優れた眼溝の動脈分布胚発生中に可視化

サマリー

ここでは、標準化された一連の優れた眼溝を観察するプロトコルを提案する脊椎動物の目で最近識別される、進化的に保存されている構造。ゼブラフィッシュ幼虫を用いて形成と眼肺尖の閉鎖に寄与する要因を識別するために必要な技術を示します。

要約

先天性眼のコロボーマは、通常不完全な脈絡裂閉鎖に起因する目の下面に裂として注目されている遺伝的疾患です。最近、虹彩、網膜、小説構造の発見につながったレンズの優れた側面に欠損を持つ個人の識別と呼ばれる優れた裂または一過性の背側に存在する優れた眼溝 (SOS)、脊椎動物の目の開発中に光カップの側面。この構造体は、マウス、ニワトリ、魚、イモリを渡って節約は、SOS の私達の現在の理解は限られています。その形成と閉鎖に寄与する要因を解明するためにそれを観察し、SOS の閉鎖の遅れなど、異常を識別することができることが不可欠です。ここでは、私たちは標準化された一連の免疫蛍光染色や mRNA など一般的な分子生物学の技術で広く利用可能な顕微鏡技術を組み合わせることで効率的に SOS を視覚化するために使用できるプロトコルを作成に着手します。過剰発現。この一連のプロトコルは SOS 閉鎖の遅延を観察する能力に焦点を当てて、それは実験者のニーズに適応可能であるし、簡単に変更することができます。全体的に、我々 はを通じて、脊椎動物の目の開発の現在の知識を展開する SOS の私達の理解を進めることができる親しみやすいメソッドを作成してほしい。

概要

脊椎動物の目の形成は、注意深く管弦楽に編曲された細胞間シグナル伝達経路が組織の種類を確立し、地域のアイデンティティ¹指定の非常に節約されたプロセスです。眼の形態形成に対する摂動論に重大な欠陥に目のアーキテクチャと²まばゆいばかりの頻繁。1 つのような病気は眼杯³の腹側で脈絡眼裂を閉じます失敗に起因します。眼のコロボーマとして知られる、この障害は 4 5000 出生数と目^{4の中央に瞳孔から下方に突き出ている鍵穴のような構造としてけんしょう一般、小児失明の原因 3 11% から 1 で発生すると推定されます。 5,6}。脈絡裂の機能は、後に割れ目の両側が船⁷を囲むヒューズ光カップに成長初期の血管のエントリ ポイントを提供することです。

眼のコロボーマは、古代から知られている中、目のスーペリアー/背側面に影響を与える組織の損失を最近小説欠損の患者のサブセットを同定しました。私たちの研究室の最近の研究は、我々 は優れた眼溝 (SOS) または上裂⁸として参照するゼブラフィッシュの背の眼の眼の構造の発見につながっています。構造が溝と割れ目の両方の特性を持っていることに注意してくださいすることが重要です。溝と同様に、鼻腔から一時的な網膜にまたがる継続的な組織の層です。さらに、構造の閉鎖しない基底膜に反対の 2 つの融合による、細胞により、構造が読み込まれます形成プロセスを要求する表示。ただし、割れ目と同様に、それは形作る基底膜と背の眼の鼻および時間的な側面を分離するという構造。一貫性を保つのため我々 が参照してくださいそれを SOS としてこのテキストで。

SOS は脊椎動物、魚、ニワトリ、イモリ、マウス⁸眼の形態形成時に見え間で保存されました。20 〜 60 時間後受精 (hpf) ゼブラフィッシュから存在する脈絡裂と対照をなして SOS 高速な過渡 20 23 hpf から簡単に見えること、欠席 26 hpf⁸で。当研究室における最近の研究は、脈絡裂と同様に、SOS 役割を果たしている目形態⁸血管ガイドで発見しました。形成と SOS の閉鎖を制御する要因は、まだ完全に理解されていないが我々 のデータはパターン化する遺伝子⁸背腹目の役割を強調しました。

