方法論記事

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

DOI：

10.3791/59220

⸱

2019年4月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulo BBB (血液脳関門) の設定を記述したプロトコルをご紹介-Minibrain ポリエステル多孔性膜の文化は人間の BBB にわたって生体分子又は感染性病原体の運搬を評価するためにシステムを挿入、近隣の脳細胞の生理学的な影響は。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

初期に、適切な神経系薬のスクリーニングと cellulo BBB モデル彼らの浸透とバリアと脳実質との相互作用のための信頼性の高い、まだ満たされていない必要があります。このギャップを埋めるためには、人間の脳細胞 (ニューロン、アストロ サイト、ミクログリア細胞) のトリ文化によって形成される多孔質膜文化挿入人間 BBB モデル、Minibrain ポリエステルを組み合わせることにより BBB-Minibrain、cellulo モデルで 2 D を考案しました。BBB Minibrain ニューロンにこの分子の特定の目標を決定して後薬の神経保護プロパティが保持されることを示すため、BBB 通過神経保護薬候補者 (例えば、Neurovita) の輸送をテストします。薬は、BBB を越えていた。我々 はまた、BBB Minibrain が血管内皮細胞の境界を越えたウイルス粒子の通過を検出するなる神経侵入型ウイルス粒子によって、Minibrain の感染を監視するための興味深いモデルを構成することを実証しました。BBB Minibrain は、信頼性の高いシステム、治療または侮辱後細胞培養技術で訓練を受けたと脳細胞の表現型の予測は研究者の扱いやすいです。2 倍になる cellulo テストにそのような関心: 医薬品開発の早い段階で手順を一方で derisking とその一方でテストの動物の使用を減らすことを紹介します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脳は、脳実質と血液脳関門 (BBB) と呼ばれる血液の交流を制限する非透水性構造で全身循環から区切られます。BBB 脳血管内皮細胞から成る主、アストロ サイト、ミクログリア血管周囲近隣の脳実質の神経細胞と動的に対話します。BBB の 3 つの主要な関数が作成および栄養素、および有毒な傷害からの保護と脳の供給や病原体1、2に貢献する神経機能のイオンの恒常性の維持脳のホメオスタシスとその機能3のメンテナンス。この障壁はのみいくつかの薬が BBB4,5を越えることができるので効率的です。現時点では、分子が BBB を通過し、脳に拡散かどうかを予測する利用可能な方法は MRI (磁気共鳴画像) またはペット (位置排出によって人間のボランティアの脳の剖検材料、画像追跡に関する ex 成ってください。断層レントゲン写真撮影) 薬理学や薬物動態学的臨床研究動物6,7,8。これらの技術とモデル ペットの限られた解像度と MRI6,8、その悪い分子 (すなわち、例えば基づく抗体分子) を定量化する難しさの低感度など制限があります。7脳に浸透し、臨床の研究、高コストと動物実験のリゾート。

最後の点は重要なので、3 r の規則、(代替・削減・動物実験の改良) によると規制行政を求めている動物に科学的に正確な代替緊急開発実験9,10、11,12,13,14,15。

最後の十年にわたって BBB のいくつかの生体外モデルが提案されている16,17,18フィルターで栽培によって膜内皮細胞をマウス、ラット、ウシ、ブタなどの異なる種から挿入します。一次電池の不足と困難の可用性が不死化脳血管内皮細胞およびひと由来幹細胞19,20に基づく人体モデルを開発する研究者を求め人間の種に関する限り、 21。これらの障壁は、BBB の適切な in vitro におけるサロゲート血管内皮細胞マーカー、タイト結合マーカー、排出トランスポーター、溶質のキャリア、受容体、表現される内皮刺激20に対応。血管内皮細胞と他の細胞型 (すなわち、アストロ サイト、ニューロンまたはペリサイト22,23,24) コーティング フィルター膜挿入を使用していくつかの BBB モデルを評価した.これらの共培養の目標は、アストロ サイト/ニューロンまたはペリサイトによって可溶性因子の分泌を利用して BBB の物理的特性を上げることでした。

