肝炎症と線維症の設定に起因する肝細胞癌の腫瘍性肝細胞誘発性オルコトピックマウスモデル

サマリー

ここでは、肝細胞癌(HCC)の典型的な免疫特徴を要約した肝癌の臨床的に関連するマウスモデルの開発について述べた。

要約

肝細胞癌(HCC)の典型的な免疫特性に対処する臨床的に関連する動物モデルの欠如は、基礎となるメカニズムの解明と革新的な免疫療法戦略の開発を著しく妨げている。ヒトHCCを要約する理想的な動物モデルを開発するために、免疫能力のある雄C57BL/6Jマウスは、まず肝臓線維症を誘導するために四塩化炭素(CCl4)注射を受け、次いで若い雄から組織学的に正常な発血性肝細胞を受け取る。SV40 T抗原(TAg)-トランスジェニックマウス(MTD2)を脾臓内(ISPL)接種により用いる。思春期のレシピエント雄マウスで生成されたアンドロゲンは、肝臓特異的プロモーターの制御下でTAg発現を開始する。その結果、転移した肝細胞は癌細胞となり、肝線維症/肝硬変の設定で腫瘍塊を形成する。この新しいモデルは、肝線維症/肝硬変のコンテキストでヒトHCCの開始と進行を模倣し、免疫機能障害を含むヒトHCCの最も典型的な特徴を反映する。

概要

肝細胞癌(HCC)は、米国(^{米国)1、2、3}で最も急速に増加しているタイプの癌である。毎年、約85万人の新しい症例がこの致死性疾患6、7、8、9、10で死亡する4、5、700,000人^と診断されている。世界で2番目に高いがん関連死の原因となっています。HCCの管理は、外科的切除、移植、切除、化学的化、またはソラフェニ^ブ11のような全身療法を含む。外科的切除または移植を伴う早期診断および管理は、全体的な生存利益が最も高^い4を有する。残念ながら、患者の大半は、後の段階に存在し、アブレーション、化学oembolizationまたはソラフェニ^ブ12で管理を必要とします。ソラフェニブは、受容体チロシンキナーゼ阻害剤(RTKI)であり、切除不能なHCCの治療に利用可能な唯一の全身性薬物療法として2008年に食品医薬品局によって承認されました。薬物は、全体的な生存のわずかな増加を提供するが、7.9^{から10.7ヶ月13}に、それはHCCを管理するために利用することができる新しい治療戦略を提供した。

確立された癌を排除するために免疫系を操作することは、がん^研究14の急速に成長している分野です。免疫チェックポイント研究は、がん治療における免疫療法薬開発をかなり進めました^15,16.FDAは、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)に対する抗体(Abs)、プログラムされた細胞死タンパク質1(PD-1)、および黒色腫、肺癌、頭頸部癌、および膀胱^癌17の治療のためのリガンドPD-L1の使用を承認した。^{18歳,19歳,20.}高度なHCCの治療のためのPD-1、PD-L1、またはCTLA-4に対する1つまたは複数の抗体を用いた単剤療法または併用療法の臨床試験は、進行中の21、22、23、および一部である試験は良好な結果を示している。2017年、FDAはソラフェニブに対する耐性を有するHCC患者を治療するための抗PD-1抗体の承認を加速したが、この治療の全体的な応答率はわずか14.3%である。他の戦略は、この時点で臨床実践に翻訳されていません^24,25.免疫チェックポイント療法を改善するために腫瘍誘発深い免疫寛容を克服²⁶;免疫チェックポイント療法の有効性を予測する;免疫関連の有害事象を防ぐ;投与経路、投与量、および頻度の最適化;そして、治療の効果的な組み合わせを見つける^27,28,29すべてが非常に困難なタスクのまま.

