Cellulo BBB (血液脳関門) の設定を記述したプロトコルをご紹介-Minibrain ポリエステル多孔性膜の文化は人間の BBB にわたって生体分子又は感染性病原体の運搬を評価するためにシステムを挿入、近隣の脳細胞の生理学的な影響は。
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方法論記事
病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
初期に、適切な神経系薬のスクリーニングと cellulo BBB モデル彼らの浸透とバリアと脳実質との相互作用のための信頼性の高い、まだ満たされていない必要があります。このギャップを埋めるためには、人間の脳細胞 (ニューロン、アストロ サイト、ミクログリア細胞) のトリ文化によって形成される多孔質膜文化挿入人間 BBB モデル、Minibrain ポリエステルを組み合わせることにより BBB-Minibrain、cellulo モデルで 2 D を考案しました。BBB Minibrain ニューロンにこの分子の特定の目標を決定して後薬の神経保護プロパティが保持されることを示すため、BBB 通過神経保護薬候補者 (例えば、Neurovita) の輸送をテストします。薬は、BBB を越えていた。我々 はまた、BBB Minibrain が血管内皮細胞の境界を越えたウイルス粒子の通過を検出するなる神経侵入型ウイルス粒子によって、Minibrain の感染を監視するための興味深いモデルを構成することを実証しました。BBB Minibrain は、信頼性の高いシステム、治療または侮辱後細胞培養技術で訓練を受けたと脳細胞の表現型の予測は研究者の扱いやすいです。2 倍になる cellulo テストにそのような関心: 医薬品開発の早い段階で手順を一方で derisking とその一方でテストの動物の使用を減らすことを紹介します。
概要
脳は、脳実質と血液脳関門 (BBB) と呼ばれる血液の交流を制限する非透水性構造で全身循環から区切られます。BBB 脳血管内皮細胞から成る主、アストロ サイト、ミクログリア血管周囲近隣の脳実質の神経細胞と動的に対話します。BBB の 3 つの主要な関数が作成および栄養素、および有毒な傷害からの保護と脳の供給や病原体1、2に貢献する神経機能のイオンの恒常性の維持脳のホメオスタシスとその機能3のメンテナンス。この障壁はのみいくつかの薬が BBB4,5を越えることができるので効率的です。現時点では、分子が BBB を通過し、脳に拡散かどうかを予測する利用可能な方法は MRI (磁気共鳴画像) またはペット (位置排出によって人間のボランティアの脳の剖検材料、画像追跡に関する ex 成ってください。断層レントゲン写真撮影) 薬理学や薬物動態学的臨床研究動物6,7,8。これらの技術とモデル ペットの限られた解像度と MRI6
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プロトコル
1 Ntera/CL2 の細胞培養作業。D1 ポスト mitotic の hNeurons と hAstrocytes (NT2 N/A) の混合培養を準備するには
注: これは Minibrain (図 1) のコンポーネントです。
- 養殖、Ntera/Cl2.D1
- 液体窒素タンクから凍結細胞のバイアルを削除します。氷の上を保ちます。
- 37 ° C の水浴で急速に細胞を解凍します。
- 完全 F12 DMEM 培地 10 mL を含む 15 mL チューブ内のセルを転送 (ダルベッコ変更イーグル培地: 栄養混合物 F-12 媒体) 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 mM グルタミン、100 IU ペニシリン 100 μ g ストレプトマイシンと補われる (すなわち、完了DMEM F12 中)。
- 200 x g (RT) 室温で 5 分間遠心します。完全 F12 DMEM 培地 2 mL にペレットを切り離して考えます。
- 機密性の高い付着性のセルのための特定の治療でポリスチレンのコート t75 フラスコ培養フラスコで転送 (T75Cell+) 13 mL 完全 F12 DMEM 培地を含みます。
- 37 ° C、5% CO2
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結果
BBB Minibrain は、の cellulo 実験血液脳インターフェイスのモデル。
BBB Minibrain は、上階の血物入れと血液脳インターフェイス (図 2 a、B) のより低いレベルで脳を模倣するポリエステル膜文化挿入システムに設定されます。BBB を成形フィルター hCMEC/D3 の内皮細胞と内腔コンパートメントと脳細胞 (ニューロン、アストロ サイト、ミクログリア細胞) の Minibrain 人間トライ-文化を含んだ abluminal コンパートメントで構成されています。Minibrain 細胞の古典的なトリ文化の人口の表現型 (図 1、右下のパネル)、ダ ・ コスタ A. et al., 2018年34<.......
