蛍光信号を効率的に判別する励起走査察ハイパースペクトルイメージング顕微鏡

サマリー

スペクトルイメージングは、単一のサンプルで複数の蛍光信号を同定および分離するための信頼性の高いソリューションとなり、目的の信号と背景または自己蛍光を容易に区別できます。励起スキャンハイパースペクトルイメージングは、信号対雑音比を同時に増加させながら、必要な画像集録時間を短縮することで、この技術を向上させます。

要約

いくつかの技術は、蛍光信号の検出に依存して現象を同定または研究したり、機能を解明したりします。これらの蛍光シグナルの分離は、蛍光源が互いに分離できるハイパースペクトルイメージングの出現まで、また背景信号と自己蛍光(スペクトルの知識を与えられた)から分離することができるまで、煩わしいことが証明された。署名)。しかし、従来の発光スキャンハイパースペクトルイメージングは、励起光と発光光の両方のフィルタリングが必要なため、取得時間が遅く、信号対雑音比が低くなります。励起スキャンハイパースペクトルイメージングは、取得したデータの信号対雑音比を同時に増加させながら、必要な集録時間を短縮することが以前に示されています。市販の装置を使用して、このプロトコルは、単一のサンプル内の複数の蛍光源からの信号を分離するための励起走査熱ハイパースペクトルイメージング顕微鏡システムを組み立て、校正し、使用する方法を説明します。細胞や組織の顕微鏡イメージングに非常に適用可能であるが、この技術は、化学イメージングを含むがこれらに限定されない励起波長を変化させ可能である蛍光を利用したあらゆるタイプの実験にも有用であり、化学イメージング、環境応用、アイケア、食品科学、法医学、鉱物学

概要

スペクトルイメージングは、様々な方法で行われ、いくつかの用語1、2、3、4によって参照される。一般に、スペクトルイメージングとは、少なくとも2つの空間次元と1つのスペクトル次元で取得されたデータをいう。マルチスペクトルおよびハイパースペクトルイメージングは、ほとんどの場合、波長帯の数またはスペクトルバンドが連続して¹であるかどうかによって区別されます。このアプリケーションでは、ハイパースペクトルデータは、励起に使用される各バンドパスフィルタの半分の最大(FWHM)で全幅の半分以下の中心波長の間隔によって達成される連続した波長帯で取得されたスペクトルデータとして定義されます(すなわち、5 nm)14-20 nmの帯域幅を持つバンドパスフィルタのための中心波長間隔)。データ バンドの性質が連続しているので、データセットのオーバーサンプリングが可能で、スペクトル ドメインのサンプリング時にナイキストの基準が満たされます。

ハイパースペクトルイメージングは、1970年代と1980年代にNASAによって最初のランドサット衛星5、6と共に開発されました。複数の連続したスペクトルバンドからデータを収集すると、各ピクセルの輝度スペクトルの生成が可能になります。個々の成分の輝度スペクトルを特定して定義することで、その特性スペクトルによって表面材料を検出するだけでなく、信号の変動などの介在信号の除去も可能になりました。大気条件。その特性スペクトルを用いた物質検出の概念は、Shröckらが5つの異なる蛍光体と既知のスペクトルの組み合わせを使用して、呼ばれるプロセスで標識染色体を区別するために1996年に生物学的システムに適用されました。スペクトルカリオタイピング⁷.この技術は、2000年に鶴井らによって組織サンプルの蛍光イメージングのために、7つの蛍光色素と特異値分解を用いて、各ピクセルのスペクトル分離を参照のスペクトルの線形組み合わせに達成するために精緻化された。図書館⁸.彼らのリモートセンシング対応と同様に、各既知の蛍光体の寄与度は、各蛍光体のスペクトルの先行情報を与えられたハイパースペクトル画像から計算することができる。

