CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA ライブラリをについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
CCCTC 結合因子 (CTCF)-仲介された安定した位相ドメインを関連付ける (TADs) 近隣 TADs のある DNA 要素の制約の相互作用で重要な役割を果たします。CTCF は、胚や体のパターン形成、造血、白血病を制御するHOX遺伝子発現の時空の調節に重要な役割を果たしています。しかし、それはHOX遺伝子の関連付けられている CTCF 境界クロマチン構造およびHOXの遺伝子発現を調節する方法かどうか、主として未知に残る。現在のプロトコルで少し形成とHOX遺伝子のクロマチンの CTCF 関連付けられた境界を中断することの効果を検討するHOXA/B/C/D座すべて CTCF 結合部位をターゲット特定 sgRNA プールされたライブラリが生成されました。式です。CRISPR Cas9 を介して遺伝学的スクリーニング、 HOXA7/HOXA9遺伝子 (CBS7/9) の間にある CTCF 結合部位は、 HOX遺伝子の異所性の維持のために重要であることと同様、発癌性クロマチン ドメインの重要な調節因子として同定されています。MLL 再配置の急性骨髄性白血病 (AML) の発現パターン。したがって、スクリーニングのアプローチこの sgRNA ライブラリの特定遺伝子座における媒介 CTCF ゲノム構成に新しい洞察力を提供し、また両方のコーディング、注釈付きの遺伝的規制要素の機能特性の基礎を提供し、ポスト人間ゲノム プロジェクト時代の正常な生物学的プロセスの間に、非翻訳。
概要
最近のゲノムの相互作用の研究では、細胞の種類と種の間で保存されているトポロジとして関連付けるドメイン (TADs) を人間の核ゲノム フォームに安定を明らかにしました。ゲノムの組織を別ドメインは容易、規制要素 (例えば、エンハンサーやプロモーター) 間の相互作用を制限します。CCCTC 結合因子 (CTCF) 少しの境界に、近隣 TADs1である DNA 要素の制約の相互作用に重要な役割を果たしています。ただし、ゲノム広い CTCF のデータ バインディングは、CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取りが多くの場合として機能する他の示唆ではなく 1 つのセル型で特定のサイトでのクロマチン障壁を明らかにしたその CTCF 関数クロマチンの境界2の形成の他の活動。かどうか境界要素 (CTCF 結合部位) に直結する、CTCF の生物学的機能と、これらのリンクが発生する方法は不明のまま。したがって、我々 はゲノムの特定の CTCF 結合サイトは直接 TADs の形成を調節して制御プロモーター/エンハンサー相互作用ドメイン内または隣接ドメイン間と仮定します。人間とマウスのゲノム プロジェクト以降のエピジェネティクス解析の完了は、ゲノムの分子および遺伝の新しい署名を発見されています。しかし、遺伝子細胞の機能とその分子機構、特定の署名/変更の役割はまだ完全に理解するのにあります。
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プロトコル
1. CTCF sgRNALibrary オンライン ツールを使用して設計
- 遺伝的摂動プラットフォーム (GPP) デザイナー ツール (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) を使用して人間のHOX遺伝子の CTCF 結合部位をターゲット sgRNA をデザインします。
- 303 ランダム ターゲット遺伝子、60 のポジティブ コントロール、500 の非人間ターゲット コントロール 207 CTCF 要素または lncRNA (図 1表 1) 遺伝子をターゲット対象と sgRNAs から成る 1,070 の sgRNAs の合計を合成します。各ターゲット DNA 要素は 5-10 の異なる sgRNAs の対象となります。
2. sgRNA ライブラリのクローニング
-
CRISPR レンチ ウイルス バックボーン ベクトル (lentiCRISPRv2) に合成オリゴヌクレオチドを複製します。
- LentiCRISPRv2 ベクター 2 h の 37 ° C で BsmBI 制限の酵素と消化します。
- 大きいバンドの....
