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方法論記事

免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定

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DOI:

10.3791/59308

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2019年6月25日

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1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

この記事について

サマリー

ここでは、オレキシンペプチド、オレキシン受容体、および正常および食事誘発肥満(DIO)成人ゼブラフィッシュモデルの腸および脳における内因性カンナビノイド受容体の免疫組織化学的特徴付けおよび局在化のためのプロトコルを示す。免疫ペリキシダーゼおよび二重免疫蛍光法。

要約

免疫組織化学(IHC)は、標識抗体を持つ組織切片における標的抗原の検出に関与する高感度かつ特異的な技術である。これは、最適な特定の信号を得るために各ステップの最適化が重要であるマルチステッププロセスです。IHCを通じて、特定のバイオマーカーの分布と局在化を検出し、進化的保全に関する情報を明らかにすることができます。さらに、IHCは肥満などの病理学的状態におけるバイオマーカーの発現および分布変化を理解することを可能にする。IHCは、主に免疫蛍光技術を用いて、成体ゼブラフィッシュで系統的に保存された分子の組織と分布を検出するために使用できますが、標準的なIHCプロトコルは絶え間ない。オレキシンとエンドカンナビノイドは、食物摂取と肥満病理の制御に関与する2つの高度に保存されたシステムです。ここで報告されるプロトコルは、オレキシンペプチド(OXA)、オレキシン受容体(OX-2R)、およびカンナビノイド受容体(CB1R)の正常および食事誘発肥満(DIO)成人ゼブラフィッシュモデルの腸および脳における局在および分布に関する情報を得るために使用されるプロトコルである。また、免疫ペルオキシダーゼおよび二重免疫蛍光、試薬の調製、固定、パラフィン埋め込み、ゼブラフィッシュ組織の凍結保護および内因性活性遮断工程および背景の調製方法についても説明する。カウンターステイン。パラメータの完全なセットは、以前のIHC実験から得られ、免疫蛍光が成人ゼブラフィッシュにおけるOX、OX-2R、CB1R分布、局在化、発現の保全の理解にどのように役立するかを示しました。組織。得られた画像は、非常に特異的なシグナル強度を有する画像で、ゼブラフィッシュが特定バイオマーカーの分布、局在化、進化的保存の免疫組織化学的研究に適した動物モデルであることを確認した。生理学的および病理学的状態。ここで提示されるプロトコルは、成ゼブラフィッシュにおけるIHC実験に推奨されます。

概要

免疫組織化学(IHC)は、抗原抗体相互作用1、2によって細胞または組織成分(抗原)を同定するために使用される確立された古典的な技術である。組織内の標的生体分子の局在化および分布を同定するために使用することができる。IHCは、組織セクション3の抗原を検出するために免疫学的および化学的反応を使用しています。抗原抗体相互作用の可視化に使用される主なマーカーには、蛍光色素(免疫蛍光)および酵素基質色反応(免疫ペルオキシダーゼ)が含まれ、いずれも抗体4に共役する。顕微鏡観察を用いて、組織内の標的抗原の局在化にほぼ対応する標識組織の局在を決定することができる。

タンパク質を検出するための蛍光または発色反応には、特定の一次抗体が直接標識される直接検出方法の2つの方法があります。二次抗体が標識5、6、7を運ぶ間、一次抗体が結合されない間接検出方法。間接法には、主に信号増幅であるいくつかの利点があります。また、他の分子および細胞技術とは異なり、免疫蛍光を伴い、細胞および組織7内で分化して発現する2つ以上のタンパク質の分布、局在、および共発現を可視化することができる。使用される検出方法の選択は、実験の詳細に依存します。

現在までに、IHCは、バイオマーカーの分布と局在化を理解し、ヒトから無脊椎動物への生体組織における異なるタンパク質の一般的なプロファイリングを理解するための強力かつ不可欠なツールとして、基礎研究に広く使用されています8、9,10歳,11.この技術は、多数の正常および変化した動物器官および異なる組織型におけるタンパク質発現の地図を表示するのに役立ち、生理学的および病理学的変化によって誘発される発現のダウンまたはアップレギュレーションの可能性を示す。IHCは、最適な結果を得るために正確さと方法の正しい選択を必要とする高感度技術です 12.まず第一に、固定、交差反応性、抗原検索、および抗体の感受性などの多くの異なる因子は、偽陽性および偽陰性シグナル13を引き起こす可能性がある。抗体の選択は、IHCにおける最も重要なステップの1つであり、抗原特異性および調査中のタンパク質および種との親和性に依存する7.

