分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化

サマリー

ここでプリオン蛋白発現神経細胞の分化過程を評価するために人間の歯髄幹細胞の分離と伝搬するためのプロトコルを提案する.

要約

胚性幹細胞の操作に関連する生命倫理の問題は、医学研究の分野での進歩を妨げています。このため、脂肪、臍帯、骨髄血などさまざまな組織から成体幹細胞を得ることが非常に重要です。可能なソースの間で倫理的配慮に関して入手が容易だから、歯髄は特に興味深いです。確かに、ひと歯髄幹細胞 (hDPSCs) は成体幹細胞の神経様細胞に区別することの一種で、健康な患者 (13-19 歳) の第 3 大臼歯から取得することができます。特に、歯髄除去掘削機と、小さなスライスにカット、IV コラゲナーゼで処理し、フラスコで培養します。神経細胞の分化を誘導して、2 週間 hDPSCs EGF/bFGF と刺激を受けました。以前は、その分化過程プリオンの内容 hDPSCs の蛋白質 (PrP^C) 増加を確認しました。Cytofluorimetric 分析は、神経細胞の分化プロセス後に増加した PrP^Cの早期発現を示した。SiRNA による prp^Cアブレーション PrP EGF/bfgf 投与による神経細胞の分化を防止しました。本稿で我々 は分離、分離およびいくつかの簡単な手順で hDPSCs 栽培体外を強化より効率的な細胞クローンされた間葉系幹細胞 (MSCs) の取得と大規模な拡大を説明します。観察されました。また、どのプロトコルでは、詳細な方法で得られた、hDPSCs、MSCs の神経分化過程とその後の細胞および分子プロセスを研究する優秀な実験モデルを示す.

概要

間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、歯髄、脂肪組織、血液^1,2,3,4,5など、いくつかの組織から分離されています。^,6。 hDPSCs がプラスチック付着、典型的な線維芽細胞様形態を示す何人かの著者によって報告されるようです。これらは異なるクローン増殖と分化能力^7,8の違いと非常に異種の人口を表しています。hDPSCs 間葉系幹細胞 (すなわち CD44、CD90、CD73, CD105、STRO 1) 特定のマーカーの表現、(CD14 CD19 など) いくつかの造血のマーカーは陰性、血液分化^9、ことができる^10,11。

何人かの著者は、これらの細胞は神経成長因子、bFGF、特定メディアとサプリメント^7,12との組み合わせで EGF を添加し、異なるプロトコルを使用して神経細胞のような細胞に分化することが示されています。また、神経細胞の分化のプロセス中に多くのタンパク質が関与しているし、これらのうち、いくつかの論文を表示関連する役割と重要な発現細胞プリオンタンパク質 (PrP^C)、胎児および成体幹細胞^13,の両方¹⁴., 分子として銅代謝、アポトーシス、細胞内の異なる機能を実行できるを表し、耐酸化ストレス^15,16,17 PrP^{C,18,19,20,21,22}。

私たち以前紙²³、hDPSCs 神経分化過程における PrP^Cの役割を検討しました。実際には、hDPSCs エクスプレス早熟 PrP^Cと、神経細胞の分化後追加の増加を観察することが可能だった。他の著者は、幹細胞の神経分化過程における PrP^Cの可能な役割を仮定しました。確かに、PrP^Cはアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト、ニューロンの²⁴にヒト胚性幹細胞の分化をドライブします。本研究の目的は、神経細胞の分化の間に歯髄、その分化過程と PrP^Cの役割から幹細胞を得るための方法論を強調していた。

プロトコル

研究で使用されている第三大臼歯 (13-19 歳) 薬剤またはアルコールの消費のない前の歴史、すべて禁煙と適切な口腔衛生の患者から摘出し.科学歯科で「サピエンツァ」ローマ大学の顎顔面の説明の日に患者または両親からインフォームド コンセントを得た。倫理的な考察、倫理委員会の承認に基づくインフォームド コンセントを得た。

