ゼブラフィッシュ胚を用いる化学化合物の毒性の迅速評価

医薬品開発は高価なプロセスです。単一の化学化合物が食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって承認される前に、数千の化合物が10億ドル以上の費用でスクリーニングされます1.前臨床開発の間、この費用の最も大きい部分は動物実験2のために要求される。コストを制限するために、医薬品開発の分野の研究者は、化学化合物3の安全性スクリーニングのための代替モデルを必要とします。したがって、薬剤開発の初期段階では、適切なモデルにおける化合物の安全性および毒性を迅速に評価できる方法を用いることは非常に有益であろう。動物および細胞培養モデルを含む化学化合物の毒性スクリーニングに使用されているいくつかのプロトコルがありますが、検証され、一般的に使用される^単一のプロトコルはありません 4,^5.ゼブラフィッシュを使用する既存のプロトコルは、長さが異なり、利便性要件6、7、8、9、および、その利便性要件に従って毒性を評価した個々の研究者によって使用されています。^{10歳,11歳,12}.

最近では、ゼブラフィッシュは、胚発生^時の化学化合物の毒性の評価のための便利なモデルとして浮上している 6,⁷.ゼブラフィッシュは、化学^化合物13の評価のための多くの内蔵の利点を有する。ゼブラフィッシュメスは、急速にex vivoを開発し、200〜300個の卵のバッチを産むことができるので、大規模な実験でさえ、1週間まで外部摂食を必要とせず、透明である。化合物は、彼らが(化合物の性質に応じて)絨皮を通して拡散することができ、そして孵化後、皮膚、エラおよび幼虫の口を通して、水に直接添加することができる。実験は、胚の小さなサイズのために大量の化学^化合物14を必要としない。ゼブラフィッシュ胚の開発は、正常な発達結果を達成するために必要なタンパク質のほとんどを発現する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、潜在的な薬物が発達的に重要なタンパク質またはシグナル伝達分子の機能を妨げることができるかどうかを評価する敏感なモデルである。ゼブラフィッシュの器官は2-5 dpf¹⁵の間で機能し、胚発生のこの敏感な期間中に有毒である化合物は、ゼブラフィッシュ幼虫のフェノティピック欠陥を誘発する。これらの型分法の変化は、侵襲的な技術^を用いずに単純な顕微鏡を用いて容易に検出することができる11.ゼブラフィッシュ胚は、細胞培養モデル16,17を用いてインビトロ薬物スクリーニングに比べて生物学的複雑性が非常に大きいため、毒物学的研究に広く使用されている。 脊椎動物として、ゼブラフィッシュの遺伝的および生理学的構成はヒトに匹敵し、したがって化学化合物の毒性はゼブラフィッシュ^とヒト8、18、19の間で類似している。^{20歳,21歳,22.}ゼブラフィッシュは、したがって、化学化合物の毒性および安全性の評価のための創薬の初期段階における貴重なツールである。

本稿では、1~5日間の受精後受精(dpf)ゼブラフィッシュ胚を用いて炭酸アンヒドラーゼ(CA)阻害剤化合物の安全性と毒性を評価するために用いられる方法の詳細な説明を、単一の研究者による。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚を異なる濃度の化学阻害剤化合物に暴露し、胚発生時の死亡率および先記異動の変化を研究することを含む。化学化合物への曝露の終わりに、化学物質のLC50用量が決定される。この方法は、個人が1〜5の試験化合物の効率的なスクリーニングを行うことを可能にし、方法を持つ人の経験に応じて約8〜10時間かかります(図1)。化合物の毒性を評価するために必要な各ステップは、図2に概説されています。CA阻害剤の毒性の評価は8日を必要とし、交配ペアの設定を含む(1日目)。繁殖タンクから胚のコレクション, 洗浄し、28.5 °Cインキュベーターに転送 (2 日目);24ウェルプレートのウェルへの胚の分布と希釈されたCA阻害剤化合物の添加(3日目)。幼虫のフェ記視分析および画像化(4~8日目)、_{およびLC50}用量(day8)の決定。 この方法は、迅速かつ効率的であり、少量の化学化合物と実験室の基本的な設備のみを必要とする。