最近では、成体ゼブラフィッシュ組織のオレキシン/ヒポクレチンおよびエンドカンナビノイド系のメンバーを検出するためにIHC技術を最適化しました。我々は主に固定、2つの異なるアプローチを使用して組織埋め込み、断面および取り付け(顕微鏡分析中の解像度および詳細に影響を与える可能性がある)、およびブロッキング(偽陽性を防止し、背景を減らすために)14に焦点を当てている。他の重要な特徴は、個々のIHCプロトコルの抗体特異性および選択性および再現性である。抗体特異性を提供する鍵は、負のコントロール(標的タンパク質を発現しないことが知られている一次抗体または組織を含まない)と陽性コントロール(標的タンパク質を発現することが知られている組織を含む)の使用である15.IHCのための抗体の選択は、その種特異性(それらが目的の抗原と反応する可能性)および4、5、6を使用される抗原抗体結合検出システムに基づいて行われる。 、7.免疫ペルオキシダーゼの場合、反応の色は沈殿染色体の選択によって決定され、通常ジアミノベンジジン(褐色)16。一方、i mmuno蛍光は、蛍光結合抗体を利用して凍結組織切片におけるタンパク質発現を可視化し、発色検出システムに関して複数のタンパク質を容易に解析することができます。5,7.

免疫ペルオキシダーゼ技術では、二次抗体をビオチンに結合させ、発色レポーター分子[アビジンビオチン複合体(ABC)]をリクルートすることができるリンカー分子であり、染色シグナルの増幅につながる。ABCレポーター法では、酵素ペルオキシダーゼが3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)と反応し、酵素が二次抗体に結合する強烈な茶色の染色を生み出し、通常の光顕微鏡で分析することができます。ABC染色は、ビオチンに対するアビジンの親和性が高いため、一次抗体反応性の部位に付着した二次抗体がほとんどなく、迅速かつ最適な反応を生み出す。この発色検出方法は、シグナルの密度分析を可能にし、タンパク質発現レベル18との褐色シグナルレベルの相関に基づく半定量的データを提供する。

免疫蛍光技術では、異なるフルオロクロムが独特の波長で発光する能力により、複数のタンパク質の同時検出が可能ですが、スペクトルの重複を最小限に抑えるために、蛍光色素を慎重に選択することが重要です。5.さらに、異なる宿主種における一次抗体の使用は、交差反応性に関する困難を最小限に抑える。この場合、種特異的二次抗体は1種類の一次抗体のみを認識する。蛍光レポーターは、Alexa Fluor染料などの市販の誘導体を含む小さな有機分子です。

多くの動物モデルは、特定の生理学的および病理学的状態を理解するために使用される。今日まで、多くの代謝経路が進化の過程で保存されていることが確立されています。したがって、ゼブラフィッシュなどのモデル生物におけるIHC研究は、病理学的および非病理学的状態の起源および維持に関する洞察を提供することができる17.この報告書は、成虫ゼブラフィッシュ組織に対して行うことができ、周辺および中央レベルでのOXA、OX-2R、およびCB1Rの分布および局在化の詳細な画像を得るために使用されるIHCプロトコルを示すことを目的とする。また、成ゼブラフィッシュの末梢および中央組織における2つの主要なIHC間接法の適用のためのプロトコルも報告されている。記載されている間接法は、二次抗体が蛍光色素(免疫蛍光法)または酵素レポーター(免疫ペルオキシダーゼ法)に結合した場合のシグナル増幅を可能にする。発色性および蛍光検出方法の両方に長所と短所があります。このプロトコルで報告されているのは、IHCの使用、主に免疫蛍光、成体ゼブラフィッシュにおいて、異なる生理学的および病理学的条件にわたって進化的に保存されるシステムを研究するために広く使用される動物モデルである。