現在、マウスモデルでHCCを誘導するために使用されるいくつかの従来のアプローチがあり、研究者の特定の研究^質問30に応じて利用されている。ケノ毒性化合物を有する化学的に誘発されたHCCマウスモデルは、傷害誘発性悪性腫瘍を模倣する。HCC細胞株の異所性またはオルコトピック移植を介した異種移植片モデルは、薬物スクリーニングに適している。遺伝子組み換えマウスの数は、HCCの病態生理学を調査するために設計されています。ウイルス遺伝子、オンコ遺伝子および/または成長因子を発現するトランスジェニックマウスは、肝発癌に関与する経路の同定を可能にする。固有の制限により、これらのモデルはヒトHCCに見られる典型的な免疫特性を要約せず、基礎となるメカニズムの解明と革新的な免疫療法戦略の開発を著しく妨^{げている14 、15}.我々は最近、臨床的に関連するマウスモデルを作成した。この新しいモデルは、ヒトのHCCの開始と進行を模倣するだけでなく、免疫機能障害を含むヒト疾患の最も典型的な特徴を反映している。その生物学的および免疫学的特性を特徴付けた。この新しいモデルを利用して、我々はHCC ^{31、32、33、34、35、36}を治療するための様々な免疫療法戦略を探求^{してきた。37.}このユニークなプラットフォームにより、腫瘍誘発免疫トレランスのメカニズムを研究し、最終的な臨床翻訳に向けたHCCの概念実証治療戦略を開発することができます。

プロトコル

注:動物の被験者を含むすべての手順は、ミズーリ大学のIACUCによって承認されています。すべてのマウスは、「実験動物のケアと使用のためのガイド」に概説された基準に従って人道的ケアを受けました。細胞の単離および接種のための次の手順はフードで行われるべきである。すべてのパフォーマーは、マウスおよび組織の取り扱いのための標準的な個人用保護具を着用する必要があります。

1. 脂肪塩化炭素のIP注入による肝線維症と肝硬変の_誘導(CCl4)

注: 図 1 を参照してください。(CCl₄は非常に危険な試薬であり、それは慎重に、耐薬品性手袋を着用して取り扱われるべきです)

1. 生後6~8週の雄C57BL/6Jマウスを入手する(材料表参照)。
2. 遠心管にトウモロコシ油で10%CCl4(v/v)溶液を調調します。注入するマウスの数に基づいて総体積を決定する(ステップ1.6を参照)。
3. 適切なマウス処理技術を使用して、注射用に 1 つのマウスを選択します。
4. 手動でその後部(腹部)側を上にしてマウスを拘束します。
5. 70%のアルコールで洗うことによってマウスの腹壁に注射部位をきれいにします。
6. 25ゲージの使い捨て針を用いて食肉内(IP)注射により、160 μLの10%CCl4溶液を用いてオスのC57BL/6Jマウスを注入する。
7. 針が腹壁(約4〜5mm)を通って、ベベル側を上にして15〜20度でわずかに角度を付けて突き刺さっていることを確認します。
8. マウスを週2回注射し、合計4週間の合計4週間の注射を行い、合計8回の注射を受ける。
   注:最後の注射の2週間後、治療されたマウスはMTD2マウスからの発死性肝細胞のISPL接種の準備ができている。

2. ラインMTD2マウスからのタグトランス原性肝細胞の分離

注: ソリューションレシピについては、表 1を参照してください。

CaまたはMgなしの10xアールのバランス塩溶液(CaまたはMgなしのEBSS)	4 g KCl 68 g ナクル 1.4 グラム NaH2PO4 ·H2o 10 g デキストロース 水を1リットルに、pHを4.32に加える パススルーフィルタ
ソリューション 1	Ca または Mg なしの 20 mL 10x EBSS 44 g ナフコ3 1.33 mL 1.5M ヘプ 10 mL EGTA の 10 mL 200 mLに水を加える
ソリューション 2	100 mL 10x EBSS 2.2 g ナフコ3 6.67 mL 1.5 M ヘプ 1リットルに水を追加
0.75% コラゲナーゼ溶液	15 mg コラゲナーゼ タイプ 1 20 mLの溶液 2
完全なメディア	2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x ペニシリン連鎖マイシン