1. 歯や歯髄の抽出

1. 保全または交通機関のための適切な媒体の準備。
   1. ダルベッコ変更されたワシの中低濃度 L-グルタミン (494.5 mL) とグルコース (DMEM L) を準備します。
   2. ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。0.5 mL アムホテリシン (0.1%)。
2. 患者から第 3 大臼歯を抽出、すぐに PBS で洗い、培地 15 mL の試験管に入れ、2 時間未満で研究室にそれを転送します。
3. バイオハザード フード カッターでコロナ カットパスの並列と歯髄腔の屋根を接線によって歯を開きます。
4. 優しく小さなショベルとパルプを削除し、テスト チューブ内に配置します。
5. 3 回 PBS で洗浄し、室温 10 分 2,500 × gで遠心分離

2. 歯髄幹細胞の処理

1. 上澄みを除去、ハンクのソリューションでペレットを再懸濁します、ペトリ皿に配置。5% CO₂の 37 ° C で 2 時間インキュベートします。
2. IV コラゲナーゼ溶液製剤を入力します。
   1. DMEM L の 0.8 mL を準備します。
   2. DMEM L といくつかの分の渦の 0.8 mL のタイプ IV コラゲナーゼの 1 mg を溶かします。
   3. DMEM L を追加最終濃度を持っているまで 1 mL 1 mg/mL。
   4. 0.22 μ M のフィルターでソリューションをフィルター処理します。
3. 常温 10 分 2,500 × gで遠心分離によってハンクのソリューションを削除し、使い捨てメスと approximatively 1 mm の小さなスライスにパルプを分割します。
4. ペトリ皿で果肉のスライスを配置し、1 ml 5% CO₂の 37 ° C で 15 分間タイプ IV コラゲナーゼの間加温します。
5. 培準備 (500 mL)。
   1. 445 ml と L グルタミン DMEM L。
   2. ウシ胎児血清 (FBS) (10%) の 50 mL を追加します。
   3. ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。
6. 2,500 x gで RT 10 分のサンプルを遠心、上清を削除、5% CO₂の 37 ° c (ステップ 2.5) 中ペレットと T25 フラスコ幹細胞の特定の文化を再懸濁します。

3. 幹細胞文化および伝搬

1. 毎日文化を確認し、成長の 3 日後、フラスコ内の付着性のセルの異なるクローンを観察します。
2. 培を 3 日おきに変更します。
3. 7 と 12 日間付着性のセルがリーチの合流点にしたら、それらをデタッチ 1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C で 3 分間のセルを扱うか優しく細胞スクレーパーを使用しています。
4. トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 ml (比率 1:5) を追加します。
5. 259 × gで 6 分の細胞懸濁液を遠心分離機、上澄みを除去し、伝達する T25 フラスコにセルを配置します。
   注:3 日おき、電池が合流点に達する。
6. 21 または 28 日間 (約 6-8 通路)、培養細胞のような非幹の存在を避けるためにまでセルを反映します。
7. 1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C または優しくこするで 3 分のための細胞をデタッチします。259 × gで 6 分の細胞懸濁液を遠心します。
8. 上澄みを除去し、cytofluorimetric 分析 (手順 6) のセルをテストします。

4. 過渡 PrP^Cサイレンシング siRNA

1. 2 ml の培養液 (ステップ 2.5) 24 時間 hDPSCsin 6 ウェル プレート (2 x 10⁵セル/mL) の文化します。
2. 翌日、siRNA PrP メディア (400 μ L) の準備します。
   1. 滅菌試験管に 384 μ L を追加 DMEM l.
   2. 5 の最終濃度を持っている DMEM L に siRNA PrP の種類ごとに 1 μ L を追加 nM (4 siRNA PrP された使用、ノックダウン効率 70% を保証する製造業者によって確認しました)。
   3. DMEM l. に transfectionreagent の 12 μ L を追加します。
   4. 渦混合物、トランスフェクションの複合体の形成を許可する RT で 10 分間インキュベートします。
3. 各サンプルに siRNA PrP 中の 400 μ L を追加し、37 ° C で 6 時間インキュベート
4. SiRNA PrP 媒体を破棄せず培 (ステップ 2.5) の 1.6 mL (1 ~ 5 の比) を追加します。
5. 37 ° C で 72 時間細胞を残す
6. 上澄みを除去し、2 mL の PBS 室温で 3 回洗浄
7. 7/14 日 (ステップ 5.1) の神経細胞培養培地 2 mL を追加します。
8. 神経細胞の培養液を 3 日ごとに変更します。
   注:置換 siRNA PrP ソリューション各時間神経細胞培養培地。
9. 時間の終わりに、2 mL の PBS 常温で 3 回洗って、西部のしみの分析による神経細胞の表面抗原のテストします。