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プロトコル

1. 免疫ペルオキシダーゼプロトコル

注:ゼブラフィッシュは、オミッド・サファリ教授(水産学部、マシュハド大学、マシュハド、イラン)10によって得られました。

  1. 組織解剖
    1. 氷水(5部氷/1部水、4°C)に浸漬してゼブラフィッシュを犠牲にする。低酸素症による死を確実にするために、すべての運動の停止までそれらを残します。
    2. 次の解剖方法で腸と脳を素早く取り除きます。
      1. ペーパータオルで魚を乾燥させ、解剖マットの上に射精し、眼窩の腹部部分と尾の肉質部分を塞ぐ。
      2. 腸のために:皮膚をカットし、慎重に内臓が見えるまで、魚の側面から皮膚と下層の筋肉を削除します。それを伸ばす体腔から腸を取り除きます。
      3. 脳のために:かみそりの刃で頭を取り除きます。鉗子で頭蓋骨の腹部側から軟部組織を取り除く。頭蓋骨を開き、脳の腹部側から骨を取り除く。脳の後側から皮膚と頭蓋骨を取り除きます。脳を取り除く
  2. 組織固定
    1. リン酸バッファー(PB、pH 7.4、4°C)に新鮮な4%パラホルムデイド(PFA)を浸漬して解剖組織を室温(RT)で3時間固定します。
      1. 蒸留水(dH2 O)の450mLにNaH2 PO4H2Oの1.755gと4.575gのNaH2 HPO4を溶解して0.1M PBを調作し、必要量のNaOH 1Nで7.4のpHに調整します。
      2. ヒートプレート上の攪拌により0.1M PB(pH7.4)の100mLでPFAを4g溶解する4%PFAを調出す。60°Cの温度に達したら、明確な溶液を得るためにNaOH 1Nの2-4滴を追加します。RTでPFA 4%を残し、pHを制御する。pH を 7.4 に調整します。
        注:4〜6時間を超える組織固定は、抗原をマスクするオーバーフィックスを引き起こし、抗体-エピトープ結合を制限する。固定の時間は、組織のサイズに依存します。
  3. 組織埋め込み
    1. 0.1 M PB(pH 7.4)に浸漬して、組織を5分間5分間すすいで下します。
    2. その後、アルコール70%(6分)、80%(6分)、95%(5分)、95%(5分)、100%(1分)、および100%(1分)で組織を脱水する。
    3. 100%アルコール:キシレン(1:1)を10分間浸漬し、次いでキシレンに2倍の5分間浸漬して組織を明らかにする。
    4. パラフィンワックス(56°C)で組織を1時間1時間に2回浸潤し、パラフィンに直接浸漬する。
    5. 組織を室温(RT)でパラフィンブロックに埋め込み、断面するまでRTで保存します。
  4. 組織切断
    1. マイクロトームで8 μmの厚さの冠状動脈または矢状のセクションに組織を切断し、水上の接着剤ガラススライドに代替シリーズのセクションを収集し、38 °Cで温めます。
    2. 一晩37°Cのセクションでスライドを乾燥させます。
  5. 組織切片の脱パラフィン化と水分補給
    1. キシレンに5分間浸漬することにより断面を脱ワックスし、続いて3分間キシレンに浸漬する。
    2. その後のスライド浸漬をアルコール100%II(1分)、100%I(1分)、95%(1分)、75%(1分)、50%(1分)、dH2 O(5分)に浸して後続のスライドで水分補給します。
      注:反応を開始する前にセクションを完全に脱ワックスします。セクションにパラフィンの痕跡がまだある場合は、キシレンに5分以上浸漬を行います。
  6. 抗原検索
    1. ク硝子バッファー(0.01M、pH 6.0)で断面を処理し、溶液中にスライドを浸し、電子レンジで最大電力で5分間加熱します。
    2. セクションを冷やしましょう。
    3. 抗原の検索を完了するために、最大の電力でマイクロ波で5分のサイクルを繰り返します。
      1. クエン酸バッファー(0.01M、pH 6.0)をdH2Oの100mLで2.10g、クエン酸200mLでクエン酸ナトリウム(0.01M)をクエン酸(0.01M)で1.4mに溶解してクエン酸を1.01Mで調出します。6 HCl 0.1Nを使用する。
