
RTプライマー配列:ND5ヘビー5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′
RTプライマー配列:ND5 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′
RTプライマー配列:ND6ヘビー5&プライム;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′
RTプライマー配列:ND6 Light5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCCCC-3′
シリコン処理ポリプロピレン 1.5 mL G-tubeBio Plas4167SLS50
デデシル硫酸ナトリウムBiosesangS1010
デオキシコール酸ナトリウムSigma-AldrichD6750
SUPERase In Rnase 阻害剤サーモフィッシャーサイエンティフィックAM2694
SuperScript III 逆転写酵素サーモフィッシャーサイエンティフィック 18080093ライブラリー調製用逆転写酵素
SuperScript IV 逆転写酵素サーモフィッシャーサイエンティフィック18090010qRT-PCR
SYBR金核酸 gl染色サーモフィッシャーサイエンティフィックS11494
T4 ポリヌクレオチドキナーゼNew England BiolabsM0201S
T4 RNA リガーゼ 1 (ssRNA リガーゼ)New England BiolabsM0204
T4 RNAリガーゼ2、切り捨てられたKQNew England BiolabsM0373
ThermomixerEppendorf ThermoMixer C with ThermoTop
ThymidineSigma-AldrichT9250
Tris-borate-EDTAバッファー(TBE)TaKaraT9122
Triton X-100PromegaH5142
UltralinkプロテインAセファロースビーズサーモフィッシャーサイエンティフィック22810プロテインAビーズ
超音波処理装置バイオラプター
尿素バイオベーシックUB0148
ボルテックスミキサーダイハンサイエンティフィックVM-10
キシレンシアノールシグマ・アルドリッチX4126
γ-32P-ATP (10 μCi/μL、3.3 μM)パーキンエルマーBLU502A100UC
ック ック 用逆転写酵素

参考文献

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