ハイパースペクトルイメージングは、農業9、天文学10、生物医学11、化学^{イメージング12、}環境応用13、アイケア14、食品^科学15の分野でも使用されています。法医学^16,17, 医学¹⁸, 鉱物学¹⁹, および監視²⁰.現在の蛍光顕微鏡ハイパースペクトルイメージングシステムの主な制限は、標準的なハイパースペクトルイメージング技術が1)最初に励起光を濾過してサンプル励起を制御し、次に狭いバンドで蛍光信号を単離するということです。2)さらに、発光した光をフィルタリングして、蛍光発光を後で数学的に分離できる狭いバンドに分離する21。励起照明と放出蛍光の両方をフィルタリングすると、使用可能な信号の量が減少し、信号対雑音比が低下し、取得時間が長くなります。信号が小さくなり、取得時間が長いため、診断ツールとしてのハイパースペクトルイメージングの適用性が制限されます。

ハイパースペクトルイメージングを利用するが、利用可能な信号を高め、それによって必要な集録時間21、22を減らすイメージ投射様式が開発された。この新しいモダリティは、励起走査熱ハイパースペクトルイメージングと呼ばれ、励起波長を変化させ、広範囲の放射光を収集することにより、スペクトル画像データを取得します。この技術は、発光走査技術21、22と比較して、信号対雑音比の桁増加の桁数が増加することが以前に示されている。信号対雑音比の増加は、検出された発光の広帯域パス(約600nm)によるもので、特異性は蛍光発光の代わりに励起光のみをフィルタリングすることによって提供されます。これにより、すべての放出された光(すべての励起波長)が検出^器21に到達することができます。さらに、この技術は、外因性標識から自己蛍光を区別するために使用することができる。さらに、検出可能な信号の増加による集録時間を短縮できるため、光漂白の危険性が低減され、スペクトルビデオイメージングに許容される集録速度でスペクトルスキャンが可能になります。

このプロトコルの目的は、励起スキャンハイパースペクトルイメージング顕微鏡のデータ集録ガイドとして機能することです。さらに、ライト パスとハードウェアを理解するのに役立つ説明が含まれています。また、励起走査熱ハイパースペクトルイメージング顕微鏡用のオープンソースソフトウェアの実装についても説明する。最後に、NISTトレーサブル標準にシステムを校正し、正確な結果を出すためにソフトウェアとハードウェアの設定を調整し、検出された信号を個々のコンポーネントからの寄与にミックス解除する方法について説明します。

プロトコル

1. デバイスのセットアップ

1. 光源:高出力と高コリメーションを備えた広帯域スペクトル光源を選択します(これらの研究には300 W Xeアークランプを使用しました)。
2. シャッター(オプション):タイムラプスイメージング用の光漂白を減らすために、光学パスにシャッターを追加します。
3. 調整可能なフィルタシステム:機械的チューニングアセンブリと薄膜調整フィルタ(TFTF)セットを組み込み、所望の波長調整可能興奮範囲(例えば、360〜485nm)を可能にします。
4. 顕微鏡:電動ダイクロイックフィルタータレットとコントローラを含む反転蛍光顕微鏡を使用します。
   1. 蛍光フィルターキューブ:ロングパス蛍光フィルタキューブを組み立てます。最良の結果を得るためには、同じ波長でダイクロイックミラーとロングパス発光フィルタを選択して、発光光からの励起の最適な分離(例えば、495 nm)を達成します。
   2. 目的:実験に使用される波長範囲にわたって均一な焦点を確保するために、適切なアポクロマティック目的を使用します(この研究では60倍の水目的が使用されました)。
   3. 自動ステージ (オプション): 自動ステージを使用して、画像ステッチを使用して複数の視野や非常に大きなフィールドを迅速にサンプリングできます。目的とカメラでステージを調整します。
5. カメラ:実験の空間解像度、感度、騒音の要件を達成するために適切なカメラを選択します(このシステムは、高感度sCMOSカメラを利用しました)。