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ディスカッション
この記事での cellulo を構築する方法を行った血液/脳インターフェイス、BBB-Minibrain、BBB モデルとの文化を組み合わせた混合脳脳細胞 (Minibrain) 1 つのキットに。このシステムは生物学的に関連するを設定し、細胞培養でよく訓練された実験者のための処理しやすいです。
任意他の in vitro モデルとして BBB のバリアの気密性の抜本的な制御を適用した場合に信頼性の高い結果が得でしょう。挿入は、透磁率および不十分な透磁率値 (すなわち、PeLY 1.2 以上) を持つ任意の挿入を破棄するか、慎重にテストする必要があります。
FBS サンプルは、BBB の特性が無効にしないバッチを識別するために慎重にテストする必要があります。どのウイルスの粒子や生体関連物質を希釈車両媒体に関する同じアドバイスを行うことができます。また、内腔のコンパートメントの中の構成を変更するために生体分子またはウイルスの懸濁液の量を可能な限り小さく維持することをお勧めします。Ntera/CL2 から人間.......
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開示事項
システムの知的財産権は、 32、 35と38で参照されている特許をだった。
謝辞
本研究は、パスツール研究所にサノフィパス ツール社によって Incitative グラント (PTR 435) を含むパスツール研究所からの内部補助金、助成金「契・ ステンカラー併設ラ フランス」提供を支えられました。A. ダ コスタは、サノフィパス ツール社グラントとフロリアン Bakoa によって支持された、ANRT によって提供される博士の補助金の受信者 (協会ナシオナル デ ラ ルシェルシュ エ デ ラ テク)。役に立つ議論のため Pr ピエール オリビエ Couraud と Dr フィレンツェ ミラーにお世話になっております。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 12ウェルプレート | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2'デオキシウリジン | メルクシグマ アルドリッチ | F0503 | |
| 85mm ペトリ皿 | サルスタット | 83-3902-500 | |
| アンチ Nf200 | メルクシグマ アルドリッチ | N4142 | |
| &ベータ - メルカプトエタノール | メルクシグマ アルドリッチ | M3148 | |
| CHME/Cl5 | ユニット é de 神経免疫学 Virale | 博士ラフォン | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | 内皮細胞培地 |
| エタノール | カルロ・エルバ | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| ホルムアルデヒド | メルク・シグマ・アルドリッチ | 252549 | |
| GIEMSA | RAL 診断 | 320310 | |
| ヤギ・アンチ・マウス | ジャクソン・イムノ・リサーチ | 115-545-003 | |
| ヤギ・アンチウサギ | サーモフィッシャーScientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-グルタミン | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 25030-024 | |
| ルシファー イエロー | メルクシグマ アルドリッチ | L0259 | |
| MEM 10X | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 21430 | |
| MEM 1X | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡 科学 | 15714 | |
| Ca2+-Mg2+ | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 14040-091 | |
| ペン/連鎖球菌 | バイオ | CXXPES00-07 | |
| -d-リジン | クシグマアルドリッチ | P1149 | |
| ロングゴールド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| ラットコラーゲンI | Cultrex | 3443-100-01 | |
| チノイン酸オールトランス | クシグマアルドリッチ | R2625 | |
| RNA精製キット | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | メルクシグマアルドリッチ | L4509 | |
| 重炭酸ナトリウム5.6% | ユーロバイオ | CXXBIC00-07 | |
| ピルビン酸ナトリウム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11360 | |
| T75 セル+フラスコ | Sarstedt | 83-1813-302 | 敏感な接着細胞のための特定の表面処理(セル+)を施した組織培養ポリスチレンフラスコ |
| トランズウェル | コーニング | 3460 | ポリエステル多孔質膜培養インサート |
| トリプシン-EDTA | メルクシグマ アルドリッチ | T3924 | |
| 超純水 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 10977-035 | |
| リジン | メルクシグマアルドリッチ | U3750 | |
| バーセン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IPダカール | ワクチンバイアル |
参考文献
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.
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