低酸素/SU5416モデルを用いたマウスにおける肺高血圧の誘導と特徴づけ

サマリー

このプロトコルは、低酸素症への暴露およびVEGF受容体拮抗薬の注射に基づくマウスにおける肺高血圧(PH)の誘導について説明する。動物は、プロトコルの開始から3週間後にPHおよび右心室(RV)肥大を発症する。モデルの機能的および形態的特徴付けも提示される。

要約

肺高血圧症(PH)は、右心カテーテル法によって評価されるように、安静時25mmHgを超える平均肺動脈圧によって定義される病態生理学的状態である。疾患の広いスペクトルは、病因、病理組織病理学、臨床提示、予後、および治療への応答で異なるPHにつながることができます。過去数年間で大きな進歩を遂げたにもかかわらず、PHは未硬化の病気のままです。根本的なメカニズムを理解することは、新しい治療法の開発への道を開くことができます。動物モデルは、この目標を達成するための重要な研究ツールです。現在、PHの再現に使用できるモデルがいくつかあります。このプロトコルは、2 ヒット マウス PH モデルについて説明します。PH開発の刺激は、血管内皮増殖因子(VEGF)受容体アンタゴニストであるSU5416の低酸素および注射である。低酸素/SU5416の開始から3週間後、動物はヒトPH(主に1群)で観察された組織病理学的変化を模倣した肺血管改修を発症する。肺循環における血管の再モデリングは、右心室(RV)のリモデリングをもたらす。RV圧(開胸法を用いた)、RVの形態測定(心室の両方を解剖し、計量すること)および改造の組織学的評価(血管再造形と心臓の両方を評価して、RV心筋細胞肥大および線維症を評価することによって肺)を詳細に説明する。このプロトコルの利点は、野生型と遺伝子組み換えマウスの両方での適用の可能性、比較的容易かつ低コストの実装、および対象疾患の迅速な開発(3週間)である。この方法の制限は、マウスが重度の表現型を発症しないことであり、PHはノルモキシアに戻ると可逆的である。予防は、治療研究と同様に、(外科げっ歯類モデルとは対照的に)高度なスキルの必要性なしに、このモデルで容易に実施することができる。

概要

肺高血圧症(PH)は、右心カテーテル法^,1,2によって評価されるように、平均肺動脈(PA)圧が安静時25mmHgを超える状態で定義される病¹態生理学的状態である。PHに至る病気はさまざまです。PH関連条件を整理する試みとして、いくつかの分類システムが開発されました。現在の臨床分類は、複数のPH関連疾患を5つの異なるグループ¹に分類する。この区別は、患者の様々なグループが臨床提示、病理、予後、および治療²に対する応答において異なる疾患を有するので重要である。表1は、各疾患の基本的な病理的特徴を補完する現在の分類を要約する。

表1:グループ内の主な組織病理学的特徴とともに、PHの臨床分類の概要。低酸素/SU5416プロトコルのモデル化PHに適しています。このテーブルは¹⁹から変更されています....

プロトコル

動物実験の前に、地元の機関動物ケア委員会の認可を得る。現在の実験は、シナイ山のイカーン医学部の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。

1. PH誘導

1. 準備
   1. 研究を始める前に、慎重に実験計画を立ててください。最初のSU5416注射と同時に、マウスが低酸素症に供されることを確認してください。低酸素/SU5416法を用いてPHを誘導するための実験計画の一例を 図1Aに示す。制御マウスは車両のみを受け取った。このモデルでは、SU5416を3週連続で週に1回マウスに注射する。
   2. この研究には8〜12週齢のC57BL/6マウスを使用する。12-hの明暗サイクルで18-20 °Cで動物を収容する。食べ物と水がアクセス可能な アドリビタムであることを確認します。
   3. 動物の重量を量る。ノルモキシアと低酸素/SU5416:各グループにランダムにそれらを割り当てます。
   4. 図1B.安全な窒素(N2)タンクに示すように、₂低酸素室をチャンバー近くに準備します。酸素_(O2)コントローラを10%O2の点にセット₂する。....