タンペレ大学のゼブラフィッシュコア施設は、国立動物実験委員会(ESAVI/7975/04.10.05/2016)によって認可された設立許可を受けています。ゼブラフィッシュ胚を用いたすべての実験は、東フィンランド州政府、タンペレ地域サービスユニットプロトコル#LSLH-2007-7254/Ym-23の社会保健省に従って行われた。

1. 一晩ゼブラフィッシュ交配タンクのセットアップ

1. 2-5成人の雄ゼブラフィッシュと3-5大人の雌のゼブラフィッシュを一晩交配タンクに入れます。(繁殖は一晩自動暗いと光サイクルによって午前中に誘発されます)
2. 2つ以上の化学化合物の毒性を評価するのに十分な胚を得るためにいくつかの十字架を設定します。毒性の評価のために、各濃度は20個の胚23以上を必要とする。
3. 動物へのストレスを処理しないようにするには、動物が繁殖のために同じ個体を使用する前に2週間休息できるようにします。

2. 化学化合物への曝露のための胚の採取とプレートの準備

1. 胚を収集し、翌日の正午前に、微細メッシュストレーナーを使用して、E3胚培地[5.0 mM NaCl,0.17 mM KCl,0.33 mM CaCl 2,0.33 mM MgSO_4、および0.1%w/vメチレンブルー]を含むペトリ皿に移します。
2. プラスチック製のパスツールピペット(食品や固形廃棄物など)を使用して破片を除去します。立体顕微鏡下の胚の各バッチを調べて、未受精/死んだ胚(不透明な外観によって識別される)を除去する。
3. 胚をインキュベーターで28.5 °Cに保ちます。翌朝、立体顕微鏡下で胚を調べ、不健康または死んだ胚を取り除く。また、古いE3培地を新鮮なE3培地に置き換えます。
   注:ゼブラフィッシュ胚は、実験室の条件下で常に28.5 °Cで維持されています。
4. 胚を覆うのに十分なE3培地を含む24ウェルプレートの各ウェルに1個の胚を慎重に移します。

3. 化学化合物のストック溶液の調製と希釈化合物の井戸への分布

1. 4°Cに保存した阻害剤化合物を含有するバイアルを取り出す。
   注:化合物の特性に応じて、これらは異なる温度で格納されます。
2. 化合物の数ミリグラム(mg)を正確に重量を量ることができる分析バランスを使用して化合物を重量を量る。
3. 化合物の溶解性特性に基づいて、適切な溶媒(例えば、E3水またはジメチルスルホキシド(DMSO))内の各化合物に対して少なくとも250 μL(100mM)のストック溶液を調出す。
   注:上記の手順は、便利な時間に実験開始の前日に行うことができ、4 °Cで保存することができます。
4. 15 mL遠心管でE3水を使用して、ストック溶液のシリアル希釈(例えば、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、300 μM、500 μM)を作ります。
   注:連続希釈の濃度と数は、その毒性レベルに応じて、ある化合物から別の化合物に異なります。
5. 胚を含む24のウェルプレートから、パストゥールピペットと1 mLピペット(1dpf胚を含む)を使用して井戸からE3水を一列に取り除きます。
6. 各ウェルに各希釈剤の1 mLを分配し(低くからより高い濃度に移動する)24ウェルプレートのウェルに分配します。
7. 胚の同じバッチから対照群を設定し、対応する希釈剤量を追加します。
8. 化合物の名前と濃度を持つ24ウェルプレートにラベルを付け、インキュベーターで28.5 °Cのプレートを保ちます。