5. 神経誘導過程 hDPSCs

1. 神経細胞培養培地の調製 (500 mL)。
   1. 神経細胞に作り出される基底メディア 444.7 mL を準備します。
   2. 媒体無血清サプリメント胎児および成体の神経幹細胞 (10%) の長期的な存続を支援するために使用の 50 mL を追加します。
   3. メディア (最終濃度 20 ng/mL) に 200 μ L の塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF) (最終濃度 40 ng/mL) と 100 μ L の表皮成長因子 (EGF) を追加します。
   4. ペニシリン/ストレプトマイシン (1%) 5 mL を追加します。[中]。
2. 6 ウェル プレート (2 x 10⁵セル/mL) の文化 hDPSCs パルプ分離から 28 日まで、神経細胞培養培地 2 mL にそれらを刺激します。
3. 上澄みを廃棄するごとに 3 日間、2 mL の PBS 常温で 3 回洗浄し、交換神経細胞培養培地 2 mL。
4. 7 および 14 日後に、1 ml のトリプシン-EDTA 37 ° C で 3 分のためのまたは軽くスクレーパーとセルをデタッチします。
5. トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 mL (比率 1:5) を追加します。
6. フローサイトメトリー法によるプリオン蛋白質の表現 (ステップ 7) または神経細胞表面抗原 (手順 6) の存在をテストします。

6. フローサイトメトリーによる hDPSCs の評価

1. 間葉系間質 (MSC) を選択- または特定の神経細胞表面抗原。
2. 6 ウェル プレート (2 x 10⁵セル/mL) 2 ml の培養液 (ステップ 2.5) で hDPSCs の文化.
3. 歯髄の分離または 37 ° C または優しくスクレーパーで 3 分の 1 ml のトリプシン-EDTA の神経細胞の培養液 (ステップ 5.1) 14 日後 28 日目に hDPSCs をデタッチします。
4. トリプシンのアクションを停止する培養液 (ステップ 2.5) 4 ml (比率 1:5) を追加し、259 x centrifugate g室温 6 分別 2 回洗浄 2 ml の PBS の室温
5. 4 ° C で 10 分間の PBS で 4% パラホルムアルデヒドで未処理または処理の hDPSCs を修正します。
6. 室温でさらに 10 分の PBS で 0.1% (v/v) 非イオン性界面活性剤 hDPSCS を permeabilize します。
7. 5% 脱脂粉乳室温 1 時間 1 mL の PBS でブロックを実行します
8. 1 mL の PBS で 3 回洗浄し、反 CD105 とセルを孵化させなさい (1: 100/5 x 10⁵セル)、抗 CD44 (1: 100/5 x 10⁵セル)、反 STRO 1 (1: 100/5 x 10⁵セル)、アンチ CD90 (1: 100/5 x 10⁵セル)、アンチ CD73 (1: 100/5 x 10⁵細胞)、β3-チューブリン アンチ (1: 100/5 x 10⁵セル)、反フォッカー (1: 100/5 x 10⁵セル) と反 GAP43 (1: 100/5 x 10⁵セル) 室温 1 時間 mAb
9. 3 回で 1 mL の PBS セルを洗浄し、抗マウス PE (1:50/5 x 10 の⁵セル) または抗家兎 CY5 と孵化室温追加 1 時間 (1:50/5 x 10 の⁵セル) モノクローナル抗体
10. 免疫陽性細胞 (抗マウス PE または抗家兎 CY5 mAb) をゲートの二次抗体を使用し流れの cytometer ですべてのサンプルを分析し、少なくとも 20,000 のイベント。

7. 流れ Cytometry による hDPSCs の PrP^C式の評価

1. 2 ml の培養液 (ステップ 2.5) hDPSCsin 6 ウェル プレート (2 x 10⁵セル/mL) の文化します。
2. 21 と 28 日歯髄分離から、神経細胞培養培地 1 ml のトリプシン-EDTA の (手順 5.1) で 7 および 14 日後に hDPSCs を外し、手順 6.4 トリプシン アクションを停止します。4 ° C で 10 分間の PBS で 4% パラホルムアルデヒドで試料を固定します。
3. 0.1% (v/v) 非イオン性 surfactantin PBS で 10 分間でルート削除と上澄みを permeabilize し、ウサギ抗 PrP mAb EP1802Y (1:50/5 x 10 の⁵細胞) 細胞を染色抗家兎 CY5 とした加温 (1:50/5 x 10 の⁵セル) で 1 時間の mAb の mAbさらに 1 時間室温
4. 流れの cytometer ですべてのサンプルを分析し、少なくとも 20,000 のイベントを取得します。