それにもかかわらず、これらのモデルのどれも研究し、バリアを通過したら医薬品候補の運命を予測する脳実質が含まれていません。したがって、私たちの目標で cellulo を構築することでした血液/脳インターフェイス、BBB-Minibrain、1 つのキットに BBB モデルと混合脳細胞の培養を組み合わせることで。BBB Minibrain multiwell 細胞培養プレートのウェルに挿入された多孔質フィルターから成る文化システムを使用します。フィルターは、BBB を形成する BBB 薬物25,26,27, 信頼性の高い証明されている人間の脳血管内皮細胞ライン hCMEC/D3 セルでコーティングされています。Minibrain と NTera/Cl2.D1 セル行28,29由来アストロ サイト混ぜて人間小グリア細胞系に対応した比 CHME/Cl530人間ニューロンの分化共同文化である、31脳のニューロン アストロ サイト比対ミクログリアは、プレートの底にも栽培されています。

BBB と実質内に彼らの運命の間で薬の通路を勉強以外 cellulo モデルにおける血液脳インターフェイスは、脳 (neuroinvasiveness)、(neurotropism) 脳への分散に病原体のエントリに対処するための強力なツール毒性 (神経毒性) 脳実質細胞を出すことができます。神経毒性と neuroinvasiveness の研究は、効率的な cellulo モデルでの開発のメリットし、動物モデルを置き換えるに有利であります。BBB Minibrain キット32を使用すると、準備するために使用黄熱病ウイルス (すなわち、FNV YFV33,34) のフランス語神経親和性ウイルス株に蓄積された珍しいのウイルス変異体のなる神経侵入型表現型デモンストレーションを行った、YFV 生ワクチンと (呼ばれるネバダ州として今後原稿で) Neurovita35と呼ばれる発信と神経生体分子の通過を中止しました。NV どちらも当然のことながら細胞膜を交差させるも、BBB、ネバダ州は BBB を含む生体膜を交差し貫通分子 (CPM)36セルとして機能するラマの一本鎖抗体の可変部分 (VHH) と融合しました。VHH の CPM プロパティは、等電点と VHH37の長さに依存するようです。

Cellulo テストでこれは実施薬物動態と薬効動態解析、動物と理想的に神経系での挙動を予測することができる同時に前に BBB のクロスが潜在的分子をソートできますください。実質。このシステムは生物学的関連を設定および細胞培養26,29,30,38のよく訓練された専門家によって処理する簡単です。Cellulo テストのような関心は 2 倍になる: 一方で前臨床テストのコストを削減し、その一方で動物実験の使用を減らします。

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プロトコル

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1 Ntera/CL2 の細胞培養作業。D1 ポスト mitotic の hNeurons と hAstrocytes (NT2 N/A) の混合培養を準備するには

