方法論記事

血管内皮細胞を直接観察するためにエンフェイス免疫蛍光染色を用いて

DOI：

10.3791/59325

⸱

2019年8月20日

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1Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここでは、マウス大様の内皮細胞を直接観察する免疫蛍光染色のためのプロトコルを提示する。この技術は、異なる流れパターンでの内皮細胞の細胞および分子表現型を研究し、アテローム性動脈硬化症の発症に有用である。

要約

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内皮表現型および形態の異常な変化は、アテローム性動脈硬化症の病因における初期事象であると考えられる。無傷の内皮を直接観察することは、機能不全の内皮細胞における細胞および分子事象を理解するための貴重な情報を提供する。ここでは、無傷の内皮表面の鮮明な画像を得て、その場で分子発現パターンを解析することを可能にする改変された顔免疫蛍光染色技術について述べる。この方法は、大器の異なる部位で内皮単層全体を観察するためのシンプルで信頼性が高い。この技術は、特に初期段階で、アテローム性動脈硬化症の病態生理学を理解するための有望なツールでありうる。

概要

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血管系の初期の変化は、主に内皮で始まり、細胞間接合複合体1を有する血液と血管壁との間の選択的障壁として機能する。実質的な証拠は、内皮機能2を調節する上で血流の機械的影響に対する重要な役割を指摘する。流体せん断応力は、血流によって発生する摩擦力を、内皮細胞形態および機能を差別的に形作り、異なる血管部位2、3における特定の流れパラダイムに応じて形成する。アテローム硬化性病変は、血管曲率、流れ分周器、分岐点などの乱れた血流(d-flow)の部位で優先的に発生し、動脈の直線セグメントなどの安定した流れ(s-flow)の領域と比較して起こる。したがって、内皮形態と分子発現パターンを直接観察すると、様々な流れパラダイム下の内皮細胞の構造的および機能的表現型に関する重要な洞察を提供する必要があります。

培養された内皮細胞は、流体せん断ストレス、周囲のサイトカイン、細胞外または細胞外マトリックス相互作用の影響の損失のために、生体内で行われるように実際の表現型を発現しない場合があります。これを助けるために、無傷の内皮細胞単層は、古典的な免疫組織化学を用いて横断的なセクションで研究することができる。しかし、内皮単層は非常に薄く壊れやすいので、通常ははっきりと観察することができません。エンフェイス免疫組織化学は、内皮の内面を観察するために使用されてきたが、内皮が下層組織から容易に取り除かれるか、またはラットまたはウサギの動脈壁の一部だけであるので、その結果は複雑または不安定である。その壁は厚く、4、5に取り付けられています。

マウスモデルは、多くの点で他の動物よりもかなりの利点を持っています。ここでは、C57BL/6マウスにおける大動脈アーチと胸部大動脈の内皮細胞を解析するために、改変された顔免疫蛍光技術を用いる。このような技術は、異なる流れパターンおよびアテローム性動脈硬化症6、7、8、9、10の発達において内皮病態生理学を研究するために広く使用されている。この方法により、科学者は内皮の表面全体を明確に観察し、異なる流体せん断応力下の領域における特定のタンパク質の発現パターンを比較することができます。

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プロトコル

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すべての動物実験は、上海Jiao Tong大学の動物資源委員会によって承認された実験プロトコルに従って行われました。

1. マウス大器の灌流

  1. 簡単に言えば、ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg体重)の食後注射で12週齢のC57BL/6マウスを麻酔する。尾をそっとつまんで適切な麻酔を確認します。
    注:動きが観察されない場合、動物は実験を開始するのに十分な麻酔を受ける。
  2. マウスの足を粘着テープでペーパータオルの積み重ねにテープで留める。
  3. 鉗子でマウスの皮膚を保持し、腹部から胸郭の上部にハサミのペアで皮膚をカットします。
  4. 胸部の下の腹腔を鋭いはさみで開きます。
  5. 鉗子で胸骨を持ち上げ、横隔膜を切る;その後、胸部腔を露出させるために胸部を切り取る。
  6. 肝臓のすぐ上の静脈カバを切り取り、はさみで切り取る。
  7. 圧力は、肺と肝臓が青くなるまで左心室を通して40単位/mLヘパリンを含むプレチルド正常生理食生を有する5分間の動脈木(100 mmHg)を注入する。次いで、リン酸緩衝生理食液(PBS、pH 7.4)で4%パラホルムアルデヒドを3分間予冷させた。
  8. 大器が露出するまで、すべての筋肉、臓器、脂肪を取り除きます。
  9. 解剖顕微鏡の下にマウスを置きます。