4. 立体顕微鏡を用いた胚の型分分析とイメージング

1. 化学化合物に曝露した後、24時間のパラメータを立体顕微鏡下で調べます。
   1. 死亡率、孵化、心拍、黄身袋の利用、水泳膀胱発達、魚の動き、心膜水腫、および体の形状23などのパラメータに注意してください。
   2. 化合物の各濃度にさらされた幼虫を取り、金属プローブを使用して3%高分子量メチルセルロースを含む小さなペトリ皿に横に置きます。
      注:3%メチルセルロース(高分子)は、顕微鏡検査に必要な向きで魚を埋め込むのに必要な粘性液体です。この液体の魚の向きのために、金属の調査は必要とされる。
   3. カメラに取り付けた立体顕微鏡を使用して画像を撮影します。実験が終わるまで、毎日別々のフォルダに画像を保存します。
   4. オンライン テーブルまたは印刷シートに、毎日テーブルにすべての観測値を入力します。
   5. 化合物が神経毒性である場合、4~5dpf幼虫は、変化した泳ぎパターンを示し、異常な運動パターンを示す幼虫の短い(30~1分)ビデオを捕捉することによって、そのような変化を記録する。
   6. 化学化合物への暴露の5日後、各化学物質の半分の最大致死濃度50(LC50)を計算するために胚の半分が死ぬ濃度に注意してください。
      注:LC50は、胚の50%が化学化合物への曝露の5日の終わりに死ぬ濃度である。化合物23の各濃度の毒性をテストするために、少なくとも20個の胚を使用する。
   7. 適切なプログラムを使用して、すべての濃度の胚の死亡率のための曲線を構築します。

毒性の評価の重要な部分は、単一の実験で1つまたは複数の化学化合物の異なる濃度をテストすることです。最初に、毒性の評価のための化合物を選択し、各化合物についてテストする濃度の数、およびそれに応じて、チャートを作成します(図3)。各化合物に固有の色を使用してサンプルを整理しました(図3)。溶剤耐性マーカーの使用とプレートの底部または側面の標識は、後で混同を避けるために重要です。 化合物が異なる濃度の阻害剤にさらされた幼虫の形性欠損を誘発する場合、欠陥は1〜5 dpf(図4A、B、C、D)の期間にわたって24時間ごとに記録される。500μMの濃度で既知のCA IX阻害剤で処理された胚は、化学化合物への曝露の1〜5日間における明らかな型形変化を示さなかった(図4B)。図4Cと図4Dは、3日目でも様々な形分性欠損を誘発したβ-CA阻害剤で処理した胚(矢印頭部)、湾曲した体構造(矢印)、未利用の黄身袋および心膜性眼腫(矢印頭部)を示す。化学化合物(矢印)で処理した後5日目に幼虫にオトリス嚢が存在しない。別の研究では、CA阻害剤(図4E)で処理された胚は、オトリス嚢および水泳膀胱(矢印頭部)の不在を示す。我々の研究(図4C,D)では、CA阻害剤への曝露の1日目以降も、型表欠損(壊れやすい胚および色素沈着の欠如)を文書化した。表現型分析は、阻害剤化合物の一部が致死的であり、ヒト用の薬剤として開発できないことを示した(図4C、Dおよび表1)。

実験は、胚発生時に最小または無同性変化を誘導する代表的な化合物を同定し、高いLC50用量を示した(図5)。潜在的に人間の使用のための薬物候補に開発することができます16.化合物にさらされた幼虫の静止画を見ると、見状欠損は見られなかった(図4B)。しかし、CA阻害剤への曝露の5日後に幼虫に神経毒性および誘導運動失調性であることが判明した(図6)。この表現型は、ゼブラフィッシュ幼虫の水泳行動を顕微鏡下で直接観察することによってのみ検出することができた。これらの研究は、ゼブラフィッシュ幼虫の神経発達が化合物16,17に敏感であることを示唆した。

図1:ゼブラフィッシュ胚を用いて化学化合物を迅速にスクリーニングするのに必要な時間数:1組の実験では、実践的な経験を持つ人は、24ウェルプレートのゼブラフィッシュ胚を使用して、約5つの化学化合物(各化合物は、最低6希釈を必要とする)をスクリーニングすることができます。合計で、十字架の設定から8日間のLC50判定を行うのに約8〜10時間かかります。