  7. 内因性ペルオキシダーゼの遮断
    1. 溶剤耐性ペンでスライド上の組織領域を区切ります。
    2. トリスバッファー生理生理液(TBS)(0.1 M、pH 7.3)で、セクションを3回、5分ずつすすいでください。
      1. dH2O の 950 mL で 12.1 g のトリズマ塩基と 9 g の NaCl を溶解して 0.1 M TBS を準備し、HCl 0.1N で pH 7.3 に調整します。
    3. RTで5分間0.75%H2 O2の溶液中に浸漬スライドすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断する。
      1. dH2Oの195mLに30%H2O2の5mLを溶解する0.75%H2O2溶液を調出す。
        注:ndogenous酵素は、IHC試薬と反応し、偽陽性の結果を得ることができます。さらに、血管の高い組織は、多くの内因性ペルオキシダーゼを発現し、強烈な非特異的染色および背景レベルにつながる可能性がある。0.75% H2O2クエンチを使用した治療は、内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、非特異的な背景を有意に減少させます。
  8. 非特異的のブロッキングビンディng 部位および組織透過性
    1. 一次抗血清(NRS)を含むTBS/0.4%トリトン(TBS-T)ブロッキングバッファーを用いて組織切片をインキュベートし、RTで30分間非特異的結合部位を遮断する。
      1. TBSの100mLでトリトンX-100の0.4mLを溶解することにより0.4%トリトンを準備します。
      2. 0.4%トリトンX-100を含有するTBSで1%正常血清を溶解することによりブロッキングバッファーTBS-T溶液を調製する(通常血清の1mL+TBS+0.8mLの0.48トリトンX-100)。
        注:二次抗体の宿主に応じて動物血清の種を選択する(例えば、ヤギの抗ウサギ二次抗体を使用する場合、正常なヤギ血清を使用する)。
  9. 一次抗体を用いた組織インキュベーション
    1. TBS-Tで希釈した一次抗体を使用して、RTの湿った箱で一晩セクションをインキュベートします。次の一次抗体でセクションを染色します。
      1. OX-2Rに対するヤギ抗体は、タンパク質のC末端を認識する1:200を希釈した。
      2. OX-Aに対するヤギ抗体は、タンパク質のC末端を認識する1:200[オレックスシン-A(C-19))]を希釈した。
        注:一次抗体が目的とする生体分子と反応することを確認してください。一次抗体が遺伝子アライメントを使用して反応する生体分子のエピトープを定義します。例えば、OX-AエピトープはヒトOX-A(O43612)のaa 50-100の間にマッピングされているのに対し、OX-2RエピトープはヒトのC末端で最後の50 aa付近にマッピングされている。
  10. 二次抗体を用いた組織インキュベーション
    1. 0.1 M TBS(pH 7.3)で、セクションをそれぞれ5分間3倍ずつすすいでください。
    2. ビオチン化二次抗体とウサギの抗ヤギ免疫グロブリン(H+L)をビオチンと結合してRTで1.5時間の切片をインキュベートし、その後TBS-Tで1:100を希釈する。
      注:一次抗体と二次抗体の両方の異なる希釈をテストして見つけ、背景の減少を可能にする最適な希釈を見つけます。
  11. ペルオキシダーゼ反応
    1. 0.1 M TBS(pH 7.3)で、セクションをそれぞれ5分間3倍ずつすすいでください。
    2. アビジンビオチン複合体(ABC)で1時間の切片をインキュベートします。
      1. ABC溶液を調べ、TBSの5mLに成分Bを2滴加え、続いて成分Aを2滴添加する。
    3. 0.1 M TBS(pH 7.3)で、セクションをそれぞれ5分間3倍ずつすすいでください。