注: これは Minibrain (図 1) のコンポーネントです。

  1. 養殖、Ntera/Cl2.D1
    1. 液体窒素タンクから凍結細胞のバイアルを削除します。氷の上を保ちます。
    2. 37 ° C の水浴で急速に細胞を解凍します。
    3. 完全 F12 DMEM 培地 10 mL を含む 15 mL チューブ内のセルを転送 (ダルベッコ変更イーグル培地: 栄養混合物 F-12 媒体) 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 mM グルタミン、100 IU ペニシリン 100 μ g ストレプトマイシンと補われる (すなわち、完了DMEM F12 中)。
    4. 200 x g (RT) 室温で 5 分間遠心します。完全 F12 DMEM 培地 2 mL にペレットを切り離して考えます。
    5. 機密性の高い付着性のセルのための特定の治療でポリスチレンのコート t75 フラスコ培養フラスコで転送 (T75Cell+) 13 mL 完全 F12 DMEM 培地を含みます。
    6. 37 ° C、5% CO2湿度 95%、90% 合流まで維持インキュベーターで細胞の培養 (すなわち、約 5 日以内)。2-3 日毎に媒体を変更します。
  2. Subculturing Ntera/Cl2.D1 と増幅
    1. フラスコからメディアを削除します。
    2. リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) を Ca2 +と Mg2 +を添加した 10 mL でセル単一層をすすいでください。
    3. (常温保存) EDTA 溶液の 10 mL でセル単一層をすすいでください。
    4. 3 mL のトリプシン-EDTA 溶液 (0.05% トリプシン、0.02 %edta) を追加し、室温の 2 分を孵化させなさい
    5. フラスコを振るし、セルは、プラスチックの表面から分離されるかどうかを確認します。
    6. トリプシンを不活化、15 mL の管、室温 200 x gで 5 分間遠心転送完全 DMEM F12 培地 10 mL を追加します。
    7. 10 ml の完全培地のペレットを分離し、完全 F12 DMEM 培地の 14 mL を含む各新しいフラスコを接種する 1 mL を使用します。
      注: 30 コート t75 フラスコ細胞+フラスコごとの分化に必要です。
    8. 90% の合流点までは、37 ° C、5% CO2湿度 95% でフラスコを孵化させなさい。
  3. NTera/Cl2.D1 の人間ニューロン ・ グリア共培養における差別化
    注: これは、Minibrain の主要なコンポーネントです。
    1. 0 日でトリプシン-EDTA 1.2 の手順で説明するように細胞を分離し、完全 F12 DMEM 培地 2 mL で各フラスコ細胞ペレットを切り離して考えます。
    2. 11 mL 完全 F12 DMEM 培地を含む直径 85 mm の 60 のプラスチック シャーレに 1 mL の細胞懸濁液 (5 x 10 の6セルに対応する) を追加します。
      注: セルはプラスチックに添付しません、フォーム擬似神経幹細胞 (図 1の下のパネルで写真参照) に集計されます。1 日 37 ° C、5% CO2湿度 95% で 60 のペトリ皿を孵化させなさい。
    3. 日 1 で完全な DMEM F12 培すべてオールトランスレチノイン酸 (ATRA) ペトリ皿 (最終濃度 ATRA 10 μ M) あたりの 130 μ m の 1 つの mL を追加し、37 ° C、5% CO2と 24 h の湿度 95% で料理を返します。
    4. 一日 2, 非常に慎重に慎重に 13 ml の 10 μ m ATRA 完全な F12 DMEM 培の緩やかなペレットの各 Petri Dish 50 mL のチューブで 50 x gで 10 分間遠心すると RT。 Dissociate 細胞球を含む培地を転送し、回を追加e 新しい 85 ミリメートル径シャーレ 13 mL。
      注: 異なる箇所をだ (すなわち、約 70% の密度) に一日 2 で得られた密度高い球の密度を維持するために非常に重要であります。したがって、球の密度を下げる場合は、セルの数によるとペトリ皿の総数を減らします。
    5. 4、6、8 日 (ステップ 1.3.4) は、上記の手順を繰り返します。
    6. 1 日 10 分で、上記の手順を繰り返しますが球をシャーレの代わりにコート t75 フラスコ細胞+フラスコに追加されます。1 つのシャーレから 1 コート t75 フラスコ細胞+フラスコにセルを追加します。
    7. 日 11、13、15、17、10 μ m ATRA 補われる完全な DMEM F12 14 mL で使用される媒体を変更します。
    8. 日 19 14 ml のフラスコあたり ATRA なし完全 F12 DMEM 培地の培地を変更します。
    9. 一日 20 分、「優しくトリプシン edta/セルとおり」と分離します。
      1. 各コート t75 フラスコ細胞+フラスコ 10 ml の Ca2 +と Mg2 +; 補われる PBS のセルをすすいでください。4 ml の EDTA の右で 5 分間細胞をインキュベートします。
      2. EDTA を慎重に削除しトリプシン-EDTA の 2 mL を加えると右シェイク フラスコでは非常に穏やかで 7 分間インキュベートし、完全 F12 DMEM 培地の慎重に 8 mL を追加します。
      3. Gおよび RT × 160 分間遠心 10 は、13 mL 完全 F12 DMEM 培地で細胞ペレットとコート t75 フラスコ細胞+フラスコで転送を切り離して考えます。
        注: トリプシン-EDTA と非常に穏やかな解離は、プラスチックの食器に強く接続されている元のテラトーマ細胞から細胞を分化、ATRA を回復できるようなります。
    10. 日 21 媒体と死んだ細胞を削除します。14 ml 5% 完了 F12 DMEM 培の FBS、2 mM グルタミン、100 IU ペニシリン、100 μ g ストレプトマイシン、AraC (シトシン β D アラビノ) の 0.5 μ M (5% 完了 FBS DMEM F12 AraC)。
    11. 日 23、25、28 日で置換使用中 14 ml の 5% の FBS DMEM F12 AraC。
    12. 49 (2 日間) まで日 29, 置換使用中 14 ml 5% ウシ胎児血清、2 mM グルタミン、100 IU ペニシリン、100 μ g ストレプトマイシン、FudR (5-フルオロ-2' デオキシウリジン) の 5 μ M、10 μ M と完全な DMEM F12 培のウルド (ウリジン) (完全な 5%FBS DMEM f12 キー-FudR-ウルド)。
    13. 日 50、14 ml 5 %fbs、2 mM グルタミン 100 IU ペニシリン、完全な DMEM F12 培の使用置換中で 10 μ M と 100 μ g ストレプトマイシン ウルド (5% 完了 FBS DMEM F12 ウルド)。
    14. 日 51 95 (週 2 回) まで、置換使用中 14 ml の完全な 5% FBS DMEM F12 ウルド。
      注: セル日 51 から実験のため使用がない日 95 以降を使用できます。シリアル処理有糸分裂阻害剤の使用ポスト mitotic の hNeuron と hAstrocytes (NT2 N/A) の混合培養の純粋な人口を回復することができます。
    15. セルをシードするには、日 20 のとおり優しい trypsinization を進めます。

