方法論記事

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

DOI：

10.3791/59341

⸱

2019年3月31日

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Chemistry, Christopher Newport University

この記事について

サマリー

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ここでは、チアゾール オレンジをゲル電気泳動の実験で DNA の検出に使用するプロトコルを提案する.チアゾール オレンジの使用により、エチジウム ブロマイド除去、紫外線や青色光を蛍光検出を実現できます。

要約

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アガロースゲルを用いた DNA 電気泳動は、サイズによる DNA のフラグメントの分離が可能分子生物学研究所で一般的なツールです。分離後、DNA は汚損によって視覚化です。この記事は、チアゾール オレンジ染色する DNA を使用する方法を示します。チアゾール オレンジは一般的な染色方法を好意的に比較し、機密性の高い、安価な紫外線やブルーライト (サンプル破損しないように)、興奮、エチジウム ブロマイドよりも安全です。臭化エチジウムを用いた DNA 電気泳動実験を実行する、既に設置されて研究所一般に検出の UV ライトを使用して、既存のプロトコルを追加変更なしで染料を切り替えることができます。サンプルの損傷を防ぐため青色光検出は、青の光のソースと排出フィルターでさらに実現できます。青色光検出のため、既に設置されて研究所単に既存のプロトコルを追加変更なしで染料を切り替えることができます。

概要

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このメソッドの目的は、チアゾール オレンジ (する) を使用して蛍光検出のための agarose のゲルの DNA を識別するためにです。その低コスト、良好な安全性プロファイルのためチアゾール オレンジが学部教育研究所と研究所分子生物学、特にをおよびクローン作成を実行することで特定の利点を参照してください。

臭化エチジウムのまま agarose のゲルの DNA の検出のための最も一般的な染料です。それは非常に安価で得ることができる主な理由で、検出のため紫外線で励起を必要なだけ。両方のエチジウム ブロマイドとチアゾール オレンジが低い検出限界 (1-2 ng/車線)1で、高価ではありません。チアゾール オレンジをさらに強化、ただし、エチジウム ブロマイドに 2 つの主な欠点があります。

まず、エチジウム ブロマイドは特別な処理、配送、廃棄要件と変異原2チアゾール オレンジはあまり変異原性 (3-4 x より Ames 試験で変異原性)3,4と一般との破棄できます一般的な化学廃棄物。

第二に、エチジウム ブロマイドは検出の紫外光を必要とします。チアゾール オレンジは紫外線必要に応じて、同様に使用することができますが、青色光とも検出することができます。紫外線は、一般的に使用されるいくつかの顕著な欠点を持っています。最初に、それは目や皮膚に有害です。紫外線は、訓練を受けた専門家によって安全に使用できる、偶発的な肌や目に害 (機能的日焼けに似て) 研究所 UV 光からは未熟な科学者は特に珍しいことではありません。第二に、紫外線は、DNA サンプル5(結紮変換など) 下流の実験1,6、7の成功を減らす非常に有害です。青い光で検出が可能に (λex、最大= 510 nm (488 nm、470 nm はまた強力な励起を示す))、皮膚の損傷は発生しませんまたは DNA 損傷 (ただし、任意の強烈な光は目に有害なあります)、両方科学者へのリスクが大幅に低減サンプル。

臭化エチジウム; にのみ蛍光色素の代替ではないです。その利点は、コストです。網状赤血球染色8、1980 年代に発見され、DNA ベースの蛍光実験9,10、11,12,13の数のユーティリティを発見しました。現在複数の仕入先によって販売しています。親化合物の追加より高価な青い光 – 検出可能な商業染料と検出1紫外線や青色光を用いた電気泳動の間に同様に動作します。さらに他の染料が汎用電気泳動実験の EtBr 以上に、非常に低い DNA 濃度により敏感になる中、このような染料は多くのコンテキストで価.