    4. 染色体基板3,3'-ジアミノベンジジン-4(DAB)でセクションを処理します。
      1. DAB染色剤濃縮物の1滴(約30μL)をDAB希釈剤の1mLに添加したDAB溶液を調べ、使用前によく混ぜる。
        注:使用前に少なくとも30分ABC溶液を準備し、安定したアビジン/ビオチン結合を可能にするために使用するまで4°Cで複合体を維持してください。新鮮なDAB作業溶液を準備し、組織部に適用し、色が適切になるまで開発する。発色反応がエピトープ部位を茶色に変換し、信号の強度がイメージングに適している場合は、次のステップに進みます。DAB開発のタイミングは、数秒から10分まで変化する場合があります。OX-AおよびOX-2R 1の場合、2分で十分です。発がん性があるので、DABは細分化して取り扱います。
  12. 組織の脱水および取付け
    1. DAB反応を止めるために0.1 M TBS(pH 7.3)で、すべてのセクションを3x3分ずつ5分間すすいでください。
    2. アルコール50%(2分)、75%(2分)、95%(2分)、100%I(2分)、100%II(2分)で後続のスライド浸漬によって断面を脱水する。
    3. 各10分のキシレンに浸漬2xによってスライスを明確にする。
    4. StologyにDPX(ジブチルフタル酸エステルキシレン)マウントでセクションを取り付け、スライドに2滴の取り付けメディアを追加し、カバースリップでゆっくりとトッピングします。
      注:脱水中にアルコール濃度を増加させる組織の浸漬は、組織のアルコール浸透とアルコールとの水の置換をもたらすので、正確な脱水時間を決定し、組織を過度に脱水しないでください。脱水後にキシレンに浸漬を行い、組織を明確にし、過剰または残りのアルコールを除去する。
  13. コントロール
    1. セクション1.1〜1.12を繰り返し、一次抗体を省略し、一次抗体または二次抗体IgGをTBS(陰性対照)によって置換する。
    2. セクション1.1〜1.12を、相対ペプチドの過剰を有する各一次抗体を事前吸収する(希釈抗血清の100mg/1mL)を繰り返す。
    3. 正の対照として異なる組織を用いてセクション1.1~1.12を繰り返す(例えば、マウス組織)。
      注: 開始直前に、すべてのバッファを新たに準備してください。各工程の余分な流体を、セクションの周りにピペットまたはフィルターペーパーで慎重に取り除き、常にセクションを濡らしたままにします。
  14. 画像の取得と解析
    1. デジタルカメラを搭載した顕微鏡を使用して、一定の光照明下で、同じ倍率でデジタル画像を取得します。
    2. イメージングソフトウェアを使用して染色強度の半定量分析を実行します(材料の表を参照)。
      1. OX-AまたはOX2-R陽性のインデックスを評価するために、キャプチャした画像を.lifまたは.tiffファイル形式で開きます。
      2. [測定]の下にあるボタンを選択し、[手動 Counting] をクリックします。マウスをクリックして正のセルにマークを付け、画面から直接染色された細胞プロファイルの数をカウントします。
      3. 目的領域(ROI)領域(3 x 103 μm2)を選択して、免疫信号密度(光学密度、OD)を定量します。
      4. 分析画像内で最も高い強度(高い正度)と最小強度(負)のピクセルを決定し、背景の値としてゼロを割り当てます(すなわち、染色された細胞を欠いている組織の一部)。
      5. 吸光度の対数スケールで作業して OD を評価します。デジタル 画像解析では、DAB ピクセル強度の範囲は、最も暗い (0 値) から最も明るい (255 値) シェードです。
      6. ログ10(255/I) のヒストグラムをプロットして OD を決定します。
        注:永久的で安定した免疫ペルオキシダーゼ反応は、いつでも明視野顕微鏡下で分析することができます。隣接するセクションから同じセルの二重カウントを避けるために、代替セクションで標識されたセルのカウントを実行します。