2. 取得ソフトウェア

1. Micro-Manager など、各ハードウェア コンポーネントを独立して制御できるソフトウェア パッケージを選択します。
   1. 構成ファイルの作成: 構成ファイルは、Micro-Managerがシステムのハードウェアを操作するためにロードする機器と命令の保存されたセットです。構成ファイルを作成するには、[ツール > ハードウェア構成ウィザード]をクリックします。
      1. 手順 1 で、[新しいコンフィギュレーションの作成 ]をクリックし、[次へ]をクリックして続行します。ユーザーは、既存の構成が既に使用可能な場合は、既存の構成を変更または探索することを選択できます。
      2. 手順 2 では、[使用可能なデバイス]リストを参照して、顕微鏡、ランプ、ステージ、シャッター、カメラなどの Micro-Manager を使用して制御するデバイスを見つけます。ハイライト表示されている場合は、[追加] をクリックします。ボタンをクリックすると、デバイスをインストール済みデバイスの一覧に追加できます。新しいウィンドウが開きます。
         1. [ラベル] ボックスでデバイスのラベルを指定します。(例:sCMOSカメラ)
         2. [値]で、各デバイスに適切な COM ポートを選択します。これにより、ウィンドウの下部にデバイス プロパティの一覧が表示されます。
         3. デバイスのプロパティは既定の設定のままにします。各デバイス プロパティのカスタム値は、必要に応じて入力されることがあります。
         4. 各デバイスを追加したら、[次へ]ボタンをクリックして次の手順に進みます。デバイスが取り除かれたり、変更する必要がある場合は、手順 2.1.1.1.1 で説明したように、構成ファイルを後で変更できます。
      3. 手順 3 では、ドロップダウン メニューを使用して、既定のカメラ、シャッター、フォーカスステージを選択します。自動シャッターが必要な場合は、フォーカスステージドロップダウンリストの下にあるチェックボックスをクリックします。Z ステージのフォーカス方向がわかっている場合は、ステージ フォーカスの方向 (詳細)の下にあるドロップダウン リストから選択します。それ以外の場合は、既定値を[不明]のままにします。
      4. ステップ 4 では、遅延 [ms]見出しの下にあるボックスをダブルクリックして、ランプ、ステージ、シャッターの遅延 100 ミリ秒、機械チューニング アセンブリへのコマンドの遅延 250 ミリ秒など、自動化されたデバイスに関連する遅延を設定します。フィルター間の機械的な切り替え時間。
      5. 手順 5 では、状態デバイスにラベルを割り当てます。励起走査察顕微鏡システムの構成は、フィルターブロック内のラベルを使用して、各蛍光フィルタキューブを識別します(例えば、状態0は、ブライト、ブライトフィールドイメージング中に使用される空のフィルタキューブに対応しています。状態3は、495 nmで励起光と発光光を分離するために使用されるラベル495 nmおよびカスタム495 nmダイクロイックフィルタキューブに対応する。ラベルは、各励起波長のスイッチングコマンドを格納する機械的チューニングアセンブリにも使用されます(例えば、状態0は、機械的チューニングアセンブリ用の340nm励起波長チューニングコマンドに対応します)。
      6. 手順 6 で、[構成ファイル]ボックスの横にある [参照]ボタンをクリックして、構成ファイルの保存場所とファイル名を選択します。[完了] をクリックして構成ファイルを保存します。
   2. スタートアップ グループとプリセット: Micro-Manager は、各構成ファイル内に異なるグループを格納して、ハードウェアのサブセットをアクティブ化または変更できます。たとえば、「システム起動」グループとプリセットの組み合わせには、カメラのビンのサイズや読み取りレートなどの既定の設定が格納されます。
      1. グループサブセクションのメインウィンドウで+をクリックして、グループ(システムなど)を作成します。
      2. グループ内の使用を確認しますか?デフォルト値を設定する必要があるグループ内のボックス(例えば、関連するデフォルトカメラでのビン分割)。
      3. プリセットサブセクションのメインウィンドウで+をクリックして、新しいプリセット(例:「スタートアップ」)を作成します。
      4. 手順 2 でチェックインした各ボックスは、ここでプリセット オプションとして表示されます。チェック ボックスごとに読み込む既定値を選択します。
   3. 励起波長のためのグループとプリセット:マイクロマネージャは、独自の波長スイッチングコマンドを使用して、各励起波長を独自のチャネルとして扱います。したがって、各プリセットとして保存する必要があります。
      1. 希望する励起波長のセットを含む新しいグループを作成します(例:「495 nmダイクロイック」)。
      2. VF-5 デバイスに対応する[グループで使用する]チェック ボックスをオンにします。
      3. 励起波長ごとに名前が付けられた新しいプリセット(例えば「340 nm」)を作成します。
      4. 各プリセットに適切なプロパティ名とプリセット値を割り当てます(例:プロパティ名:「ラベル」;プリセット値:「340 nm」など)。
   4. 多次元取得ツール:マルチD Acq。Micro-Managerウィンドウの左上付近で、1つのボタンをクリックするだけで各励起波長でサンプルの画像をキャプチャするために使用するカスタマイズ可能なツールを開きます。必要に応じて取得を構築するためのカスタマイズ オプションがいくつかあります。
      1. タイムポイント (この例では使用しない): タイムラプス成分のないスタディの場合は、このチェックボックスをオフのままにします。タイムラプススタディが必要な場合は、このチェックボックスをオンにします。オンにすると、[番号] ボックスに残りの取得設定を実行する回数を入力します。[間隔]ボックスに期間を入力して、連続する取得までの時間を設定し、適切な単位 (ミリ秒、秒、または分、通常は秒) を選択します。