2. 細胞文化仕事人間ミクログリアの細胞 CHME/Cl5

注: これは、Minibrain のミクログリア コンポーネント(図 1).

  1. CHME/Cl5 養殖人間ミクログリア細胞します。
    1. 液体窒素タンクから凍結細胞のバイアルを削除します。氷の上を保ちます。
    2. 37 ° C の水浴中に急速に解凍します。
    3. 100 μ g ストレプトマイシン (すなわち、完全な 5% FBS DMEM F12 中) 100 IU ペニシリン、2 mM グルタミン 5% ウシ胎児血清を添加した完全 DMEM F12 培地 10 mL を含む 15 mL チューブ内のセルを転送します。
    4. 完全 5% FBS DMEM F12 培地 2 mL にペレット 200 x g右 Dissociate で 5 分間遠心します。
    5. 完全 5% FBS DMEM F12 培地の 13 mL を含むコート t75 フラスコ細胞+フラスコに転送できます。
    6. 37 ° C、5% CO2 90% 合流まで湿度 95% で培養細胞。2-3 日毎に媒体を変更します。
  2. 人間のミクログリア細胞 CHME/Cl5 を subculturing
    1. フラスコからメディアを削除します。
    2. 10 ml の Ca2 +と Mg2 +を添加した PBS のセルの単一層をすすいでください。
    3. (常温保存) EDTA 溶液の 10 mL でセル単一層をすすいでください。
    4. トリプシン-EDTA 溶液 3 mL を追加し、室温の 2 分を孵化させなさい
    5. フラスコを振るし、セルは、プラスチックの表面から分離されるかどうかを確認します。
    6. トリプシンを不活化、15 mL の管、 gおよび RT × 200 で 5 分間遠心転送完全 5% FBS DMEM F12 培地 10 mL を追加します。
    7. 10 ml の完全培地のペレットを切り離して、1 mL を使用して、完全な 5% FBS DMEM F12 媒体の 14 mL を含む各新しいフラスコを接種します。
    8. 90% の合流点までは、37 ° C、5% CO2湿度 95% でフラスコを孵化させなさい。