図2:化学化合物の毒性評価の内訳を示す図。化学化合物の毒性スクリーニングは8日を必要とし、5つのステップに分けることができます。(1日目)タンク内のゼブラフィッシュ交配ペアの設定で構成されています。(2日目)交配タンクからペトリ皿に胚を集め、その後、一晩28.5°Cのインキュベーターでそれらを維持することを含みます。(3日目)立体顕微鏡を用いて胚を検査し、胚を洗浄する。胚を24ウェルプレートに分布させ、試験化合物の希釈を加える。(4日目~8日目)発達欠陥に対する幼虫の毛虫のフェトピピック分析水泳パターン研究及びLC50判定は、化合物への曝露最終日に行った。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:毒性評価に関わる実験の概略表示毒性評価は、化学化合物に関する情報、化合物の希釈および評価されるパラメータを含む表化チャートを作成して構成される。15 mL遠心管(24ウェルプレートの各行に追加される1つのチューブからの希釈)で所望の濃度にストック溶液の希釈を行います。試験化合物の名前、各行の濃度、および暴露日を持つ防水マーカーでマークされた24ウェルプレート。幼虫を3%高分子量メチルセルロースを含む小さなペトリ皿に移すことによって胚の検査とイメージング。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:コントロールおよび試験化合物処理群における幼虫の見型分析の例。(A)いずれの化合物で処理されなかった対照群幼虫の毛虫のフェノチピック分析は、顕微鏡下での見型欠損を示さなかった。(B)500μM CA阻害剤で処理した幼虫(炭酸アンヒドラーゼIXの公知の阻害剤は、観察可能なフェノティピック欠陥を示さなかった。(C, D)開発中の幼虫をβ-CA阻害剤でそれぞれ250μΜMおよび125μMの濃度で処理した。化合物は、湾曲した体、心膜性うつま、および未利用の黄身嚢(矢印および矢印ヘッド)などの表現型欠損を誘発した。パネルAとBは、アスパトワールら16から変更されています。 パネルC、DおよびEは、異なる顕微鏡を用いて得られた未発表の画像を示す。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:1〜5dpfゼブラフィッシュ幼虫を用いて致死濃度50(LC50)の決定。ゼブラフィッシュ胚を用いて毒性評価を行い、実験終了時に化学化合物の最小致死濃度を決定することができます。 化合物のLC50濃度(公知のCA IX阻害剤)は3.5mMであった。高いLC50濃度は、化合物のさらなる特性評価を可能にする。この図は、Aspatwar et al.16から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:未処理(A)および阻害剤(B)群の幼虫群の両方における泳ぎパターン解析の一例。300 μM試験阻害剤化合物(ヒト炭酸アンヒドラーゼIXの公知の阻害剤)でパネルBで処理されたゼブラフィッシュ幼虫は、異常な(アタキシック)運動パターン(矢印ヘッド)を示し、その化合物が現像胚に神経毒性を誘導することを示唆した。.矢印は、水泳中に尾の通常の曲率を指します。パネルAでは、矢印は水泳中に尾の通常の曲率を指します。この図は、Aspatwar et al.16から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:スクリーニングした化合物の安全性及び毒性の概要。毒性評価実験は、研究者が試験された化学化合物の安全性に関する結論に達するのに役立ちます。LC50濃度は、さらなる特性化のための安全な濃度を定義することを可能にする。研究者は、調査中の化合物に胚の暴露の24時間後でも化合物が致命的であるかどうかを決定することができます。この例では、神経毒性による水泳に対する微妙な影響は重要な情報であり、さらなる実験の設定に役立ちます。したがって、毒性スクリーニングに基づいて、生体内24におけるさらなる特徴付けのためにCA阻害剤の安全濃度を用いた。

潜在的な利益相反は著者によって報告されなかった。