      2. 複数の位置 (XY; この例では使用しない): 単一の XY 位置のスタディの場合は、チェックボックスをオフのままにします。複数の XY 位置が必要な場合は、チェック ボックスをオンにして[位置リストの編集]ボタンをクリックして別のウィンドウを開きます。ステージを各目的の場所に移動し、[マーク]ボタンをクリックして、ソフトウェア内の位置を保存します。必要な XY 位置がすべてマークされるまで、この手順を繰り返します。このウィンドウを閉じて続行します。
      3. Z スタック (スライド、この例では使用しない): 単一の Z 位置のスタディの場合は、チェックボックスをオフのままにします。複数の Z 位置が必要な場合は、チェック ボックスをオンにします。ステージを目的の開始 Z 位置に移動し、Zスタートボックスの横にある[設定]ボタンをクリックします。ステージを目的の Z 位置に移動し、Zエンドボックスの横にある[設定]ボタンをクリックします。Z ステップボックスに目的のステップ サイズ (ミクロン単位) を入力します。
      4. チャネル: [チャネル]チェック ボックスがオンであることを確認します。ここで、チャネルは、個々の励起波長に与えられる名前である。利用可能な「チャンネル」は、ステップ2.1.2および2.1.3で説明されている「グループ」に対応しています。
         1. グループ: ドロップダウン リストをクリックして、使用可能な励起波長 (495 nm dichroic など) を選択するグループを選択します。
         2. [シャッターを開いたままにする] ボックスをクリックすると、各チャンネルの取得時にシャッターを開いたままにします。このチェック ボックスをオンにすると、メイン ウィンドウでもオートシャッター オプションが選択されている場合は、連続したスペクトル スキャンの間にシャッターが閉じ続けます。
      5. [新規]ボタンをクリックして、取得リストにチャンネルを追加します。[削除]ボタンを使用して、不要になったチャンネルを削除し、[上下] を使用して選択したチャンネルの並べ替えに使用できることに注意してください。
         1. スペクトル スキャンで目的の波長ごとに[使用]チェック ボックスがオンに設定されていることを確認します。
         2. 設定:[設定]の下にあるドロップダウンリストをクリックし、目的のスペクトル範囲(例えば、340 nm)の最初の波長を選択します。
         3. 露出:露出の下のボックスをダブルクリックし、選択した波長の所望の露出時間を入力します(例えば、100ミリ秒の場合は「100」)。適切な露出時間を選択するための提案については、セクション5(「データ取得」)を参照してください。
         4. Z オフセット (スペクトル スキャンには適用されません): スペクトル スキャンを実行する場合は、このボックスを空白のままにします (0)。
         5. Z スタック: Z スタックを実行する場合は、スペクトル範囲内の各波長に対してこのボックスがチェックされていることを確認します。
         6. Fr. をスキップする (スペクトル スキャンでは適用されません):スペクトル スキャンを実行する場合は、このボックスを空白のままにします (0)。1 つまたは少ない励起波長が他の波長よりも大幅に強力な場合、または個々の励起波長が特に光毒性であることが判明した場合は、フレームを選択的にスキップすると便利です。
         7. 色: スペクトル スキャンを実行する場合は、このボックスを空白のままにします。色はデータビジュアライゼーションの目的で個々の波長帯に対して選択できますが、後続のスペクトルミキシングには色は不適切です。
         8. 所定のスペクトル走査範囲内で各励起波長が追加されるまで、これらの手順を繰り返します。
      6. 取得順序: ドロップダウンリストをクリックして、上記のオプション(2.1.4.1-2.1.4.5)を実行する順序を選択します。ここに示すようなスペクトルスキャンの場合、取得順序は単にチャネルです。追加のオプションは、マルチディクショナル取得ツール[タイムポイント、複数の位置(XY)]、およびZスタック(スライス)内でチェックされ、最初に位置または時間のいずれかを選択し、その後にスライスまたはいずれかのオプションが表示されることに注意してください。チャネル。
      7. 自動焦点(この例では使用しない):複数の位置(XY)が選択されている場合は、いくつかの異なるスタイルの自動焦点を使用できます。[オプション]ボタンをクリックし、[閉じる]ボタンの横にあるドロップダウン リストからオートフォーカス方法を選択します。
      8. 概要: このウィンドウを確認して、タイムポイント数、XY 位置、Z スライス、チャンネル、画像の総数、合計メモリ、スキャン期間、および取得順序の概要を確認して、リストされた情報が予想される取得設定と一致することを確認します。
      9. 画像を保存する: このチェック ボックスをオンにして、多次元取得ツールを使用して収集したデータを保存します。
         1. をクリックします。[ディレクトリルート] の横にあるボタンをクリックして、ファイルを保存するディレクトリ ルートを選択します。実験の関連する詳細(例えば、GCaMP気道平滑筋細胞)を記述する方法でディレクトリルートに名前を付けます。
         2. 現在のイメージ取得を説明する名前プレフィックスの横にあるボックスに名前を入力します (FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter など)。視野と露出時間、および使用するオブジェクトやダイクロイック フィルタなどのその他の関連情報を識別する名前プレフィックスを作成することをお勧めします。これらの設定を使用して取得した最初のイメージ スタックは、名前プレフィックスの後に "_1" で保存されることに注意してください。同じディレクトリ ルートと名前プレフィックスで取得された後続のスタックは "_n" で保存されます。
         3. 画像ファイルを別々にクリックして、励起波長ごとに生成された画像が保存されていることを確認します。
      10. 保存: [名前を付けて保存]ボタンをクリックすると、[多次元取得] ツールの右上にあるボタンをクリックして、これらの取得設定を保存して、将来簡単に使用できます。ディレクトリ ルートと名前プレフィックスも保存されることに注意してください。
      11. 取得:最後に、取得をクリック!ボタンをクリックすると、上記の取得設定に従って画像の取得を開始できます。