3. 文化多孔質挿入をコートし、BBB を準備する hCMEC/D3 の仕事

  1. 培養内皮細胞 hCMEC/D3 (図 2)
    1. 1:30 無菌純水 (細胞培養グレード) にコラーゲンをラット型を希釈します。
    2. コート t75 フラスコ細胞+フラスコ 10 mL を転送し、37 ° C、5% CO2と 95% 湿度インキュベーター 2 h を孵化させなさい。
    3. コラーゲン溶液を削除し、10 mm HEPES (完全な内皮細胞培地と呼ばれる) の内皮細胞培 15 mL で置き換えます。
    4. 液体窒素タンクから細胞の低温電子顕微鏡バイアルを削除します。氷の上を保ちます。
      注: セルは育ったと前述の製造元によって種子の多くが作られました。細胞は、生物学的物質移動合意によって覆われています。セルは、通路番号 25 で得られる、通路 35 以上は使用しないでください。
    5. 37 ° C の水浴中に急速に解凍します。
    6. コート t75 フラスコ細胞+フラスコ内のセルを転送し、37 ° C、5% CO2 2 に 4 h の湿度 95% でフラスコを返します。
    7. 媒体を慎重に失うまたはセルを削除せず削除します。完全な内皮細胞培地 10 mL で一度セルをすすいでください。
    8. 完全な内皮細胞培地 15 mL を加えます。
    9. 37 ° C、5% CO2および媒体を変更することがなく 100% 合流 (4 日以上) まで湿度 95% で培養細胞。
  2. BBB の挿入を準備する hCMEC/D3 を subculturing
    1. 新しいコート t75 フラスコ細胞+フラスコをコートするか、挿入型と私ラットのコラーゲン (ステップ 3.1) 上記のよう。
    2. フラスコからメディアを削除します。10 ml の Ca2 +と Mg2 +を添加した PBS のセルの単一層をすすいでください。
    3. トリプシン-EDTA 溶液 2 mL を加えて、37 ° C で 5 分間加温
    4. フラスコを振るし、セルがプラスチックの表面から完全に切り離されたことを確認してください。
    5. トリプシンを不活化する完全な血管内皮細胞用培地 4 mL を追加します。
    6. 5 mL プラスチック ピペットで機械的に吸引し、フラスコの底に 5 mL ピペットに少なくとも 5 回を維持しながら細胞懸濁液をフラッシュでセルを切り離して考えます。
    7. セルをカウントし、使用 5 x 10 の4セル/12 もポリエステル膜文化の挿入は挿入とコート t75 フラスコ細胞+フラスコの 2 × 106セルを挿入します。ポリエステル膜培養インサート付き PELy (すなわち、4.2 の段落の下の黄色ルシファー見る内皮細胞透過) 実験用セルなしも 3 つのフィルターを準備します。
    8. 100% 合流までフラスコまたは 37 ° C、5% CO2湿度 95% での挿入を孵化させなさい。
    9. 新しい通路までコート t75 フラスコ細胞+フラスコの培地を変更しないでください。一方ポリエステル膜文化を BBB を挿入: 2 と 4 日に媒体を変更、6 日目の実験のため、BBB を使用します。