ゼブラフィッシュは、SOS を研究する優秀なモデル生物であります。モデル システムとしていくつかの目の開発を勉強の利点を提供します: それは脊椎動物のモデル;各世代展示クマネズ (~ 200 胚);そのゲノム配列されている完全に、遺伝的操作を容易にします。ヒトの遺伝子の約 70% があることを人間の病気^9,10の理想的な遺伝学に基づくモデルに少なくとも 1 つのゼブラフィッシュ細胞。最も重要なは、その開発が行われる外部から母親とその幼虫は透過的、相対的な容易さ¹¹開発の目の可視化が可能です。

この一連のプロトコルでは、ゼブラフィッシュの幼虫で、SOS を視覚化できる手法について述べる。このレポートで使用されている可視化技術のさまざまなは、通常目の開発中に SOS の明確な観測だけでなく、SOS 閉鎖欠陥を検出する能力になります。Gdf6 の調査を特色にする私達の例のプロトコル、BMP は、背側にローカライズされた目と SOS 閉鎖の知られているレギュレータ。さらに、これらの技術は、遺伝的要因や適切な SOS 形成と開閉口挙動に影響を与える薬剤を識別する実験的操作と組み合わせることができます。さらに、我々 含まれている、すべての細胞膜の蛍光イメージングが可能、プロトコル SOS を周囲の細胞形態学的変化を観察する実験者を許可します。私たちの目標は、この新規開発の目の構造に新たな洞察を提供する科学のコミュニティで使用できる標準化されたプロトコルの設定を確立することです。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、アルバータ州動物ケアおよび使用委員会の大学によって承認されています。

1 実体と差動干渉の対照 (DIC) のイメージングを使用して SOS のプロトコル 1: 可視化

1. 胚のコレクション
   1. 脱塩素水のタンクに、女性ゼブラフィッシュと男性ゼブラフィッシュを組み合わせることで夕方には^+/- gdf6aゼブラフィッシュの十字架を準備します。必ず時間の小さな範囲内で胚が誕生していることを確認する分周器を使用して、女性から男性を分離してください。
   2. 次の朝、区分線を引っ張ると 30 分収集ゼブラフィッシュ予約¹²に記載されている E3 メディアでペトリ皿で胚よりももはやのために繁殖するゼブラフィッシュを許可し、28.5 ° C の定温器に入れます。
   3. 未受精卵や死んだの胚は、白と不透明に表示される削除します。
2. 準備とゼブラフィッシュ胚のライブ イメージング
   1. 20 で hpf、E3 メディア含む 0.004 %1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) 色素の生産を防ぐためには、置換 E3 メディア。
      注: 22-24 hpf などの少し後の timepoint に PTU の添加はイメージングの時に胚の早期の年齢のための実験を妨害する可能性があります。しかし、SOS のイメージングを妨げることができます背の眼は、色素沈着のバンドがあるので完全に色素沈着を防ぐために初期胚を治療することをお勧めします。
   2. 観察時間に至るまでのさまざまなポイントで正しい発達段階ですべての胚が確実します。どの体節数はキンメルら¹³のとおり明らかに目に見える段階でこれはそれをお勧めします。ある発達成熟したものを削除します。
   3. 注意深く引いて離れて微細鉗子を用いた絨毛膜解剖顕微鏡および dechorionate の下で胚の胚を配置します。背の眼の SOS を視覚化します。SOS が目の背側縁にインデントとして表示され、行は背の眼にまたがって表示される必要があります。通常の SOS 閉鎖のため周りで胚を観察 20 23 hpf。遅延 SOS 閉鎖表現型の検討、28 で胚を観察 hpf またはそれ以降。
   4. しないから SOS 閉鎖遅延を示す胚を並べ替えます。
   5. 解剖顕微鏡を用いたこれらの胚の写真、E3 で 1% の agarose を含むシャーレを用意してください。胚は、アガロースに置かれたときに座ることができる胚の卵黄で浅い穴を作成する agarose の中心に軽く刺します。これは、時に、胚が斜めの角度で撮影されている保証されます。
   6. E3 の場所に横に agarose 0.003 %tricaine を持つ胚を麻酔します。
   7. 化合物、または共焦点顕微鏡を用いた胚をイメージする 35 mm 非ゲル 1% 低融点ポイントの agarose E3 での小さな塊を含むペトリ皿に胚を転送 (w/v)。すぐに横方向に細かい釣り糸またはまつげを使用して胎児の位置、冷却する agarose を待ちます。Agarose がしっかりと、皿、アガロースをカバーするために十分な E3 を注ぐ。詳細については、ディステル ・ コスターの¹⁴を参照してください。
      注: 倒立顕微鏡を使用している場合、胚ガラス coverslip 底皿のガラスに対して配置でき標準 20 × 対物レンズで結像されます。
   8. 水浸漬 20 倍の対物レンズを使用して、複合顕微鏡で SOS を視覚化します。可視化、次には、優しく胚からアガロースを抜くと 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の修正か、開発を継続することができます。

