等温滴定熱量測定による酵素の安定性を測定

サマリー

酵素の熱安定性は、等温滴定型熱量計 (ITC) によって容易に測定されます。ほとんどの蛋白質の安定性の試金は現在メジャー タンパク質の変性を使用、酵素活性についての情報を提供しません。ITC は、酵素活性の安定性に関する酵素の変更の効果の直接測定できます。

要約

この作品は、等温滴定熱量測定 (ITC) による酵素活性の安定性を測定するための新しいメソッドを示します。酵素活性と相関している酵素液に基板の解決の単回投与後の観察のピーク熱速度。時間をかけて同じ酵素溶液に基板の複数の注射は、酵素活性の損失を示します。アッセイ、自律、非常に少しの担当者の時間を必要とするほとんどのメディアおよび酵素に適用されます。

概要

酵素は、蛋白質多彩な有機反応を触媒することができます。過酷な溶剤の使用を避けるため中性付近の水溶液でほとんど酵素機能。選択性が高く、酵素触媒反応生成少ない (いくつかのケースでは、副産物) 酸および塩基の¹のような非選択性触媒よりも副産物。これは最終製品が人間の消費のために安全であるのですべての化学反応を行う必要がある食品の製造に特に関連します。現在、酵素は、高果糖コーン シロップ²チーズ³ビール⁴牛乳の乳糖無料⁵、およびその他の重要な食品の製造に使用されます。本稿では、食品産業における酵素利用、緑の化学、医薬品合成などの酵素のための他の多くの用途があります。

酵素の有用性は、酵素の立体構造を維持するのに依存する酵素活性の安定性によって制限されます。酵素の構造は、peg 修飾操作⁶、しっかりサポート⁷、遺伝の修正の⁸、および製剤の固定化などの変更により安定化することができます。現在、示差走査熱量測定 (DSC) で酵素の安定性通常計測、エンドポイント酵素試金⁹。DSC 測定温度で酵素が繰り広げられます。温度が高いほど安定した構造。ただし、活動の損失は多くの場合酵素または酵素¹⁰内のドメインを展開するために必要なよりも低い温度で発生します。したがって、DSC は酵素修飾酵素活性の安定性が向上するかどうかを判断するのに十分ではありません。エンドポイント酵素試金は通常集中の時間、複数のサンプルを必要とする、高い色または不透明なソリューションまたは懸濁液には適用されません結合比色反応も多い。

この作品は、等温滴定熱量測定 (ITC) による酵素活性の安定性の直接測定法を示します。ITC は、リリースや反応の中に吸収される熱の率を測定します。ほぼすべての反応生成熱を吸収するので、ミルクなど不透明なメディアの結合反応を持っていないか、発生する反応を含む、ほとんどの酵素触媒反応の ITC を使用できます。ITC は、反応の多くの種類の化学動力学的パラメーターを計測する何十年も使用されていますが、ここで提示されたプロトコル ITC を使用して酵素触媒反応のピーク熱率の計測に着目し、酵素活性が直線状にあることを示して熱のピークの速度と相関した.ピーク熱率の ITC 測定主自律やほとんど人件費をセットアップし、分析が必要です。

プロトコル

1. 試料の準備

1. 0.1 M 酢酸緩衝液 ph 4.6 の 1,000 mL
   1. 800 mL の卒業 1,000 mL のビーカーに蒸留水を測定します。
   2. 無水ナトリウムのアセテートの 8.2 グラムの重量を量る、それをビーカーに追加します。
   3. 撹拌プレートにビーカーを置き、ビーカーに攪拌ロッドを置く、攪拌プレートをオンに、完全に溶けるまでかき混ぜます。
   4. 無水ナトリウムのアセテートが完全に解散したときは、校正 pH メーターで、溶液の pH を測定します。
   5. 目的 pH 4.6 を取得にそれに応じて 1 M 塩酸または水酸化ナトリウムを追加します。
   6. 総容積が 1,000 mL になるまで蒸留水を追加します。
   7. 使用するまで常温で保存します。
2. 酵素液
   1. 酵素ソリューション 15 mL に 0.1 M のナトリウム酢酸バッファー pH 4.6 の最初の測定 8 mL で 10-30 mg/mL の範囲内で卒業したシリンダー 10 mL を準備します。
   2. 酵素と 15 mL の円錐管に緩衝液を追加し、酵素が溶けるまで、積極的に振る。
   3. 総容積が 10 mL になるまでより多くの緩衝液を追加します。
   4. 使用するまで 4 ° C で酵素液を格納します。
3. 基板の解決
   1. 300-600 mM の範囲で基板の解決を準備するには、望ましい集中にグラムで必要な基質の量を計算します。
   2. 基板重量を量り、100 mL のガラス製ビーカーに
   3. 25 mL のメスシリンダーのシリンダーを用いた緩衝液 20 mL を測定し、ガラス ビーカーに追加します。
   4. 撹拌プレートにビーカーを置き、ビーカーに電磁攪拌棒を配置します。暖房をつけて、攪拌速度を調整します。
   5. 基板が解散するまで継続する攪拌を許可します。
   6. 50 mL の円錐管に基質溶液を注ぐし、総容量が 45 mL になるまで 0.1 M ナトリウム酢酸バッファー pH 4.6 を追加します。振って混ぜます。
   7. 使用するまで保管常温基板ソリューションです。