2. 免疫蛍光プロトコル

  1. 組織解剖
    1. セクション1.1に記載されているように動物を犠牲にし、解剖する。
  2. 組織固定
    1. 4°Cで4%PFAで3時間浸漬して腸と脳を固定します。
      1. セクション 1.2.1 のように PB と 4% PFA を準備します。
        注:固定の時間は、組織のサイズに依存します。4〜6時間を超える組織固定は、抗原をマスクし、抗体-エピトープ結合を制限するオーバーフィックスにつながる可能性があります。
  3. 組織埋め込み
    1. 0.1 M PB(pH 7.4)で、組織をそれぞれ3分5分ずつすすいで下ろします。
    2. 凍結保護のために、組織をPB(0.1M、pH 7.4)で20%ショ糖に移し、4°Cで一晩保管してください。その後、0.1 M PB(pH 7.4)で30%ショ糖に組織を移し、4°Cでさらに夜を保ちます。
    3. 最適な切断温度(OCT)化合物のブロックに組織を埋め込みます。これを行うには、液体窒素の小さなデュワーを準備し、アルミ箔を取り、フライパンを作成するために半分にそれをカットします。OCT化合物で満たされた組織を含むパンは、OCT化合物が冷却されるまで液体窒素中に浸漬されなければならない。凍結した組織は断面まで-80°Cで貯えることができる。
  4. 組織切断
    1. 凍結した組織ブロックを-20°Cのクライオスタットに移し、10μmの冠状動脈または矢状切片で切断する。
    2. 免疫組織化学に適した接着剤ガラススライドに代替シリアルセクションで組織を収集し、使用するまで-20 °Cに保存します。
      注:暗いスライドボックスまたはスライドブックに-20 °Cと4 °Cの間のスライドを保管してください。
  5. 非特異的結合部位および組織透過性の遮断
    1. 溶剤耐性ペンでスライド上のティッシュ領域を区切ります。
    2. 0.1 M PB(pH 7.4)で、セクションを3xを5分間5分間すすいでください。
    3. 透過性バッファーPB-Triton X-100 0.3%(PB-T)に溶解した1%の正常ロバ血清を用いて切片をRTで30分間インキュベートし、細胞膜を透過し、非特異的結合部位を遮断する。
      1. トリトンX-100 0.3%溶解トリトンX-100 0.1 M PB(pH 7.4)の100mLで0.3 mLを溶かします。
      2. 0.3%TritonX-100を含むPB中に1%正常なロバ血清を溶解するブロッキング溶液を調製する。
        注:透過性および遮断バッファーに使用される血清の動物種は、二次抗体の宿主に依存する。
  6. 一次抗体の混合を伴うインキュベーション
    1. 0.1 M PB(pH 7.4)で、セクションを3xを5分間5分間すすいでください。
      1. PB-Tで希釈した一次抗体を混合して、RTの湿気のある箱で一晩セクションをインキュベートします。一次抗体の混合物は、1:100希釈CB1Rに対するヤギ抗体を希釈1:100、または1:100希釈したCB1Rに対するヤギ抗体を希釈した1:100に対して使用することができる。
  7. 二次抗体の混合を伴うインキュベーション
    1. 0.1 M PB(pH 7.4)で、セクションを3xを5分間5分間すすいでください。
    2. 1)ロバの抗ウサギAlexa Fluor 488-共役二次抗体とロバ抗ヤギAlexa Fluor 594-共役二次抗体の混合物をPB-Tで1:100に希釈したRTで2時間のセクションをインキュベートします。または2)ロバの抗ヤギAlexa Fluor 488-共役二次抗体とロバ抗ウサギアレクサフルオール594-共役二次抗体の混合物は、PB-Tで1:100を希釈した。
      注:同じ動物宿主で開発された二次抗体を使用してください。正常な血清は、二次抗体の同じ種に属していなければならない(例えば、ロバおよびロバ正常血清で開発された二次抗体を使用する)。洗剤を含むブロッキングバッファーを用いて一次抗体と二次抗体を希釈し、細胞透過性を高め、背景を減少させる。
  8. ティッシュの取付け
    1. 0.1 M PB(pH 7.4)で、セクションを3xを5分間5分間すすいでください。
    2. 核染料DAPI(4',6-diamidino-2-フェニリンドール)で断面を反染料化し、PBの3mLで1.5μLのDAPI(1mg/mL)を溶解させた。
