微生物バイオフィルムは、相間で複雑なアーキテクチャを形成し、高度にスケール依存する空間パターンに発展します。ここでは、3D光コヘレンス断層撮影(OCT)データセットの自動取得のための実験システム(ハードおよびソフトウェア)を紹介する。このツールセットは、空間と時間におけるバイオフィルム形態形成の非侵襲的かつ多スケールの特性を可能にする。
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この記事について
サマリー
要約
バイオフィルムは、最も成功した微生物のライフスタイルであり、環境とエンジニアリングされた設定の多くで普及しています。バイオフィルムの形態形成を理解することは、コミュニティ集会におけるバイオフィルムの構造的多様化であり、空間的および時間的スケールを越えた顕著な課題を表しています。ここでは、光コヘレンス断層撮影(OCT)に基づく自動バイオフィルムイメージングシステムを紹介する。OCTは、バイオフィルム研究における新しいイメージング技術です。しかし、現在取得および処理できるデータの量は、バイオフィルム形態における大規模なパターンの統計的推論を妨げる。自動化されたOCTイメージ投射システムはバイオフィルムの成長の大きい空間および拡張された時間的スケールをカバーすることを可能にする。市販のOCTシステムとロボット測位プラットフォーム、およびOCTスキャンプローブの位置を制御するソフトウェアソリューションのスイート、および3Dバイオフィルムイメージングデータセットの取得と処理を組み合わせたものです。このセットアップにより、バイオフィルム開発のオンサイトおよび非侵襲的な自動モニタリングが可能になり、OCTイメージングとマクロ撮影およびマイクロセンサープロファイリングを組み合わせてさらに開発することができます。
概要
バイオフィルムは、非常に成功した微生物のライフスタイル適応であり、微生物のこれらの相間関連およびマトリックス囲まれたコミュニティは、自然および産業の設定1、2で微生物の生命を支配する。そこで、バイオフィルムは、細長いストリーマー3、波紋4またはキノコのようなキャップ5などの複雑なアーキテクチャを形成し、バイオフィルムの成長、構造安定性および応力6に対する耐性に重要な結果をもたらす。バイオフィルムの構造的分化に関する多くは、ミニチュアフローチャンバーで栽培された単一種培養に関する研究から学びましたが、ほとんどのバイオフィルムは、多くの場合、生命6のすべてのドメインのメンバーを含む非常に複雑なコミュニティです。これらの複雑なバイオフィルムを微生物の景観7として鑑賞し、複雑なコミュニティにおけるバイオフィルムの構造と機能がどのように相互作用するかを理解することは、バイオフィルム研究の最前線にあります。
環境的手がかりに応じて複雑なバイオフィルムの形態形成を機械的に理解するには、関連するバイオフィルム物理構造の空間的および時間的に解決された観察と組み合わせて慎重に設計された実験が必要です。スケール8.しかしながら、実験システムにおけるバイオフィルムの成長の非破壊観察は、繊細なバイオフィルム構造を損傷することが多いサンプル(例えば、顕微鏡)を移動する必要性などのロジスティック制約によって厳しく制限されている。
ここで提示されるプロトコルは、光学コヘレンス断層撮影(OCT)に基づく完全に自動化されたシステムを導入し、メソスケール(mm範囲)でのバイオフィルム形態形成の非侵襲的なモニタリングを可能にする。OCTは、水処理およびバイオファウリング研究、医学9およびストリーム生態学10の応用を伴うバイオフィルム研究における新しいイメージング技術である。OCTでは、低コハサイレンス光源がサンプルアームとリファレンスアームに分割されます。バイオフィルム(サンプルアーム)とリファレンスアームの光によって反射され散乱する光の干渉を解析します。深度解決構造情報を含む一連の軸強度プロファイル(A-ss)が取得され、Bスキャン(断面)にマージされます。一連の隣接する B スキャンは、最終的な 3D ボリューム スキャン10を構成します。OCTは、約10μmの範囲で横光学分解能を提供し、したがって、バイオフィルム10、12のメソスコピック構造分化を研究するのに適しています。OCTの詳細については、ドレクスラーと藤本13とファーチャーと同僚14を参照してください。1つのOCT xyスキャンの視野は数百平方マイクロメートルに達するが、より大きいスケールパターンは1回のスキャンでOCTによって定量することはできない。河川や河川などの自然生息地におけるバイオフィルムに関しては、現在、生息地の物理的および油圧テンプレートに一致するスケールでバイオフィルム形態形成を評価する能力が制限されています。
これらの空間的限界を超え、OCTスキャンを自動的に取得するために、スペクトルドメインOCTイメージングプローブを3軸測位システムに搭載しました。このインストールにより、重なり合うモザイクパターン(タイルスキャン)で複数のOCTスキャンを取得することができ、100 cm2までの表面積の断層撮影を効果的に達成します。さらに、このシステムの高い位置決め精度は、長期実験中に特定の部位におけるバイオフィルム機能の成長と発展を確実に監視することを可能にする。システムは、モジュラーおよび個々のコンポーネント(すなわち、位置決め装置およびOCT)をスタンドアロンソリューションとして使用するか、または柔軟に組み合わせることができる。図 1は、インストールのハード コンポーネントとソフトウェア コンポーネントの概要を説明します。