結果

第 3 大臼歯から得られる歯髄から hDPSCs の分離と分離のプロシージャは、小さな変化が破滅的な結果を導くことができる複雑なプロセスです。本稿でのアーサー et al.プロトコルを使用してください。¹²いくつかの改善をします。プロシージャの代表的な方式を図 1に示します。

hDPSCs は、異なるクローン増殖と分化能力^7,8の違いと細胞の異種集団を表します。パルプの分離およびパルプの小さな断片のシード後、細胞周囲に拡大を見ました。図 2は、4 日 (中央パネル) と 7 日 (右側のパネル) 歯髄分離から 1 日 (左のパネル)、細胞の小さなクラスタ...

ディスカッション

この作品での分離と hDPSCs; 神経分化の方法論に着目さらに、このプロセスで PrP^Cの役割を評価しました。分離し、プロセス中に神経細胞のような細胞で重要なステップ hDPSCs を区別するいくつかの方法があります。hDPSCs は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、神経細胞などいくつかの系統に区別することができます。私たちの論文では神経細胞の分化のメカニズムと PrP^Cの存在を調べた。前述したように、これらの細胞は、CD44、CD90, CD105、CD73、STRO 1^10,25,26など典型的な間葉系間質固有表面抗原を表現します。

プロトコルでは、いくつかの重要なステップ分離のプロシージャのエラーが発生することができます。最初の重要なステップは、患者の²⁷の選択によって表されます。我々 の経験でわかっ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アムホテリシンB溶液	Sigma-Aldrich	A2942	細胞培養培地を補うために使用され、Streptomyce
Anti-B3tubulin	Cell Signaling Technology	#4466	6つのB-チューブリンアイソフォームの1つで、胎児および出生後の発育中に高発現し、末梢神経系で高いままです
抗CD105	BD Biosciences	611314	Endoglin (CD105) は、ヒト血管内皮の主要な糖タンパク質であり、大きな細胞外領域、疎水性膜貫通領域、および短い細胞質尾部を持つ
抗 CD44	ミリポア	CBL154-20ul	ポジティブ セル マーカー 間葉系幹細胞に対する抗体
抗 CD73	細胞シグナル伝達技術	13160	CD73は、70 kDaのグリコシルホスファチジルイノシトールに固定された膜結合糖タンパク質で、細胞外ヌクレオシド一リン酸の生理活性ヌクレオシドへの加水分解を触媒
抗CD90	ミリポア	CBL415-20ul	間葉系幹細胞に対する陽性細胞マーカー抗体
抗GAP43	細胞シグナル伝達技術	#8945	は、成長円錐体および高可塑性の領域における神経系特異的な成長関連タンパク質です
抗マウスPE	Abcam	ab7003	は、フローサイトメトリーまたはFACS分析で使用される抗体です
。	細胞シグナル伝達技術	#2836	ニューロフィラメント-Hタンパク質 Anti-PrP mAb の全内因性レベルを検出する抗体です
EP1802Y	Abcam	ab52604	ウサギモノクローナル [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5	Abcam	ab6564	は、フローサイトメトリーまたはFACS分析で使用される抗体です
抗STRO 1	ミリポア	MAB4315-20ul	陽性細胞マーカー抗体 間葉系幹細胞
B27 Supp XF CTS	Gibcoによって生命技術	A14867-01	B-27 多能性幹細胞(PSC)からのヒト神経幹細胞(hNSC)の誘導、hNSCsの拡大をサポートするために使用できます。 培養BD Accuri C6フローサイトメーターにおけるhNSCの分化と成熟分化ニューロンの維持
	BD Biosciences	AC6531180187	青色レーザー (488 nm) と赤色レーザー (640 nm) を搭載したフローサイトメーターBD
Accuri C6 ソフトウェア	BD Biosciences		は、データの取得、統計の生成、および結果の分析のためにBD Accuri C6フローサイトメーターシステムを制御
bFGF	PeproThec、DBA	100-18B	基本的な線維芽細胞成長因子
遠心分離機CL30R	Termoの漁師の科学	的な11210908	液体、ガスまたは液体の分離のために使用される装置である
			それは細胞培養のための最適で、再現可能な成長条件を保障