    3. 取り付け媒体付きカバースリップスライド(「材料の表」を参照)。この水性取り付け媒体は、組織サンプルと汚れを安定させ、長期使用を可能にします。蛍光試料は4°Cで暗闇の中に保存することができる。フッ素の寿命を延ばすには、防取取り付け媒体を使用してください。
      注:良好な取り付け媒体を選択してください。取り付け剤の最も重要なパラメータの1つは屈折率(nD)で、ガラスの屈折率は約1.5である必要があります。ここで用いられる取り付け媒体は、特に酵素および脂質決定のために調製された試料(すなわち、上昇一連のアルコールで脱水してはならない試料)で使用することができる。
  9. コントロール
    1. セクション2.1〜2.8を繰り返し、一次抗体または二次抗体を省略するか、またはPB(陰性対照)を用いた一次または二次抗セラを特定のステップで置換する。
    2. セクション2.1〜2.8を繰り返し、各一次抗体を過剰な対照ペプチド(希釈抗血清の100mg/1mL)で事前吸収する。
    3. マウス脳のスライス(正のコントロール)のセクション2.1-2.8を繰り返します。
      注: 開始直前に、すべてのバッファーを新たに準備します。各工程でピペットまたはフィルターペーパーをセクションの周りに慎重に取り除き、常にセクションを湿気に保ちます。
  10. 画像取得
    1. X-y-z電動ステージ、デジタルカメラ、NIS-エレメントCなどの集録および画像解析ソフトウェアを搭載した共焦点顕微鏡を使用して、免疫染色された切片を観察し、分析します。5-20-40倍の目標を使用してデジタル画像を取得します。
    2. 低倍率モンタージュを構成するために利用可能な各チャンネルで低倍率(10倍または20倍の目的)で各セクションの画像を撮り、OX-2R/CB1Rのローカリゼーションと文書化を容易にするために地域全体の概要を提供します解剖学的共発現。蛍光画像を最大のコントラストとオーバーレイに分析する前に正規化します。
    3. 関心のある領域全体の画像のシリアルZスタックを収集します。OX-2R/CB1R共発現が黄色のパンクタとして視覚化される組織体積をカバーするために、1〜1.8 μmの焦点ステップを持つ6つの焦点面(Zステップ)を介して画像を取得します。Z電動顕微鏡を使用して、チャンネルごとに(赤、緑、青)を別々にこのコレクションを行います。
    4. イメージングデコンボリューション ソフトウェアを使用して、10 回の反復の適用によってイメージをデコンボルブし、シリアル Z 平面イメージを 1 つの最大投影イメージに折りたたみます。
    5. Adobe Photoshop 6.01 (アドビシステムズ、サンノゼ、カリフォルニア州) を使用して、光とコントラストの顕微鏡グラフを調整します。
      注: 観察中にデコンボリューション ステップを実行して、背景をさらに小さくします。光の漂白を防ぐために、スライドの露出を光に制限します。
  11. 画像解析
    1. 各動物の対象領域をすべてカバーすることにより、交互に10μmの厚い断面(n =5匹の動物)でOX-2R/CB1R共発現の定量分析を行います。
    2. 画像解析の半自動化システムを用い、OX-2R/CB1R共発現を黄色陽性パンクタ数として定量化する。Imaginsソフトウェアは、異なる蛍光プローブ間の重複領域に関する定量的データで、より高い詳細レベルを提供することができます。
    3. 2 つのチャネルの信号強度に対するしきい値ツールを使用して、パンクタを定量化します。.liff、.tiff、または .jpg イメージ ファイルを開き、[イメージ- しきい値]を選択します。[自動設定]または[手動方法]を選択し、すべての汚れたパンクタが選択されるまでしきい値を調整します。免疫標識されたオブジェクトを含まないイメージの領域のピクセル強度の分布を分析して、背景しきい値を取得します。画像ごとにこの背景を個別に決定します。次に、ピクセル強度のベースラインをバックグラウンド値に設定することで、バックグラウンドしきい値を削除します。
    4. [分析-測定]を選択し、測定するパラメータ(パンクタ強度最小値、最大値、平均値、免疫標識されたパンクタの数/密度)を選択します。
    5. 各セクションの4 Zスタックの組織の体積に沿って黄色のパンクタを数え、最良の焦点面に直下のスタックを使用します。フォーカス外の領域を解析から除外します。
      注: 隣接するセクションから同じセルを二重カウントしないように、代替セクションで標識されたセルのカウントを実行します。