2. 大動脈の解剖と縦方向の開口部

  1. 解剖顕微鏡の下で大器をはっきりと露出させ、繊細な鉗子と繊細なはさみで、大断に沿った結合組織をできるだけきれいに取り除きます(図1)。
  2. 心臓からセリアックの幹に繊細なはさみで胸部大動脈を解剖し、PBSを使って6cmの細胞培養皿に大動脈を入れます。大断を縦方向に切り開き、小さい曲線に沿って、直線セグメントが満たされるまで大きな曲線に沿って開きます。図2に示すように、大動脈アーチの3つの枝を切り開き、左の一般的な頚動脈と左鎖骨下動脈を含む、マイクロシサーを使用して切り開く。

3. 大歯の前処理と免疫染色

  1. PBSで0.1%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを10分間透過し、12ウェル細胞培養プレートで室温で2.5%のポリソルベート20を含むトリスバッファー生理生理液(TBS)で10%正常ヤギ血清でブロックします。
  2. 次に、ブロックバッファー内の5g/mLウサギ抗VCAM-1および5g/mLラット抗VE-CADherinで大腸をインキュベートし、4°Cで一晩。
  3. 洗浄液(2.5%ポリソルベート20を含むTBS)でサンプル3xをすすいだ後、蛍光結合二次抗体(1:1,000希釈、アレクサフルオール555標識抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 488標識抗ラットIgG)を1時間に適用します。温度。洗浄液で3倍をすすいで下す。
  4. 大腸に4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)(1 μg/mL)で10分間大腸を塗り、洗浄液で3倍洗い流します。

4. ガラススライド上の大器の取り付け

  1. 大脳を明面を下にしてカバースリップに置き、カバースリップに落とされたアンチフェード取り付け液にゆっくりと移動します。大横をそっと伸ばして、検体を平らに保ちます。
  2. カバースリップを反転し、スライドガラスの上に置きます。試料とガラスの間に気泡が残らないよう注意が必要です。

5. 大器の観察

  1. レーザー走査共焦点顕微鏡で大器を調べます。
  2. Image-Pro Plus ソフトウェアを使用して、エンフェイスイメージの目的の領域から異なるチャンネルの色の強度を分析します。

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結果

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12週齢のC57BL/6マウスを安楽死させ、40単位/mLヘパリンを含む正常な生理食生を浸通し、次いで、4%のパラホルムアルデヒドを予冷させた。マウス大横を解剖顕微鏡下に露出し(図1)、解剖し、縦方向に切開した(図2)。血管内皮細胞のエンフェイス免疫蛍光染色は、図3および表1に示すように行った。血管細胞接着タンパク質-1(VCAM-1)の発現を内皮マーカーとしてVE-カドヘリンと共に表した免疫蛍光を、マウス大脳の異なる領域からの様々な流れパターン下で示した。DAPIはまた、より良い可視化のために細胞核を示すために逆染色された。内皮細胞と平滑筋細胞は、内皮細胞核が楕円形で、スピンドル型の滑らかよりも大きいため、顕微鏡下のZ-stackを見ると、細胞核の形態と容易に区別することができます。筋肉細胞核。代表的な顔画像を

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ディスカッション

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内皮は、脂質、炎症メディエーター、および流体せん断ストレス1、11、12を含む多数の前因性因子にさらされている。その場で内皮細胞を直接観察することは、傷害刺激に応じて細胞形態、細胞間接合、および分子発現パターンの変化を分析する特別な利点を提供する。

以前の研究は、動脈壁4、5の内皮を観察する2つの異なる顔免疫組織化学的技術を提供している。一つは、血管壁から内皮を剥離して内皮単層を得ることであり、これは習得が困難であり、動脈4の分岐部位で多くの内皮を失う可能性がある。もう一つは、説明したように動脈壁全体を取り付けることです。全マウント製剤は、実行し易く、ウサギとラット5、13の内皮単層全体...

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

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この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第81670451号、81770430)、上海ライジングスタープログラム(助成金第17QA1403000)、上海市科学技術委員会(助成金第17号)の支援を受けた。14441903002, 15411963700).

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
褪色防止封入剤ServicebioG1401
デリケート鉗子RWD ライフサイエンスF11001-11
デリケートハサミRWD ライフサイエンスS12003-09
解剖鉗子RWD ライフサイエンスF12005-10
MCIRO スプリングシザーRWD ライフサイエンスS11001-08
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(Triton X-100)AmrescoM143
Polysorbate 20 (Tween 20)Amresco0777
VCAM-1抗体Abcamab134047
VE-Cadherin抗体BD Biosciences555289
Alexa Fluor 555 標識 抗ウサギIgGinvitrogenA-31572
Alexa Fluor 488 標識抗ラットIgGinvitrogenA-21208
レーザー走査型顕微鏡 カールツァイス

参考文献

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  1. Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
  3. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  4. Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
  5. Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
  6. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000(2013).
  7. Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).
  8. Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
  9. Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
  10. Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
  11. Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
  12. Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
  13. Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).

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