4. 施工と BBB Minibrain (図 2) の品質管理

  1. BBB Minibrain ポリエステルを設定膜文化挿入デバイス (図 2 b)
    1. 12 hCMEC/D3 セルをよくポリエステル成長膜培養実験のためにそれらを使用する前に血管内皮細胞用培地に 6 日間のフィルターを挿入します。
    2. ポリ D リジン (1 mL/まあ、10 μ g/mL、RT で 4 h)、ラミニン (1 mL/まあ、一晩常温 1 μ g/mL) と 12 ウェル プレートをコートします。
    3. ラミニンを削除し、5% を添加した内皮細胞培地 1 mL を追加 FBS (5% の内皮細胞培地)。
    4. 37 ° C、5% CO2湿度 95% で 1 時間インキュベートします。
    5. 軽く trypsinize NT2 N/A (前述の手順 1.3.9 で) と CHME/Cl5 (前述の手順 2.2 で)、完全な内皮細胞培地で細胞ペレットを切り離して考えます。
    6. 0.4 x 10 の5 CHME/Cl5 細胞/ウェルと種子、12 ウェル プレート、ミックス 3.6 x 105 NT2 N/A セルをカウントします。
    7. T = 24 h (播種後 24 h): 新鮮な完全な血管内皮細胞用培地 (Minibrain 細胞と血管内皮細胞) で使用される媒体を変更し、Minibrain 細胞の上に hCMEC/D3 ポリエステル膜文化挿入フィルターを転送します。37 ° C、5% CO2湿度 95% で BBB Minibrain を孵化させなさい。
      注: BBB Minibrain から成っている層、内皮細胞 hCMEC/D3 内腔コンパートメント (または「血」コンパートメント) を分離するフィルターのひと細胞 hNT2 N/A とも定義の下部 (Minibrain) を hCHME/Cl5 の混合培養のabluminal コンパートメント (または「脳」コンパートメント) (図 2 b)。
  2. BBB Minibrain (品質管理) (図 2) の血管の透過性の検証
    1. Ca2 +と Mg2 + 10 mM HEPES と 1 mM ピルビン酸ナトリウムを添加した HBSS (ハンクス平衡塩溶液) バッファー トランスポート バッファー (TB) を準備します。
    2. ウェルあたりの転送バッファーの 1.5 mL で 12 ウェル プレートを準備します。
    3. T = 0 で作る新鮮なルシファー黄色 (LY TB) 50 μ M を添加したトランスポートのバッファー。
    4. 内皮細胞障害に影響を与えずに慎重にメディアを取り出して逆さまに各フィルターを反転します。
    5. いっぱい 12 ウェル プレートに、フィルターを配置し、0.5 mL LY TB を追加します。
    6. 37 ° C、5% CO2湿度 95% でインキュベーターの版を孵化させなさい。
    7. T = 10 分転送新しい TB のフィルター 12 ウェル プレートをいっぱいし、OD の読書のための最初のプレートの abluminal コンパートメントを維持します。
    8. T = 25 分、4.2.7 の手順を繰り返します。
    9. T = 45 分、プレートからフィルターを削除することによって輸送を停止します。Abluminal と OD 対策の内腔のコンパートメントを維持します。
    10. 暗い 96 で転送ディープウェル プレート サンプル: abluminal コンパートメントのサンプルを 200 μ l 添加 LY TB と内腔のコンパートメントの 190 μ L TB 10 μ L。
    11. LY TB の蛍光を測定 λ428 nm λ535 nm の異なるサンプルに存在 (それぞれ波の励起と放射の長さ)。
    12. LY TB (PeLY) を Siflinger Birnboim、A ら (1987)39ダ ・ コスタ、数式を使用して A ら (2018)34に従ってに向かって血管内皮の透過性 (Pe) を計算します。
      1/PSe = (1/PSt)-(1/PSf) と PeLY= PSe/s.
      注: PSf はセルなしフィルターの透過性、PSt はセルが付いているフィルターの透過性、PSe は S 単分子膜の表面は、単分子膜の表面の内皮膜時間の透磁率 (12 よくフィルター = 1.12 cm2)、PeLYは cm/分で表されます。HCMEC/D3 PeLYは、0.7 から 1.2 × 10 の間する必要があります実験で-3 cm/分に応じて、FBS の主に使用。重要: PeLY 1.2 では BBB が十分にタイトではない、いくつかの漏れを確認することができますよりも高い。これらの障壁を破棄します。

5. 黄熱ウイルス ワクチン サンプル、フランス語神経親和性ウイルス YFV FNV 34 (図 3)で神経侵襲性のウイルス粒子の存在を強調する BBB Minibrain の利用

  1. BBB の交差と、Minibrain で黄熱ウイルスの増殖
    1. 4.1.7 24 h ウイルスの付加の前に、のステップで説明されている BBB Minibrain を使用します。2 %fbs 内皮細胞培地による媒体を交換してください。
      注: ウイルスを追加する前にだけ媒体を変更することを避けるために非常に重要です。媒体を変更することで、内皮細胞をアクティブにし、一過性ウイルスの通過を許可する障壁を開きます。ここでメディアが実験を開始する前に 24 時間が変更されます。
    2. T = 0 で 3500 プラーク形成単位 (PFU) YFV FNV の希釈 2% を 50 μ l 添加の内腔のコンパートメントの上に非常に慎重に FBS 血管内皮細胞用培地を追加します。BBB Minibrain コントロールは、ウイルスなし 2 %fbs 内皮細胞培地の 50 μ L と再接種されます。コンパニオンにも PeLYを決定します。
    3. BBB-Minibrain 37 ° C、5% CO2湿度 95% でインキュベーターで孵化させなさい。
    4. 24 h 後ポリエステル膜文化挿入フィルター デバイスを削除、PeLY、abluminal コンパートメントから 1 mL のサンプルを確認し、A. ダ コスタら (2018)34のとおりウイルスを滴定しなさい。新鮮な 2 %fbs 内皮細胞培地でメディアを交換してください。
    5. 37 ° C、5% CO2湿度 95% で BBB Minibrain を孵化させなさい。
    6. 72 時間後 abluminal コンパートメントから媒体のサンプルおよびウイルスを滴定しなさい A. ダ コスタら (2018)34のとおり遺伝子発現解析のための Minibrain 細胞から RNA を抽出します。
  2. シリアル通路による Minibrain 細胞の YFV FNV の神経親和性のバリエーションの増幅
    1. 使用 Minibrain 細胞は、12 ウェル プレート (すなわち、手順 4.1.6 および 4.1.7) をコーティングしました。
    2. 時間 0 h ポイント 3,500 プラーク形成単位の YFV-FNV (内腔コンパートメント) のセルの上に非常に慎重に 2 %fbs 内皮細胞培地の 50 μ L で希釈を追加します。
    3. 1 h 後ウイルスの接種材料と媒体を削除し、新鮮な 2 %fbs 内皮細胞培地で置き換えます。
    4. 48 時間後培養液 500 μ L をサンプルし、新鮮な Minibrain の細胞に感染します。
    5. 120 時間後培養液 500 μ L をサンプルし、新鮮な Minibrain の細胞に感染します。
    6. 192 h 後培地 (= 濃縮ウイルス ストック) を保存し、遺伝子発現解析 A. ダ コスタら (2018)34で説明されているように Minibrain 細胞から RNA を抽出します。