2 ラミニンの全体マウント 2 のプロトコル: 蛍光抗体染色

1. 全体マウント ラミニンの免疫蛍光染色: 日 1
   1. Dechorionate 胚はすでに行われていないステップ 1.2.3 で記述されています。たて 4% に必要な timepoint で微量遠心チューブに胚を修正 2 時間室温 (22-25 ° C) シェーカーの PFA。1 で洗って 5 分、4 回の x PBST。
      注: 次の原腸形成において、胚が dechorionation 後より良い修正されます。
   2. 5 分インキュベーション時間は胚を固定する発達段階に依存のために室温で 10 mg/mL プロティナーゼ K の胚を permeabilize (Thisse および Thisse を参照してください¹⁵)。
   3. 1 で洗って 5 分、4 回の x PBST。
   4. 5% ヤギ血清および 2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) の室温シェーカーで 1-2 時間の 1xPBST の溶液中の胚をブロックします。
   5. ブロック溶液中で 1: 200 希釈ウサギ抗ラミニン抗体を希釈して一次抗体溶液を準備します。
   6. 4 ° C のシェーカーで一晩一次抗体を抗ラミニンの胚孵化させなさい。
2. 全体マウント ラミニンの免疫蛍光染色: 日 2
   1. 1 で洗って 5 回、15 分間 x PBST。
   2. 1 ヤギ抗うさぎ Alexa Fluor 488 抗体を希釈して二次抗体溶液を準備 x PBST 1: 1000 希釈します。
      注: 異なる二次抗体を使用して利用可能なリソースに実験者に合わせてこの手順を適応することが可能です。
   3. 4 ° C のシェーカーで一晩二次抗体に胚を孵化させなさい。この手順以降から可能な限り光から保護します。
   4. 1 洗浄 4 回、15 分間 x PBST。必要に応じて、最大 1 週間、4 ° C で胚を格納できます。
3. 郭清と萌芽期目の取り付け
   1. に応じて、小さなシャーレに胚を配置、1 で胚を deyolk x PBST。優しく微細鉗子で卵黄を中断すると卵黄嚢のマイルド削りから卵黄のセルを削除するには、これを行います。
   2. マイクロ遠心チューブ用の PBS グリセロール シリーズ ・ ソリューションの次の濃度の準備: PBS で 30%、50%、70% のグリセリン。30% グリセロール/PBS ソリューションとできるだけ以前のソリューションのほとんどとして転送の上に胚を置くことを確かめるには、胚を転送します。胚はチューブの底に沈むことを待ちます。
   3. 胚は、底に沈んでいるとき、50% グリセロール/PBS に転送します。繰り返し、70% グリセロール/PBS に転送します。
   4. 胚は、70% グリセロール/PBS に沈んでいる、一度解剖の小さなプラスチックの皿に移動します。
   5. 後脳の後方の胚を断つし、必要に応じて遺伝子型、後部組織を使用します。
   6. 可能な限り少しグリセリンとして転送するスライド ガラスに頭を移動します。しがみついて頭を静止した保つために後端鉗子やその他細かい解剖ツールを使用します。そっと頭の左右半分を切り離すことを下げ、前方から前脳室に挿入し罰金 minutien ピンやその他の細かい解剖ツールを使用します。移動しながら後方中脳と菱脳の心室に本質的に正中線を頭を fileting、この手順を繰り返します。これは、目の周囲の組織、SOS は無傷のまま手動操作を最小限に抑えます。
   7. 目を頭の正中線の両側をマウントします。4 コーナー (使用される coverslip の離れて適切な距離) で真空グリースの記事、サンプルに接触、coverslip まで各記事を順番に押し下げてガラス coverslip でカバーします。グリセロールは、coverslip とスライド間の空間を充填、下に引っ張られるように、カバーガラスの端の 70% のグリセロールをピペットします。
   8. 日以内マニキュア マニキュア液が乾燥した後のみの画像サンプルと coverslip の周りのシール画像のサンプル。4 ° C で暗闇の中で保存します。