システムは市販のGRBL制御CNC測位装置(材料のテーブル)によってテストされた。この特定の位置のプラットホームの作動距離は600×840×140のmm、+/- 0.05 mmの製造業者指定の正確さおよび0.005のmmのプログラム可能な決断はオープンソース(GPLv3ライセンス)、CNCのための高性能の動き制御であるデバイス。したがって、すべての GRBL ベース (バージョン > 1.1) 測位デバイスは、ここに示すガイドラインおよびソフトウェア パッケージと互換性がある必要があります。さらに、ソフトウェアは、いくつかの変更でSTEP-DIR入力タイプを持つ他のステップモータコントローラに適応することができます。
システムの性能を評価するために使用されるOCT装置(材料の表)は930 nm(帯域幅=160 nm)および調節可能な参照腕の長さおよび強度の中心波長の低コハサイレンス光源を特色にする。ここで示す例では、OCTプローブを流れる水に浸すための浸漬アダプターも使用した(材料の表)。自動OCTスキャン集録のためにここで開発されたソフトウェアパッケージは、特定のOCTシステムと一緒に提供されるSDKに大きく依存しますが、異なるスキャンレンズと中央波長を持つ同じメーカーのOCTシステムは、容易に互換性があります。
GRBL デバイスは、シングルボード コンピュータにインストールされている Web サーバーによって制御されます (図1)。これにより、ローカル ネットワークまたはインターネット アクセスを持つ任意のコンピュータからデバイスのリモート 制御が許可されます。OCTデバイスは別のコンピュータによって制御され、自動実験セットアップを除いてOCTシステムの動作を可能にします。最後に、ソフトウェアパッケージには、OCTプローブの位置決めとOCTスキャン集録を同期するライブラリ(すなわち、モザイクパターンまたは定義された位置のセットで3Dイメージングデータセットを自動的に取得する)が含まれます。OCTプローブの位置を3Dで効果的に定義すると、(地域的な)スキャンセット専用の焦点面を効果的に調整できます。具体的には、不均一な表面では、各OCTスキャンに対して異なる焦点面(すなわち、z方向の異なる位置)を指定することができる。
生のOCTスキャンを処理するために一連のソフトウェアパッケージが開発されました(表1)。測位デバイスのナビゲーション、OCTスキャン取得、データセット処理はPythonコード化されたJupyterノートブックで行われ、ソフトウェアの開発と最適化に非常に柔軟性があります。このようなノートブックの2つの作業と注記の例(それぞれ画像の取得と処理のために)は、https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.gitから入手可能です彼らはカスタマイズの出発点として意図されていますメソッドの。Jupyter ノートブックは、Python コードに付いたセルを含む Web ブラウザベースのアプリケーションです。各ステップはノートブックのセルに含まれており、個別に実行できます。スキャンレンズを通る光経路の長さが異なるため(球面収差)15は、生のOCTスキャンが歪んで見える(図2A)。取得したOCTスキャン(ImageProcessing.ipynb、補足ファイル1に含まれる)でこの歪みを自動的に補正するアルゴリズムを開発しました。さらに、バイオフィルム形態は、膜システム16で以前に使用されていたように、2D標高マップとして視覚化することができ、タイリングアレイで撮影したスキャンから得られた標高マップをステッチする方法を示す。
最後に、説明された実験室設置の機能性は、光栄養流れバイオフィルムが流速の勾配にさらされるフルーム実験を用いて示される。
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プロトコル
1. 測位装置のセットアップ
- https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grblの指示に従って、測位装置をマイクロコントローラボードに配線します。
- マイクロコントローラをUSBケーブルでインターネット接続したシングルボードコンピュータに接続し、https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.gitに記載されているGRBLサーバーを取り付けます。これで、位置決めデバイスは、http://IP:5020/でホストされている Web ページからナビゲート可能にする必要があります。または、配置デバイスは、作業例ImageAcquisition.ipynb (補足ファイル2) の最初の部分で示すように、Python スクリプトを使用してナビゲートできます。
2. 10月のセットアップ