6. BBB 交差や脳細胞、生体分子の標的を研究する BBB Minibrain の使用

  1. 生体分子をターゲットとニューロンの BBB 経由で転送します。
    1. Minibrain-bbb ランクの説明ステップ 4.1.7 として準備を使用します。
    2. 0 h の時点で生体を追加 (例では、BBB Minibrain あたり追加された 58.75 ng/BBB 細胞側の透過物 NeuroTag NV 分子の結果セクションで提供を挿入します。
    3. 37 ° C、5% CO2湿度 95% で BBB Minibrain を孵化させなさい。
    4. 24 h 後ポリエステル膜文化挿入フィルター デバイスを削除し PeLYを決定し、hNeurons ニューロ フィラメント Nf200 の Minibrain 細胞を染色し、(結果に提供の例で Minibrain で、生体分子の存在を検出セクション、NeuroTag NV が検出されました連鎖球菌性タグに対して指示される抗体を用いた35,40が含まれている)。
  2. 生体は、BBB を交差している後発信の生体分子とその後神経、Minibrain のアッセイの BBB 経由で転送します。
    1. 4.1.7 のステップで説明されている Minibrain BBB を使用します。
      注: 分子神経細胞のみをターゲット、Minibrain 細胞はニューロン細胞 (NT2 N) のみ38で交換できます。
    2. 0 h の時点で ng/BBB-Minibrain 58.75 よくセル側の透過物 NV 分子の (アクティブなフォーム CPM NeuroTag NV、非アクティブなフォーム CPM NeuroTag NVΔ) c. Prehaud ら (2014)35で記述を追加します。
    3. BBB-Minibrain 37 ° C、5% CO2湿度 95% でインキュベーターで孵化させなさい。
    4. 注射針で個々 の傷をする 4 h 後 (26GX1/2"、12-4.5、テルモ、ベルギー) Minibrain 細胞。よく個々 のそれぞれに、少なくとも 10 の傷を確認します。仲間にも PeLYを決定します。
    5. BBB-Minibrain 37 ° C、5% CO2湿度 95% でインキュベーターで孵化させなさい。
    6. 8 h 後新鮮な完全な内皮細胞培地による abluminal コンパートメントで媒体を交換します。
      注: 細胞死、細胞毒性物質のリリースにつながることができます Minibrain 細胞を傷つけるので、この段階でメディアを交換することが重要です。
    7. BBB-Minibrain 37 ° C、5% CO2湿度 95% でインキュベーターで孵化させなさい。
    8. 48 時間後、C. Prehaud ら (2013)40のとおり hNeurons の軸索の再生のための細胞を染色しました。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB Minibrain は、の cellulo 実験血液脳インターフェイスのモデル。

BBB Minibrain は、上階の血物入れと血液脳インターフェイス (図 2 a、B) のより低いレベルで脳を模倣するポリエステル膜文化挿入システムに設定されます。BBB を成形フィルター hCMEC/D3 の内皮細胞と内腔コンパートメントと脳細胞 (ニューロン、アストロ サイト、ミクログリア細胞) の Minibrain 人間トライ-文化を含んだ abluminal コンパートメントで構成されています。Minibrain 細胞の古典的なトリ文化の人口の表現型 (図 1、右下のパネル)、ダ ・ コスタ A. et al., 2018年34<...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事での cellulo を構築する方法を行った血液/脳インターフェイス、BBB-Minibrain、BBB モデルとの文化を組み合わせた混合脳脳細胞 (Minibrain) 1 つのキットに。このシステムは生物学的に関連するを設定し、細胞培養でよく訓練された実験者のための処理しやすいです。