表 1: ソリューションのレシピ。

1. 発細胞性肝細胞の供給源として役立つラインMTD2^マウス38を得る。
2. 2.5%イソルランを用いて5週齢のMTD2マウスを麻酔する。
   注:適切な麻酔はつま先のピンチ法によってチェックされます。簡単に言えば、2本の指を使用して、マウスのつま先/足に良いスクイーズを与えます。撤退反応がない場合、動物は手術を開始するのに十分な深さと判断される。
3. 十分に鎮静したら、マウスをサフィンの位置に置き、腹をテープで固定して腹部表面を十分に露出させます。
4. 肝臓の十分な露出を提供するのに十分な大きさのリニアアルバの長さに沿ってはさみを使用して中間腹腔切開を行います。
5. 肝臓とポータルトライアドのより良い露出を提供するために左に腸を置き換えます.
6. 肝臓の上で解剖して、劣った静脈カバ(IVC)を露出させる。
7. 動脈クランプを使用して肝臓の上にIVCをライゲートします。
8. 肝臓の劣った境界に戻り、蝶の針(材料を参照)を使用して、ポータル静脈へのIVアクセスを得る。手でカテーテルを修正します。
9. 溶液15mL、0.75%コラゲナーゼ溶液2の15mL、カテーテルを介して溶液2の15 mLを用いて8.9 mL/minの注射注射器を使用してマウス肝臓を連続的に浸透させる。
10. 10-15 mLのPBSを有する50 mL円錐管でMTD2マウスから腫瘍塊を切断し、取ることによって、注入された肝臓を収穫する。
11. PBSを削除し、PBSで追加の時間を洗浄します。この手順では遠心分離しないでください。
12. はさみを使って肝臓を小さく切り、PBS 2xで再度洗って残りの血液を取り除きます。
13. 円錐形のチューブに完全なRPMI媒体の5 mLを追加し、連続的に小片(<3ミリメートル)にはさみで肝臓をミンチ- 組織は滑らかに5 mLピペットを通過する必要があります。
14. 30 mL の最終容積に完全な RPMI を追加し、5 mL ピペットを使用して肝臓を中断します。.
15. 混合溶液を70 μmストレーナーで50 mL円錐管に濾過します。
16. 完全なRPMIでストレーナーを数回洗浄し、RPMI培地を追加して最終容積を50mLに調整します。
17. 遠心分離機でサスペンションを最大500rpmまで素早く回転させます。速度が50 x gに加速されたら、遠心分離機を停止する必要があります。
18. PBSの20 mLで上清をデカントし、ペレットを中断します。
19. トリパンブルーの除外と血球計を使用して細胞をカウントし、次の細胞接種のために細胞濃度を2.5 x 10⁶/mLに調整します。
    注:5グラムの腫瘍組織からの期待収量は、生存率>95%の8,000万肝細胞です。

3. ISPL注射による野生型C57BL/6Jマウスの肝臓へのMTD2マウスからの肝細胞接種

1. 無菌技術は、すべての手順で使用する必要があります
2. CCl_4-処置された雄C57BL/6Jマウスを2.5%イソファランで麻酔し、マウスは目が乾燥するのを防ぐために眼の潤滑油で治療されるべきである。
3. 注射用肝細胞の200 μLで注射器を調剤します。
4. 十分に鎮静したら、マウスを左上に位置を付します。
5. マウスの左脇腹全体を剃り、その後、70%のアルコールとベタジンの間で交互に3回、領域をスクラブします。
6. 外科的切開の前に5 mg/kgのカルプロフェン皮下皮を投与する。
7. 背骨の筋肉のすぐ下から背部極端な始まりから13^番目の肋骨に平行に左脇腹に1cmの切開を行います。
8. 脾臓を識別し、鈍い尖った鉗子を使用してそれを外装します。
9. 脾臓を2つの中型チタンクリップでクリップします。脾動脈と静脈の間に両方のクリップを配置し、接種後に後でカットするクリップの間にスペースを残します。
   注:目標は、播種のリスクを低減するために脾臓の下の極を分離することです。
10. 27G針を用いて脾臓の下端の極に200μL(050万円)の肝細胞を注入する。
11. ペディクルの下枝(下脾臓のポール容器)を中型のクリップ1本でクリップします。
12. 最初に配置された 2 つのクリップの間に脾臓を切ります。
13. 腫瘍細胞を直接注入した脾臓の劣った棒を取り除く。
14. 3-0 ポリグラクチン 910 中断縫合を使用して、内側の筋肉層を閉じる。
15. 殺菌されたスチール創傷クリップを使用して、外側の皮膚層を閉じます。
    注:スチールクリップは、動物が縫合糸を噛み切るのを避けるために縫合糸よりも好ましく、隙間のある傷を残します。
16. 縫合後に皮下にカルプロフェンの5 mg/kgを投与する。
17. すべての回復動物を温度管理された加熱パッドに置き、麻酔から完全に回復するまで注意深く監視します。
18. 手術後にマウスに水への無料アクセスを与えます。手術中にマウスが脱水状態になった場合は、皮下液(<1 mL)を投与する。
19. 術後7~10日でスキンクリップを取り外します。