2. 実験を実行します。

1. ITC 計測器の準備
   1. 参照セルが蒸留水の 350 μ L でロードされていることを確認します。サンプル セルに酵素をロードする前に、サンプル細胞を掃除されていることを確認します。
   2. プロトコル-塗りつぶし 2% 洗浄液 (材料表) の 500 μ L で読み込みシリンジを洗浄、サンプル セルに慎重に針を挿入、セルを記入、同じ注射器を使用して液体をゆっくりと除去。ビーカーに液体を破棄します。70% のエタノールと 2% 洗浄液 (材料表) で 2 回この手順を 3 回繰り返すし、蒸留水で 10 倍を洗います。
   3. 450 μ L の酵素液で読み込みシリンジをいっぱいサンプル セルの下部に針を挿入、慎重にゆっくりと気泡の形成を防ぐために 100 μ L の線までプランジャーを押します。
   4. 針の先端を水の中に配置し、ゆっくりと、注射器に水を取って、廃棄物容器に水を分配して 3 回蒸留水 50 μ L 滴定シリンジを洗浄します。
   5. 基板の解決と 3 回洗浄によって残留水を削除します。
   6. 注射器は空気の泡なしいっぱいまでソリューションを描画することによって基板の解決の滴定シリンジを入力します。
   7. 基板の解決にまだシリンジとプランジャーを取り外し、約 2 μ L の空気注射器の上部に入力し、プランジャーを挿入を許可します。
   8. ITC のビュレットのハンドルを取り外してビュレット ハンドル内注射器を配置までタイトなネジします。
   9. 糸くずの組織と攪拌機の先端を拭く、ITC 楽器にビュレットのハンドルを配置し、慎重に場所でロックします。

3 ITCrun の設定

1. コンピューターで、 ITCrunを開き、設定をクリックします。
2. 攪拌率をクリックし、350 RPM に設定します。シリンジ サイズ (μ L) を確認し、50 μ L であることを確認します。
3. 温度を設定し、更新を押します。この手順を実行することをお勧めしますが、ITC を準備する前に少なくとも 1 時間。これはヒートアップまたは必要に応じて冷却器に十分な時間をことができます。
4. 実験のセットアップでは、増分の滴定を選択します。
5. 注射をセットアップする挿入をクリックします。5,400 に射出間隔を調整 s、4 と番号 4 に注入する注入量 (μ L)。設定を確認する[ok]を押します。
6. 平衡ボックス、自動平衡し、大予想加熱を選択します。(1 つが期待される加熱下で小さな選択できます予想される加熱が小さい場合; ただし、この平衡化時間が長くなります)。
7. 最初のベースラインは 300 に設定 s。
8. 実行、クリックを開始するには、開始攪拌率の横にある記号し、開始レンチ シンボルの横にあるをクリックします。
9. ファイルを保存し、実行する楽器を許可します。

4 データの分析

1. NanoAnalyze でファイルを開きます。データをクリックし、データの列を選択します。
2. すべてのデータを選択、コピー、および Microsoft Excel にデータを貼り付けます。
3. 300 で必要な値を追加することによってゼロのベースラインを調整する s ゼロします。この補正を熱率値の列全体に適用されます。
4. 式を使用して各注射用熱率の最小値または最大値を見つける: =MIN(cell:cell) または MAX(cell:cell)。各データ ポイントは、各注入で酵素の酵素の活動のピークを表します。
5. 滴定の間に値が発生した時間に対して MIN または MAX 値のグラフをプロットします。

結果

図 1と図 5に代表的な結果は、2 つの酵素ラクターゼおよびインベルターゼからデータを表示します。ラクターゼおよびインベルターゼは、endothermically と発熱を汎って、それぞれに 2 つの単糖類に、二糖類の加水分解を触媒します。両方の酵素反応は、酵素の飽和を妨げ濃度で実行しました。

ラクターゼ データは、ITC データことができます使用して酵素の安定性を推定する方法をデモンストレーションします。600 mM 乳糖 (図 1) の 4 連続 4 μ L 注入で 20 mg/mL ラクターゼに滴定します。5,400 の間隔各注入の間 s を適用し、これにより、各注入の前に最初のベースラインに戻るのに十分な時間。上記で説明したプロトコルは 25 ° C、35 ° C、45 ° C、および 55 ° C で行われました。また、600 mM の乳糖は混合熱のコントロールとして 100 mM 酢酸緩衝液の...

ディスカッション

ここで説明した ITC 酵素安定性分析の主な利点は自動化です。すべての適切なバッファーおよび解決が行われると、各測定のセットアップ時間はアッセイを行う人のため約 15 分です。対照的に、インベルターゼ、ラクターゼの活動の従来の試金はアッセイを行う人の継続的な関与と約 2 時間を必要とし、多くの酵素活性アッセイを取るかなり増えた。前の文書では、インベルターゼ活性¹¹より伝統的な spectrophotrometric 方法と ITC メソッドからデータを比較する方法を説明してきました。

ITC 試験の別の利点は、ほぼすべての酵素¹²への適用性です。したがって、特定の条件下での異なる酵素の安定性のテストにはいくつかの異なるアッセイの設定必要はありません。また、ITC の試金は新規酵素または適切な比色定量法を持たない酵素の活性の安定性を判断するのに役立ちます。 ITC アッセイは、食品科学の主要な利点である不透明なメディアで行うことができます。以来、酵素のほとんどの前のアッセイは、酵素活性を測...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A-ラクトース	フィッシャーサイエンティフィック	不明(古すぎる)	500g
酢酸ナトリウム、無水99%分	Alfa Aesar	A13184-30	250g
ラクターゼ	MP Bio	100780	5g
ヒドロコール酸溶液、1N	フィッシャーサイエンティフィック	SA48-500	500mL
ベンチトップメーター - pH	VWR	89231-622
エタノール 70%	フィッシャーサイエンティフィック	BP8231GAL	1ガロン
Micro-90	フィッシャーサイエンティフィック	NC024628	1L(洗浄液)