3. プロトコル 3: 視覚化の SOS を用いた eGFP ・ カァシュ mRNA

1. EGFP ・ カァシュ mRNA の合成
   1. 37 ° C で 4 時間 pCS2 eGFP-・ カァシュ プラスミド¹⁶ノッティと 40 mL の反応量 1 mg をリニア化します。
   2. RNase フリー 10 mL の水、10 %sds の 2.5 mL、2.0 mL を追加、制限のダイジェストの反応を停止する 10 mg/mL, プロテイナーゼ K
   3. 50 ° C で 1 時間インキュベートします。
   4. 次の反応に追加 (合計量 200 mL) し、次のステップに進みます: RNase フリー 50 ml、20 mL 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2 と 75.5 RNase フリー mL 水
      注: RNase フリーの水は、ナトリウムのアセテートの過度の希釈を防ぐために 2 つの別々 の機会に追加されます。
2. DNA のフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿法による浄化
   1. 200 mL フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールと渦の追加 20 s. 別 5 分 18,000 × g で遠心分離を水溶液と有機相。
   2. 水性上層を下層有機の転送を避けるために確認して、新しい微量遠心チューブに転送します。新しいチューブにクロロホルムの等しい量を追加します。
      注: クロロホルムの付加はオプションですが、サンプルからフェノールの完全な除去を確実にお勧め。
   3. 20 s. 別 5 分 18,000 × g で遠心分離を水溶液と有機相の渦。
   4. 以前のように、上方の水層を底の有機層の転送を避けるために確認して、新しい微量遠心チューブに転送します。
   5. 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2 の 1/10 ボリュームを追加します。
   6. 4 ° C で 20 分 18,000 × g で 15 分遠心分離機の-20 ° C で 100 %rnase フリー エタノールと寒さの 3 つのボリュームを追加することで DNA を沈殿させるペレットは見えるはずです。上清をデカントします。
   7. 70% エタノール/RNase フリー水 100 mL でペレットを洗浄します。4 ° C で 15 分間 18,000 × g で遠心分離機のペレットを緩い破ること軽く混合後ペレットは見えるはずです。上清をデカントします。
   8. 5 分のペレットを風乾、水 7 mL に DNA を再懸濁します。
      注: ペレット利用の気流によって 5 分以上乾燥する必要があります。
3. 転写と eGFP ・ カァシュ mRNA の精製
   1. RNase フリーの方法の in vitro転写反応精製線形プラスミッド ステップ 3.2 で得られた DNA の約 1 mg を使用して、市販の Sp6 RNA ポリメラーゼ キットを準備します。37 ° C で 2 時間インキュベートします。
      注: Sp6 RNA ポリメラーゼは、mRNA キャップの生産のため使用する必要があります。
   2. DNase の 1 mL を追加 (2 U/mL;RNase フリー) 37 ° C で 30 分間インキュベートし、
   3. あらゆる市販の RNA 精製キットと mRNA を浄化します。繰り返しの凍結融解を回避し、-80 ° C で保存する mRNA の約数
4. 注射と可視化
   1. プロトコル 1.1 で説明したように、胚を取得します。
   2. 1 細胞期で eGFP ・ カァシュ mRNA の 300 pg を注入するマイクロインジェクション装置を使用して。
   3. 明るい蛍光性の立体鏡を使用して目の eGFP 発現と胚の画面。
   4. 1.2 プロトコルで説明されているように、胚をイメージします。
   5. また、dechorionate と胚の修正 4% に必要な timepoint を 4 時間室温でまたは一晩 4 ° C で PFAまだ施行されていない場合 pbst; 5 分、4 回、dechorionate、× 1 で胚を洗います。目を解剖し、プロトコル 2.3 で説明されているようにスライドにそれらをマウントします。