- 互換性のある鳩尾ホルダーを使用して、OCTプローブを測位装置に取り付けます。必要に応じて、対物レンズに浸漬アダプターを取り付けます。
- 実験の隣のベンチにコンピュータとOCTベースユニットを配置します(例えば、マイクロ流体デバイス、フローチャンバー、フルーム、濾過システム)。光コード(最大長約1.8m)が自由に動き、意図した場所に到達するのに十分な長さで、実験設定に干渉しないことを確認してください。
- 製造元が説明する利用可能なソフトウェアと共に OCT システムをインストールします。
- https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.gitに記載されているように、自動OCTスキャン集録用のソフトウェアパッケージをインストールします。
3. 画像取得
- OCTシステムと測位装置の電源を入れ。デバイスが自由に動くことができることを確認します。
- テキスト エディタでファイルconfig.jsonを開きます。config.jsonファイルを編集して、屈折率 (20 °C の水の場合は 1.33、空気の場合は 1.00) や取得したデータとメタデータの宛先フォルダーなど、既定の画像取得パラメータ (表2) を調整します。
- config.jsonのビューフィールド (FOV) のサイズと B スキャンあたりの A スキャンの数を定義します。
注: これらの 2 つのパラメータは、最終的なデータセットのボクセルのサイズと出力ファイルのサイズを決定し、プローブの光学解像度と一致する必要があります(x-y ボクセルサイズは光学解像度の半分より小さくしないでください)。A スキャンと B スキャンの数は、使用可能なディスク領域と処理能力に対してトレードオフする空間範囲に影響します。 - config.jsonで出力 OCT スキャンの信号境界を定義します。これらはサンプルの種類によって異なります。したがって、一連の予備スキャンの強度ヒストグラムに基づいてこれらのパラメータを決定することをお勧めします。config.jsonに変更を保存します。
- OCT プローブを対象のサイトに移動します。サンプルに焦点を合わせ、最適な画質を実現するために、リファレンスアームと光源強度を調整します。この手順をいくつもの位置に対して繰り返し、座標をメモします。
注: これにより、これらの参照点の周りに後続の自動 OCT スキャンを取得できます。自動画像集録中は、参照アームの長さと強度を変更できないことに注意してください。 - Juypter ノートブックでImageAcquisition.ipynbファイル (補足ファイル2) を開きます。各セルには、特定のタスクを実行するコードが含まれており、Cell キーを押して個別に実行できます。を実行するか、Ctrlキーを押しながら入力するか、シフトを入力するか、または入力します。
- 必要なライブラリと既定の構成パラメーターにパスを設定します。または、新しい一時パラメーターのセットを定義します。
- 測位装置に接続し、OCTを初期化します。
- 測位装置を校正する(すなわち、「ホーミング」を実行する)。
- 単一スキャンまたはモザイク パターンの関心の位置をカバーするデータセットを取得し、数値と重複を指定します(例: 30%)隣接するタイルの。
注: メモリはスキャンの前に割り当てられ、コンピュータ リソースの使用が最適化されます。データは 8 ビット *.raw形式で保存され、ストレージ領域を節約し、config.jsonで定義された宛先フォルダーに、タイム スタンプと位置を命名規則として使用します (つまり、%Y%%m%d_%H%M%S%S_)。OCT 設定と座標を含むメタデータは、同じ命名規則を持つ *.srmファイル内の同じフォルダーに保存されます。FOV や解像度などの設定によっては、ファイル サイズが OCT スキャンあたり最大 1.5 GB に達する場合があります。
- データ取得の中絶を避けるには、十分な空きディスク領域があることを確認するか、OCT データセットを外付けハード ドライブに継続的に移動します。
4. 画像補正・表示
- OCT画像処理(歪みの補正、背景減算、標高マップの計算、標高マップステッチ)の例については、JupyterノートブックImageProcessing.ipynb(補足ファイル1)を開きます。
- 必要に応じて、偽の信号を除外し、データセットの方向を変えるためにOCTスキャンをトリミングします(バイオフィルムは地下層の上に表示されるはずです)。
- 球面収差を正しくします。これは、平坦であることが知られている高反射基準面(例えば、フルームの底部、地下層)を利用する補正アルゴリズムによって達成される。まず、このアルゴリズムは、OCTスキャンのxy平面を横切って定期的に間隔をあけた20×20本の垂直線のグリッドを定義します。次に、各点の周囲の円形領域を選択し、垂直プロファイルに沿って信号強度を平均します(図2B)。垂直プロファイルは、変更されたガウスフィルタで処理されます。
ここでxは入力信号であり、σ は標準偏差を、C は次のように決定します。