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プロトコル

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1. ゲルの準備

注: 一般的なゲルの電気泳動のプロトコルも参照してください P.Y. 李ら。14。

  1. アガロースをミックス (~ 1 %w/v、特定のサイズ分離の割合を変えることができる) バッファー (ミニ ゲル (8 × 7 cm) を約 70 mL)。バッファーは、一般的泰 (トリス酢酸 EDTA、40 mM 20 mM 酢酸トリス 1 ミリメートルの EDTA、pH 約 8.6) または TBE (tris ホウ酸 EDTA、90 mM 90 mM ホウ酸トリス 2 ミリメートルの EDTA、pH 約 8.3))。
  2. 1.3 μ g/mL の最終的な集中にチアゾール オレンジを追加します。
    1. チアゾール オレンジ 10,000 x 原液 (13 mg/mL) に DMSO で溶解します。ない特に光に敏感中、使用されていない暗いときに格納します。このソリューションは室温で安定して 〜 ヶ月;長期的なストレージは、因数 (DMSO が標準的な冷蔵庫の凍結) を凍結によって成し遂げられるかもしれません。必ず完全に溶かし、使用前に冷凍のソリューションを再懸濁します。
      注: ゲルもと汚されることができるを電気泳動後 (手順 2.6 参照)。安全性プロファイルは、エチジウム ブロマイド、標準的な分子生物学の実験室の安全注意事項を維持する必要がありますにしばらくの間。
  3. アガロース、バッファー、および溶解するチアゾール オレンジ agarose の混合物を電子レンジ (約 60 秒)。一般にこのステップに「溶解」と呼びます。渦巻き模様 (5 s) 必要な場合に溶解を支援します。
    : 注優先する場合電子レンジ後も追加できます。
  4. 適切な櫛を含むゲル鋳造装置に注ぐ前に簡潔にクールにアガロース溶液を許可します。
  5. ゲルに固化するアガロース溶液を許可します。

2. 読み込みとゲルを実行

  1. まだ行っていない場合は、電気泳動装置にジェルを塗布します。
  2. (TAE または上記として TBE) 連続したバッファーを追加すると、ゲルの表面をカバーします。
  3. ローディングの染料を使用して DNA のサンプル (通常 10 μ L) をロードします。参考のため DNA サイズのはしごがあります。
  4. (ゲルは赤い陽極 (肯定的な) に向かって実行する必要があります) カバーと電極を取り付けます。
  5. 電圧を適用 (通常 ~ 100 v ミニ ゲルのゲルのサイズ必要がありますゲルを損傷を防ぐために変更された電圧) まで適切な距離を旅しているローディングの染料 (ミニ ゲルのおよそ 4-7 cm の距離に応じて異なりますが正確なアプリケーション)。
    チアゾール オレンジは正荷電エチジウム ブロマイドや他の多くの DNA 結合色素のようなメモ:。その結果、これらの染料は、DNA を electrophoresing の反対方向に移行されます。まで強化された分離のためのゲルを実行されるサンプル、最終的に染料が弱い染色の結果、小さな DNA 断片を分離します。これらのインスタンスでステップ 2.6 のようにゲルを染色する必要があります。このような状況は TO に一意ではありません、いずれか正荷電で可逆的に DNA と相互作用する色素は (、エチジウム ブロマイドを含むなど) この動作を示します。
  6. 場合はする前にゲルの鋳造 (ステップ 1.2)、チアゾール オレンジを含むバッファーのゲルを浸すことによって汚れを追加しました。
    1. (TAE や TBE) 十分なバッファーを準備 (約 20 分) を検出 1.3 μ g/mL チアゾール完全にゲルをカバーし、バンドが完全になるまで穏やかな攪拌とゲルを浸すオレンジを含みます。

3. チアゾール オレンジ agarose のゲル (UV transilluminator) の可視化

  1. 電気泳動装置と UV transilluminator 上の場所からゲルを削除します。
    注意: 紫外線は皮膚や眼に有害です。必ず適切な目 (ゴーグル) と顔 (顔面シールド) の保護を着用します。手手袋、長袖を着用する必要があります。
  2. 必要なカットは (それ以上の消化または結紮、例えば) のためのゲルからの DNA バンドを希望しました。切除中にショートとしての紫外線ゲルの可能な時間の長さを公開します。(DNA 色素) に関係なく紫外線は、DNA を破損します。
  3. 容易に入手できるキットまたはプロトコル15を使用してゲルのスライスから DNA を抽出します。

4. チアゾール オレンジ agarose のゲル (青色光 transilluminator または懐中電灯) の可視化

  1. 電気泳動装置と青色光 transilluminator (~ 470 nm 最大発光波長) 上の場所からゲルを削除します。また、青色 LED (~ 470 nm) ゲル (または上から下) で懐中電灯を向けることができます。
    注: 感度が低いエチジウム ブロマイドで青色光 transilluminator を使用している間は、エチジウム ブロマイドで染色 DNA はこの青色光のプロトコルを使用してを検出できます。
  2. 黄色発光フィルター (~ 560 nm longpass、ゴーグルまたは四角形) を使用して、DNA: チアゾール オレンジ錯体からフィルター ライトブルー, 蛍光可視化できます。
    注: 黄色発光フィルターなし非常にむずかしい青色光励起源の強度のための DNA バンドを検出します。
    注意: 青い光が鋭く延長 (対照的に UV)、組織損傷を与える能力を欠いている目を損傷する恐れが強烈な青い光にさらされると黄色発光ゴーグルまたはフィルターを使用する必要があります。
  3. 必要な場合は、さらにアプリケーションのためのゲルから目的の DNA バンドをカットします。
    注: 青い光が DNA を傷つけないので必要はありません急速にバンドをカットする (場合など 3.2 で紫外光励起を使用)。
  4. 容易に入手できるキットまたはプロトコル15を使用してゲルのスライスから DNA を抽出します。