結果

ゼブラフィッシュ SOS 表示 20 で推定背側網膜⁸で hpf。幅広いインデント位置にその初期の狭いアーキテクチャから 23 の hpf SOS 遷移、26 それはもはや目に見える⁸hpf。したがって、通常のゼブラフィッシュ眼開発中に SOS を調べる、胚は 20-23 hpf 間遵守されなければなりません。この期間中に SOS は解剖顕微鏡を使って、(図 1) の開発の網膜の鼻と時間の半分を分ける背の眼の細い線として DIC イメージングによる観察です。さらに、微妙なインデントが目 (図 1) の背側の境界に表示されます。次のラミニンの免疫蛍光染色、基底膜 (図 1) に細い線を確認できます。

ディスカッション

ゼブラフィッシュ胚の SOS を観察するプロトコルの標準化されたシリーズを紹介します。閉鎖遅延表現型を決定するには、私達のプロトコルが脈絡裂閉鎖遅延を可視化するための技術と同様、目の背側鼻と時空間背側の側面の 2 つの離散葉の分離を区別する能力に焦点を当てています。腹側の目の表現型。

これらの可視化技術は、抑制や SOS の閉鎖での役割を研究するある特定の遺伝子の発現を誘導する効果を研究するさまざまな遺伝子操作技術と組み合わせて使用できます。我々 は我々 は以前それを示されているように、 gdf6a^-/-の胚を使用してこれらのプロトコルその損失、SOS の適切な閉鎖に影響を与えることができますが、操作として任意の遺伝子の発現の効果を研究するプロトコルを使用することができますを選択しました必須。背の眼に任意の形態学的変化が解剖顕微鏡を用いた観察と事前に調査されることをお勧めします。彼らはより時間がかかり、低いスループット、最初のリンクが決定的に確立される、別のテクニックを使用する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-フェニル 2-チオ尿素	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm シャーレ	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm シャーレ	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
ウシ血清アルブミン	シグマ アルドリッチ	A7906-100G
DIC /蛍光顕微鏡	ツァイス	AxioImager Z1
解剖顕微鏡	オリンパス	SZX12
解剖顕微鏡カメラ	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
ダウ コーニング 高真空グリース	フィッシャーサイエンティフィック	14-635-5D
エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (トリカイン)	シグマ アルドリッチ	A5040-25G
ヤギ 抗ウサギ アレクサ フルーア 488	アブカム	ab150077
ヤギ血清	シグマ アルドリッチ	G9023
画像キャプチャソフトウェア	ツァイス	ZEN
インキュベーター	VWR	モデル 1545
顕微鏡カバーガラス(22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
顕微鏡スライド	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
パラホルムアルデヒド (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール pH 6.7 +/- 0.2	フィッシャーサイエンティフィック	BP1752-100
プロテイナーゼK	Sigma Aldrich	P4850
ウサギ抗ラミニン抗体	ミリポアシグマ	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
超高純度低融点アガロー	Invitrogen	16520-100
超高純度ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	Invitrogen	15525017