結果

TAg-トランスジェニックマウス(図2)から単離した発血性肝細胞を、脾臓内注射により野生型マウスの肝臓に播種した(図3)。移植された肝細胞は正常かつ確実に肝細胞を成長させ、肝炎症および線維症の設定において腫瘍特異的抗原SV40 TAg(図5)を有する正頭不最小HCC腫瘍(図4)を成長させた(図1)。

図1:HCCのマウスモデルを準備するための回路図。HCCの革新的なマウスモデルを確立するための実験設計。C57BL/6Jマウスは、肝線維症を誘発するために週2回CCl4のIP注射で4週間治療される。最後のIP注射の2_{週間後、...}

ディスカッション

このプロトコルにより、ヒトHCCの開始と進行を模倣するHCCの信頼性と再現性の高いマウスモデルを確立しました。臨床的には、多くの危険因子が肝損傷、肝線維症、肝硬変およびHCCの最終段階を連続的に誘導する。我々のプロトコルでは、CCl₄のIP注射は、最初に野生型マウスで肝線維症を生成するために使用され、その後の発生性肝細胞が肝線維症の設定で腫瘍を形成することを可能にする。_CCl4治療の2週間後に肝細胞接種を受けたマウスでは、他の時点で注射を受けたマウスと比較して、腫瘍形成が最も成功したことがわかった。さらに、CCl₄注射後4ヶ月以内に肝線維症を検出できることがわかった。このアプローチは、CCl₄に曝露せずにマウスと比較してHCC腫瘍を発症するマウスの90%以上をもたらす。我々のモデルでは、ラインMTD2マウスからC57BL/6Jマウスに移された肝細胞は、TAgを組織抗原として発現する肝細胞として組み込まれる肝臓へのトラフィックである。MTD2からの肝細胞の単離は、このプロトコルの間に重要なステップです。MTD2マウス肝臓は、肝臓内の循環赤血球を完全に除...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔器	VETEQUIP	IMPAC6	手術用麻酔器
バタフライニードル	BD	8122963	肝臓灌流に使用されるニードル
C57BL/6	マウス ジャクソンラボ	000664	プロトトールに使用したマウス
カルプロフェン	クレセントケミカル	20402	痛みの解放のためのカルプロフェン
セルストレーナー	CORNING	REF 431751	セルストレーナー、70µm、肝細胞単離用
遠心分離	ベックマン・コールター	、アレグラX-30R	細胞単離用遠心分離
クリップ	Teleflex Medical	REF 523700	脾臓
顕微鏡	Zeiss	Primovert	細胞観察用顕微鏡
Mtd2マウス	N/A		ウィリアム博士からの贈り物 2002年にロズウェルパークがん研究所で開催され、私たちの研究室で維持
ニードル	BD	REF 305109	BD精密グライド針、27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
縫合	ETHICON	J303H	コーティング VICRYL縫合糸
SV40 T Ag抗体	Abcam	ab16879	BD用抗SV40 T抗原抗体
		REF 309626	細胞注射用1mL TBシリンジ
トリパンブルー	SIGMA	T 8154	細胞生存率試験用トリパンブルー溶液
創傷クリップ	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	ステンレス製創傷クリップ クローズ

機機用チタンクリップ されています 糸 IHCシリンジ