コラゲナーゼ、タイプIV	ライフテクノロジー	ズ17104019	コラゲナーゼは、コラーゲンの使い捨てメスに高頻度で見られるPro-X-Glyc-Pro配列の中性アミノ酸(X)とグリシンとの間の結合を切断するプロテアーゼ
です。	スワン・モートン	501
DMEM-L	ユーロクロン	ECM0060L	ダルベッコのモディファイドイーグルの中低グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム
EGF	ペプロテック、DBA	AF-100-15	上皮成長因子
10270-106	ウシ胎児血清	Gibco	は、細胞培養において幅広い機能を提供するため、人気のある培地サプリメントです。FBSは、栄養素、増殖因子、付着因子を送達し、無血清培地(SFM)システムでは再現が困難なメカニズムにより、細胞を酸化的損傷やアポトーシスから保護します
Filtropur BT50 0.2,500 mL ボトルトップフィルター	Sarstedt	831,823,101	PRNP
Qiagen	GS5621	用の溶液Flexitube GeneSolution	Entrez遺伝子5621の4つのsiRNA。ターゲットシーケンスN.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA
ハンクのソリューション 1x	Gibco by life technologies	240200083	ハンクス&プライムの本質的な機能;バランスの取れた塩溶液は、pHと浸透圧のバランスを維持するためのものです。また、細胞に水と必須無機イオンを提供します
HiPerFectトランスフェクション試薬	Qiagen	301705	HiPerFect Transfection Reagentは、カチオン性脂質と中性脂質のユニークなブレンドであり、効果的なsiRNAの取り込みと細胞内のsiRNAの効率的な放出を可能にし、低siRNA濃度の
基礎A	Gibco by life technologies	10888022	Neurobasal-A Mediumは、純粋な出生後および成人の脳ニューロンの長期維持と成熟のために設計された基礎培地です。
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	30525-89-4	パラホルムアルデヒドは、ペ
ニシリン/ストレプトマイシン	ユーロクロン	ECB3001D	細菌汚染を制御するための細胞培養培地の補充に使用します
リン酸緩衝生理食塩水 (PBSの)	ユーロクローン	ECB4004LX10	PBSは、哺乳類細胞の取り扱いと培養に使用されるバランスの取れた塩溶液です。PBSは、哺乳類細胞の灌漑、洗浄、希釈に使用されます。リン酸緩衝剤は、生理学的範囲のpHを維持します
TC-Platte 6 well, Cell+,F	Sarstedt	833,920,300	それは付着細胞の成長面です
組織培養フラスコ T-25,Cell+,Vented Cap	Sarstedt	833,910,302	組織培養フラスコT-25、ポリスチレン、Cell+敏感な接着細胞のための成長面、例えば、初代細胞、傾斜した首、換気キャップ、黄色、滅菌、パイロジェンフリー、非細胞毒性、 10個/袋
トリトン X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	穏やかな非変性条件下での膜成分の回収に広く使用されている非イオン性界面活性剤
トリプシン-EDTA	ユーロクロン	ECB3052D	トリプシンは、リジンおよびアルギニンアミノ酸残基のC末端側のペプチドを切断します。トリプシンは、培養表面から付着細胞を除去するために使用されます
チューブ	Sarstedt	62,554,502	チューブ 15 mL、120 mm x17 mm、PP
VBH 36 C2 コンパクト	滅菌	ST-003009000	環境と労働者のための完全な保護を提供します
ZEISS Axio Vert.A1 –反転 顕微鏡	ツァイス	3849000962	ZEISS Axio Vert.A1は、ユニークなエントリーレベルの価格を提供し、明視野、位相コントラスト、PlasDIC、VAREL、改善ホフマン変調コントラスト(iHMC)、DIC、蛍光を含むすべてのコントラスト技術を提供できます。LED照明を組み込んで、蛍光標識細胞を優しくイメージングします。Axio Vert.A1は、人間工学に基づいて設計されており、日常的な作業のために設計されており、組織培養フードの内側に収まるほどコンパクトです。