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結果
CRISPR Cas9 技術機能ゲノム研究のための強力な研究ツールです。編集技術従来の遺伝子の交換は急速に、ゲノム全体と個々 の遺伝子に焦点を当てたアプリケーションの高いユーティリティです。ここでは、最初個別に複製された軌跡固有 CRISPR 配列 Cas9 sgRNA ライブラリに含まれる sgRNAs 303 ランダム ターゲット遺伝子、60 のポジティブ コントロール、500 の非人間ターゲット コントロールと 207 CTCF 要素または lncRNA をターゲットから成る 1,070 sgRNAs(図 1表 1)、4 つのHOX遺伝子の遺伝子をターゲットに。このライブラリには、すべての CTCF コア結合モチーフ、 HOX遺伝子 lncRNAs、 HOX遺伝子座のポジティブ コントロールとして規制要素、およびいくつかのHOX遺伝子が知られているが対象します。SgRNAs ランダムな非HOX<.......
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ディスカッション
蛋白質コーディングの遺伝子は、遺伝子と sgRNA 濃縮24,25,26 を通じて特定の細胞機能を調節するネットワークを識別するための機能的スクリーニング システム sgRNA ライブラリを適用されている関連、27,28。いくつかの非コーディングの地域関連 sgRNA ライブラリは、またの遠位と近位BCL11A、 Tdgf1a薬剤耐性などの要素を調整する遺伝子特定機能画面で示されていた調節遺伝子28、 29,30。これらの sgRNA ライブラリのすべての詳細なバイオインフォマティクスによって生.......
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開示事項
我々 は本レポートに関する利害の対立があります。
謝辞
著者はまた原稿を編集のニコラス セザーリを感謝します。仕事は、国立衛生研究所 (s. h.、R01DK110108、R01CA204044) からの助成金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| リポフェクタミン 3000 試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | L3000-008 | |
| プロテイナーゼ K | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25530049 | |
| ピューロマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィ | A1113802 | |
| Stbl3 細胞 | ライフテクノロジーズ& | nbsp; | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | プロメガ | A137A | |
| T4リガーゼ | ニューイングランド・バイオラボ | M0202S | |
| QIAquickのゲルのエキスのキット | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCRの浄化のキット | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™SYBR® グリーン ワンステップキット | バイオ・ラッド ラボラトリーズ | 1725095 | |
| QIAGEN プラスミド マキシキット | QIAGEN | 12163 | |
| ダルベッコ's モディファイド イーグル ミディアム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| 11965084 RPMI 1640 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11875093 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10-082-147 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン | ライフテクノロジーズ | ||
| Lenti-X濃縮器 | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | ジェネシー・サイエンティフィック | 25-507 | |
| TAEバッファ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | FERB49 | |
| サーベイヤー®突然変異検出キット | 統合DNAテクノロジー | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| 遠心分離機 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| デジタルドライバス/ブロックヒーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 88870002 | |
| TSXシリーズ 超低温冷凍庫 | サーモフィッシャーサイエンティフィック TSX40086V | ||
| Forma™ステリカルト&貿易;CO<サブ>2 インキュベーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 3308 | |
| Herasafe™KS、クラスII生物学的安全キャビネット | モフィッシャーサイエンティフィック | 51022484 | |
| ソーバル™伝説&貿易;XT/XFの遠心分離機シリーズ | サーモフィッシャー科学 | の75004506 | |
| フィッシャーブランド™ 等温&貿易;ウォーターバス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | FSGPD02 | |
| サーモサイエンティフィック™ ロケーター&トレード;Plus ラック&ボックスシステム | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™サーマルサイクラー | 応用バイオテクノロジーA37834 | ||
| Thermo Scientific™ フクロウ&貿易;EC300XL2コンパクト電源 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ フクロウ&貿易;イージーキャスト&トレード;B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 09-528-178 | |
| VWR®チューブローテーターとロティサ | リーVWRインターナショナル | 10136-084 | |
| VWR®インキュベーション ミニシェーカー | VWR International | 12620-942 | |
| 分析天びん MS104TS/00 | メトラー・トレド | 30133522 | |
| DS-11 FX および DS-11 FX+ 分光光度計 | DeNovix Inc. | DS-11 FX(エフエックス |
参考文献
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global an....
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