任意他の in vitro モデルとして BBB のバリアの気密性の抜本的な制御を適用した場合に信頼性の高い結果が得でしょう。挿入は、透磁率および不十分な透磁率値 (すなわち、PeLY 1.2 以上) を持つ任意の挿入を破棄するか、慎重にテストする必要があります。

FBS サンプルは、BBB の特性が無効にしないバッチを識別するために慎重にテストする必要があります。どのウイルスの粒子や生体関連物質を希釈車両媒体に関する同じアドバイスを行うことができます。また、内腔のコンパートメントの中の構成を変更するために生体分子またはウイルスの懸濁液の量を可能な限り小さく維持することをお勧めします。Ntera/CL2 から人間...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

システムの知的財産権は、 32、 35と38で参照されている特許をだった。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、パスツール研究所にサノフィパス ツール社によって Incitative グラント (PTR 435) を含むパスツール研究所からの内部補助金、助成金「契・ ステンカラー併設ラ フランス」提供を支えられました。A. ダ コスタは、サノフィパス ツール社グラントとフロリアン Bakoa によって支持された、ANRT によって提供される博士の補助金の受信者 (協会ナシオナル デ ラ ルシェルシュ エ デ ラ テク)。役に立つ議論のため Pr ピエール オリビエ Couraud と Dr フィレンツェ ミラーにお世話になっております。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12ウェルプレートCorning3336
5-fluoro-2'デオキシウリジンメルクシグマ アルドリッチF0503
85mm ペトリ皿サルスタット83-3902-500
アンチ Nf200メルクシグマ アルドリッチN4142
&ベータ - メルカプトエタノールメルクシグマ アルドリッチM3148
CHME/Cl5ユニット é de 神経免疫学 Virale博士ラフォン
CMCCalbiochem217274
Cytosine β-D-arabinofuranosideMerck-Sigma AldrichC1768
Dark 96 well platesCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004内皮細胞培地
エタノールカルロ・エルバ529121
FBSHycloneSV30015-04
ホルムアルデヒドメルク・シグマ・アルドリッチ252549
GIEMSARAL 診断320310
ヤギ・アンチ・マウスジャクソン・イムノ・リサーチ115-545-003
ヤギ・アンチウサギサーモフィッシャーScientificR37117
HBSS with Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-グルタミンサーモフィッシャー サイエンティフィ25030-024
ルシファー イエローメルクシグマ アルドリッチL0259
MEM 10Xサーモフィッシャー サイエンティフィック21430
MEM 1Xサーモフィッシャー サイエンティフィック42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
パラホルムアルデヒド電子顕微鏡 科学15714
Ca2+-Mg2+サーモフィッシャーサイエンティフィ14190
PBS-Ca2+-Mg2+サーモフィッシャーサイエンティフィ14040-091
ペン/連鎖球菌バイオCXXPES00-07
-d-リジンクシグマアルドリッチP1149
ロングゴールドサーモフィッシャーサイエンティフィックP36930
QiashredderQIAGEN79656
ラットコラーゲンICultrex3443-100-01
チノイン酸オールトランスクシグマアルドリッチR2625
RNA精製キットQIAGEN74104
SDSメルクシグマアルドリッチL4509
重炭酸ナトリウム5.6%ユーロバイオCXXBIC00-07
ピルビン酸ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィック11360
T75 セル+フラスコSarstedt83-1813-302敏感な接着細胞のための特定の表面処理(セル+)を施した組織培養ポリスチレンフラスコ
トランズウェルコーニング3460ポリエステル多孔質膜培養インサート
トリプシン-EDTAメルクシグマ アルドリッチT3924
超純水サーモフィッシャーサイエンティフィ10977-035
リジンメルクシグマアルドリッチU3750
バーセンサーモフィッシャーサイエンティフィック15040-033EDTA
YFV-FNVIPダカールワクチンバイアル
へのリクエストに応じてック ックックユーロポリメルレメルックウ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37(2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671(2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408(2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

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