5. イメージのキャプチャ

  1. ゲル イメージング装置で励起と放射の適切な設定を選択します。励起とチアゾール オレンジの発光 (λex、最大= 510 nm (488 nm、470 nm も紫外線の波長で強い励起だけでなく、強力な励起を示す); λem = 527 nm)、一般的なブルー光 – 検出可能な商業とほぼ同じ染料、楽器が使用できるフィルター設定のプリセットを持つようにします。
    注: 青い光 – 検出可能な商業染料のいくつかのフィルターの設定実際に有害な紫外線を使用して、励起、場合はバンドを切断する前にイメージングできるので、注意。イメージング後 DNA バンドが摘出される場合は、可能であれば青色光励起ソースを使用します。
  2. 適切なフィルターを持つ画像処理システムがない場合は、カメラとゲル/青色光励起源の間の黄色フィルターを配置します。

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結果

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チアゾール オレンジ エチジウム ブロマイドを使用せず、DNA にダメージを与える紫外線を使用せず、DNA の検出が有効にします。臭化エチジウムは研究室から排除することは有利かもしれないので、変異原性、よく知られています。紫外線は DNA を損傷、青い光は、DNA を損傷していませんが変換効率を大幅に下げます。検出限界がエチジウム ブロマイド、チアゾール オレンジとブルー光 – 検出可能な一般的な商業 DNA 色素間で類似 (図 1、材料表を参照してください)、1 ~ 2 をされているすべての 3 染料の検出限界とミニ ゲルで ng/レーン1。

制限の酵素の消化バンドを切断などの一般的な用途は、チアゾール オレンジは特に適しています。青色光励起による DNA の検出は、強力でわかりやすいを科学者なら紫外光を用いた検出 DNA を消費税に殺到する必要はありません。プラスミドは、挿入を分離する制限酵素で切られた (

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ディスカッション

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臭化エチジウムは長い知られている毒性にもかかわらず、分子生物学の実験室の標準的なツールをされています。それはまたそれが検出されて、DNA を損傷する UV ライトを要求する苦しみます。チアゾール オレンジ便利ですが高価な商業染料と同様、エチジウム ブロマイドに安価な代替を提供しています。

チアゾール オレンジの利点は、このように 2 倍です。まず、チアゾール オレンジは、エチジウム ブロマイドに代わるものとして単に使用できます。ゲルは、EtBr 染色 (ステップ 1.2) として置換に同じ準備できます。検出限界は似ている (1 ~ 2 ng/車線)1。チアゾール オレンジは EtBr 同様紫外線 (ステップ 3) で検出できるので、染料を切り替えるには追加の機器は不要です。紫外線への暴露急速に、DNA を損傷し、結紮と変容1など下流の実験の失敗を引き起こす可能性があります。紫外線は、肌と注意安全上の注意を必要とする、目にも有害です。

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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この作品はクリストファー ・ ニューポート大学から本校にスタートアップ資金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2log DNA ladderNew England BiolabsN0469S
Agarose (Genetic Analysis Grade)FisherBP1356-100
ブルーライト懐中電灯WAYLLSHINE (Amazon)WAYLLSHINE Scalable Blue LED
ChemiDoc MPBiorad1708280
DMSOSigma-AldrichD8418
ethidium臭化物FisherBP1302-10比較のため、プロトコールには必要ありません
ゲル装置(Owl Easy Cast)Thermo ScientificB1A
Qiagen Qiaquick ゲル抽出キットQiagen28704
Safe Imager Viewing GlassesInvitrogenS37103ブルーライト懐中電灯の使用に必要
SafeImager 2.0 (ブルーライトトランスイルミネーター)InvitrogenG6600ブルーライト懐中電灯は代替として使用できます
SYBR SafeInvitrogenS33102比較のため、プロトコルには必要ありません
TAE (Tris-Acetate-EDTA)Corning46-010-CM
チアゾールオレンジSigma-Aldrich390062
*メガネは Invitrogen G6600 にも含まれています
*

参考文献

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  1. O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
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