結果

本プロトコルでは、マウスにPHを誘導する低酸素/SU5416モデルの作成について詳細に説明する。さらに、観察期間の終わりに肺血管および心臓評価を行うための必要なステップをすべて詳述する。

このモデルの実験計画の概要を、図1A^13,,14に示します。マウスは、ノルモバリック低酸素症(10%O2)₂を受け、週に1回、SU5416を3週連続で皮下注射する。このプロトコルでPHを誘導するために使用される刺激は、図1Bおよび1Cに示されている。

VEGF受容体拮抗薬SU5416は、内皮細胞アポトーシスを引き起こすことによって作用し、したがって、アポトーシス耐性内皮細胞の増殖を可能にする。これは、肺血管系における血管.......

ディスカッション

このプロトコルは、慢性低酸素症とSU5416注射(低酸素/SU5416)18の2つの病理学的刺激を組み合わせることによってマウスの¹⁸PHをモデル化する方法を記述する。このマウスモデルをヒトPH状態と相関させようとする試みにおいて、必然的に現在のPH分類を見なければならない、表1に示す。ほぼすべての形態のPHは、肺血管収縮および内皮および平滑筋細胞の異常増殖によって特徴付けられる。これは肺動脈の圧力の上昇につながり、その結果、右心室の後負荷が増加する。

PHの動物モデルを特徴付けるすべての試みは、肺血管系および右心室の組織病理学的リモデリングの証拠を含むべきである。シングルヒット低酸素マウスモデルは、血管系リモデリング^22、3の軽度の形態に導^きます。これらの病理学的知見には、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞増殖を伴う、以前に非筋肉化血管の筋質化が含まれる。これらの知見は、第2のヒッ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸氷河	ロス	3738.1
アセトン、組織学グレードラボ	デポ	VT110D
ADVantage圧力ボリュームシステム	Transonic	ADV500
Bouinのソリューション	シグマ	Ht10132
灼システム	ファインサイエンスツール	18000-00
接続チューブとバルブ
コットンチップ アプリケーター	Covidien	8884541300
カバースリップ、24 x50 mm	Roth	1871
データ収集と分析	Emka	iox2
ダイレクトレッド 80	シグマ	365548-5G
DMSO (ジメチルスルホキシド)	シグマ アルドリッチ	276855
ドライアイス
デュモン#5鉗子	ファインサイエンスツール	11251-10
モン#7ファイン鉗子	ファインサイエンスツール	11274-20
金型	シグマアルドリッチ	E-6032
エオシン溶液シ	グ	HT110216
エタノール、実験室グレードカ	ロライナバイオロジカルサプライカンパニー	861285
ファストグリーンFCF	シグマ	F7252-5G
ファインハサミ	ファインサイエンスツール	14090-09
ヤギ血清	invitrogen	16210-064
加熱パッド	ゲイマー	T/Pump
ヘマトキシリン 2	サーモサイエンティフィック	7231
低酸素チャンバー	Biospherix	A30274P
誘導チャンバー	DRE Veterinary	12570
挿管カテーテル (静脈内カテーテル SurFlash (20 G x 1") )	テルモ	SR*FF2025
アイリスはさみ	ファインサイエンスツール	14084-08
イソフルラン	バクスター	NDC-10019-360-40
イソフルラン気化器	DRE 獣医	12432
マウス (C57BL/6)	チャールズ リバー
ニードル 25 G x 5/8 インチ	BD	305122
OCT	ティッシュ テック	4583
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	コーニング	21-031-CV
ピリン酸飽和溶液1.3%	シグマ	P6744-1GA
圧力容量カテーテル	ソニック	FTH-1212B-4018
リトラクター	トサイエンティフィック	SURGI-5001
静的酸素コントローラーProOx 360	スフェリックス	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
サージカルテープ	3M	1527-1
シリンジ 10 ml	BD	303134
針付きシリンジ 1 ml	BD	309626
Sytox グリーン ヌクレイン酸染色	Thermo Scientific	S7020
腱切開はさみ	Pricon	60-521
Toluol	Roth	9558.3
ベンチレーター	CWE	SAR-830/P
WGA アレクサ・フルーア	Thermo Scientific	W11261
キシレン	ロス

焼デュ埋め込みマトランスケンバイオ