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結果

免疫ペルオキシダーゼ染色の代表的なデータを図1および図2に示す。成体ゼブラフィッシュの腸内におけるOX-AおよびOX-2R分布の免疫組織化学的分析は、OX-AおよびOX-2Rの異なる局在部位およびDIOゼブラフィッシュの腸細胞における発現の増加を示した。前腸および前腸の細胞においてOX-Aに対する強烈な褐色染色が認められた(図1A,A1)。OX-Aの免疫発現は、異なる腸内腸内で明確なシグナルを発し、前部から中間腸に向かって減少した(図1B、B1)。負の対照は、背景の基準として使用され、OX-A信号の特異性を確認した(図1E)。染色体DABへの長期暴露は、背景強度の増加をもたらした(図1D)。DIOおよびコントロール食ゼブラフィッシュの腸にお...

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ディスカッション

サンプル調製

サンプル調製は、IHCの最初の重要なステップです。信頼性の高いプロトコルは、細胞形態、組織構造、および抗原性の維持を可能にします。このステップでは、正しい組織収集、固定、および断面22、23が必要です。固定の目的は、組織を保存し、組織酵素や微生物の作用を減らすことです。特に、固定工程は、細胞成分および生体分子を保存し、細胞成分(抗原や酵素など)の自己分解およびシフトを防止し、以下の手順の回避効果に対して細胞材料を安定化させ、免疫染色4、7、24を容易にする。

断面化の前に、組織は、パラフィン埋め込み(免疫ペルオキシダーゼ法)または凍結保存(クライオメディアで凍結、複...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しない。

謝辞

この研究は、サンニオ大学フォンディ・リサーカ・ディ・アテネオ(FRA)2015-2016によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アンチCB1アブカムab23703
アンチOX-2Rサンタクルーズsc-8074
アンチオキササンタクルーズsc8070
アクアテックスメルク1,085,620,050
ビオチン化ウサギ 抗ヤギベクターラボBA-5000
クエン酸シグマ アルドリッチ251275
共焦点顕微鏡ニコンニコン エクリプス Ti2
クライオスタットライカバイオシステムCM3050S
DAPIシグマ アルドリッチ32670
デジタルカメラライカバイオシステムDFC320
共焦点顕微鏡用デジタルカメラニコンDS-Qi2
ロバ アンチヤギ アレクサ 蛍光 488-共役二次抗体サーモフィッシャーA11055
ロバ抗ヤギ アレクサフルーア 594標識二次抗体サーモフィッシャーA11058
ロバ抗ウサギ アレクサフルーア 488標識二次抗体サーモフィッシャーA21206
ロバ抗ウサギ アレクサフルーア594標識二次抗体サーモフィッシャーA21207
タノール絶対VWR20,821,330
凍結切片化合物ライカバイオシステムFSC 22 凍結切片 メディア
H2O2シグマ アルドリッチ31642
HClVWR20,252,290
ImmPACT DABベクターラボSK4105
顕微鏡ライカバイオシステムDMI6000
ミクロトームライカ バイオシステムRM2125RT
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS7653
NaH2PO4H2OSigma AldrichS9638
NaOHSigma AldrichS8045
ノーマル ロバ血清Sigma AldrichD9663
ノーマル ウサギ セラムベクターラボS-5000
パラフィンワックスカルロエルバ46793801
パラphormaldeydeシグマアルドリッチP6148
エン酸ナトリウム二水和物グマアルドリッチW302600
トリトンX-100フルーカ分析93420
トリズマシグマアルドリッチT1503
ベクタステインエリートABCキットベクターラボPK6100
キシレンピュアカルロエルバ392603
エクシ

参考文献

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