ここでは、マウスの化学遺伝学を用いて神経活動を慢性的に制御する2つの非侵襲的方法について説明する。点眼剤は、クロザピン-N-酸化物(CNO)を毎日提供するために使用されました。また、飲料水中のCNOの長期投与のための2つの方法についても述べた。慢性神経制御のためのこれらの戦略は、動物のストレスを軽減する最小限の介入を必要とします。
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この記事について
サマリー
要約
化学遺伝学的戦略は、神経活動の遠隔制御のための信頼性の高いツールとして登場しています。これらの中で、デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、現代の神経科学で使用される最も人気のある化学遺伝学的アプローチとなっています。ほとんどの研究は、単一の食後性注射を使用してリガンドクロザピン-N-オキシド(CNO)を提供します, これは、標的ニューロン集団の急性活性化/阻害に適しています.しかし、DREADD制御ニューロンの慢性変調のための戦略のほんの一例は、その大半は外科的介入を必要とする送達システムの使用に依存している。ここでは、ライガンドCNOを送り出してマウスの神経集団を慢性的に操作するための2つの非侵襲的な戦略について展開する。CNOは、反復的な(毎日)点眼薬を使用するか、または動物の飲料水を通して慢性的に投与した。これらの非侵襲的なパラダイムは、CNO治療全体を通じて持続するデザイナー受容体の堅牢な活性化をもたらす。ここで説明する方法は、神経活動の慢性DREADD媒介制御の代替手段を提供し、侵襲性の低いCNO送達方法に焦点を当てて、自由に動く動物の行動を評価するように設計された実験に役立つ可能性がある。
概要
神経科学の分野における技術的進歩により、科学者は特定の神経集団の活動を正確に特定し、制御することができました 1.これは、ニューロン回路の基礎と動物の行動への影響をよりよく理解するのに貢献しているだけでなく、確立されたドグマ2、3を改訂する。これらの新しいツールの中で、光遺伝学的および化学遺伝学的戦略は、発見の質だけでなく、実験が考案され、設計される方法にも大きな影響を与えました 4.本原稿では、工学的受容体リガンド戦略を用いてニューロンの活性化を制御するための化学遺伝学的戦略に焦点を当てる。デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、Roth 20165によってレビューされたニューロン活動の遠隔制御のための最も人気のある化学遺伝学的ツールの1つを表します。DREADDsは、不活性リガンド、クロザピン-N-オキシド(CNO)6によって特異的に活性化される修飾されたムスカリン性アセチルコリン受容体を利用する。
ほとんどの研究は、急性の方法でエンジニアリングされた受容体の活性化の投与量とタイミングを効果的に制御する経皮内注射(i.p.)注射に....
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プロトコル
全ての動物は、国立精神衛生研究所(NIMH)の動物ケア・使用委員会のガイドラインに従って取り扱われました。痛みと使用される動物の数を最小限に抑えるためにすべての努力がなされました。
1. 海馬におけるアデノ関連ウイルス注射
注:混合背景の野生型雄マウス(B6/129 F1ハイブリッド、生後3ヶ月)は、海馬にM3ムスカリン受容体(hM3Dq)をコードするAAVを定体的に注入した。全体の実験の間、マウスは、通常の12時間の光の下で、単一の収容された:12時間暗い(T24)サイクル、食物および水のアドリビタムへのアクセスと。
- 立体手術を行う前に、ステレオタキシックフレームとすべての必要な器具をきれいにし、殺菌します。
注:外科ドレープは、無菌フィールドを維持し、マウスの熱損失を減らすために使用することができます。 - イソファランを用いてマウスを深く麻酔する。これを行うには、まず酸素流量計を約1.5L/分に調整し、次にイソファリン気化器を誘導で約3~5%、メンテナンス用に約1~3%に調整します。
- 動物が完全に意識不明であることを確認するには、マウスの足をつまみます。ピンチに対するフリンチング応答が存在しない場合、動物は適切に麻酔される。
- マウスの体温の安定性を維持するために....
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結果
点眼薬を用いた反復的なCNO送達は、ほとんどの感染ニューロンにおけるc-Fos発現の強い誘導を引き起こし(図1C)、CNO送達の有効性が反復的暴露中に持続することを示した。さらに、CNO処理後2時間に採取した試料においてc-Fosの有意な誘導が観察され、CNO曝露後6時間で得られた試料(図1D-E)と比較して、CNOによって誘導される変化が時間依存であることを実証した。
その後、飲料水を通じて送達される慢性CNO治療の有効性を測定した。水+CNOの1日の消費量は、通常の水の総量と比較して有意に異ならないことが分かった(図2A)。同様に、夜間に消費される水量+1%ショ糖(6時間時間枠)は、CNO(図2B)の添加による影響を受けなかった。また、全動物に対する実験を通じて、水+CNO(図2C)及び水+ショ糖+CNO(<.......
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ディスカッション
DREADDsは、ニューロン活動を遠隔操作する一般的で効果的なアプローチとして登場しました 17.CNO 配信の代替戦略の設計は、特定の実験設定で使用できるオプションのスペクトルを大幅に増加します。さらに、CNOの配信のための非侵襲的な戦略は、動物の健康に直接影響を与えることができる有害な副作用を減らすことによって、結果の潜在的な誤解を最小限に抑えます。ここでは、DREADDs (hM3Dq) の堅牢な活性化を与え、幅広い可能性を提供する CNO 配信の 2 つの非侵襲的な戦略について説明しました。さらに、ここで説明するプロトコルは、遺伝子操作されたムスカリンまたはオピオイド受容体を含む、神経操作のための異なるDREADD変異体にも有用である可能性があると考えています。
反復的な点眼薬を用いたCNO送達は、CNO送達の投与量とタイミングを正確に制御する力を維持しながら、繰り返しの経皮内CNO注射に対する痛みのない代替手段を表す。したがって、繰り返し DREADD アクティベーションが必要な場合は、このプロトコルを使用することをお勧めし.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
この研究は、国立精神衛生研究所(ZIA MH002964-02)の内部研究プログラムによって支援されました。NIMH IRPげっ歯類行動コア(ZIC MH002952)のサポートに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BSA | シグマライフサイエンス | #A2153-100G | 凍結乾燥粉末≥96% (アガロースゲル電気泳動) |
| C57BL/6J マウス | ジャクソン研究所 | #000664 | 雄マウス、3ヶ月齢 |
| 毛細血管 | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | 外径:1.14インチ |
| クロザピン-N-オキシド | Sigma | #C0832 | 5mg |
| フォラン | バクスター | #NDC 10019-360-60 | イソフルラン、USP |
| マイクロインジェクター III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting Media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&マイクロ;L) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC ベクターコア | 力価: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC ベクターコア | 力価: ~3x10e12 vg/mL | |
| 二次抗体 | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 ロバ抗ウサギ IgG(H+L), 2mg/mL |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
参考文献
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of dep....
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再版と許可