参照サーフェスは、これらの各プロファイルでローカル最大値としてローカライズされます。誤認識されたポイントは、近傍の位置に基づいて 3 次元でフィルタリングされます (図 2C)。最後に、スキャンレンズによってもたされる歪みを反映した2次多項式の表面を、これらの点にまたがって取り付けます(図2C)。次に、フィットサーフェスを使用して各ピクセルを Z 方向にシフトし、フラット化されたイメージを取得します。このアルゴリズムのパラメータは、OCTスキャンの特性に合わせて調整する必要があります。 - バックグラウンドノイズを修正します。画像の空の領域(通常はバイオフィルムの上)を識別し、補正アルゴリズムを使用して画像の強度値から平均バックグラウンド強度を減算し、最終的な補正OCT画像を生成します(図2D)。
- 3D OCT データセットから標高マップを計算します。このステップでは、特定の実験に対する対象の参照面(例えば、地下層)と適切なしきい値強度を定義する。次に、標高マップ計算アルゴリズムを使用して、バイナリ マスクの各座標 (x,y) のバイオフィルムの厚さを計算し、新しい 2D マトリックスに割り当てます (図 3A)。厚さの値は、x 方向と y 方向の元のイメージのサイズの 2D マトリックスに割り当てられます。イメージは、サーフェスの標高がグレースケール値 (図 3B)として報告されるレンダリングされます。
- 複数の OCT スキャンをモザイク パターンで行う場合は、行と列の数を定義し、それぞれの標高マップをステッチします。図 5は、ステッチされた標高マップの例を示し、説明した設定で実現可能な幅広い空間縮尺と解像度をカバーしています。
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結果
光栄養流れバイオフィルムの時空間的形態形成を研究するために設計されたフルーム実験を用いて、自動OCTイメージングシステムの機能を実証する。蛍石の徐々に狭いジオメトリは、蛍石の中心に沿った流速の勾配を誘発しました(参照 17を参照)。 バイオフィルムの時間的発達と構造分化は、バイオフィルム形態形成に対する流体力学的条件の影響をよりよく理解することを目的として18日間にわたってモニタリングされた。図4は、18日間の成長に続くバイオフィルムマイクロコロニーの成長を示す。バイオフィルムの表面形態は、上述したツールセットを用いて定量した(図4A)。生体積を計算した(例ImageProcessing.ipynb,補足ファイル1参照)、流速勾配に沿った各位置について3.6mmのエッジ長(図4B)を持つ正方形の移動ウィンドウについて(図4C...
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ディスカッション
OCTイメージングは、数平方ミリメートルのFOVを持つマイクロメータ範囲の構造を解決するのに適しています。したがって、バイオフィルム研究10、18のための強力なツールです。しかし、OCTは現在、最大スキャン面積100~256mm2に制限されていますが、バイオフィルム構造パターンは、特に大規模な環境勾配によって形態学的分化が駆動される場合、この空間スケール19を超えることが多い。20.このプロトコルで説明する自動OCTイメージングシステムは、OCTによって特徴付けられた表面積を数平方センチメートルに拡張し、関連する空間スケールの範囲にわたってバイオフィルム形態学的分化を効果的に監視することを可能にする(数ミリメートルから数センチメートル)。高い位置決め精度(16 μm以内。図 5)長期間にわたってバイオフィルムの構造発達を正確に監視することができ(...
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開示事項
セバスチャン・シェーファーはソーラブス社に勤務しています。
謝辞
我々は、マウリシオ・アギーレ・モラレスがこのシステムの開発に貢献してくれたことに感謝する。 財政支援はスイス国立科学財団からT.J.B.に寄付されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| OCTプローブ | Thorlabs | GAN210C1 | OCTイメージングデバイス |
| OCTスキャンレンズ | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| イマージョンアダプター | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 | CK STEPCRAFT | NA | 位置決めデバイス |
| マイコン | Arduino Uno R3 | NA | |
| シングルボードコンピュータ | Raspberry PI | NA | |
| カメラ | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| カメラレンズ | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
参考文献
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