3. スペクトル応答補正(オプション):

1. スペクトル出力補正は、NISTトレーサブルランプやその他のNISTトレーサブル規格または計測器など、既知の標準に対するシステムのスペクトル応答を校正するために行うことができます。このステップは、結果が他の分光イメージング装置、分光計、または異なる実験室間で比較される場合に特に重要です。このプロセスは、以前に^21,23の詳細に報告されています。
   1. NISTトレーサブル光源(LS-1-CAL-INT、海洋光学系など)または他のNISTトレーサブル規格にキャリブレーションされた分光計を使用して、サンプル段階で測定された照明の分光放射パワーを取得します。光源設定、ダイクロイックミラー、および目的の組み合わせごとに個別の補正を実行します。分光計に結合された積分球を使用して、顕微鏡の目的から広角照明を正確に測定します。
   2. 台形ルールなどの統合方法を使用して、照らされた波長にわたって分光放射量データを統合します。中央波長を中心とした積分に40 nmの帯域幅は、14~20nmの全幅(FWHM)の公称帯域幅を持つほとんどのフィルタでは十分です。積分値は、各励起波長帯域におけるスペクトル照明の強度を表す。
   3. 各波長帯の集積強度を励起中心波長の関数としてプロットし、スペクトル照明強度プロファイルの視覚化を可能にする。
   4. 最も低い集積強度の波長帯域を決定します。
   5. 最も低い集積強度を各波長帯域の集積強度で割り、波長依存補正係数を生成することにより、スペクトル照明強度プロファイルを正規化します。

4. サンプル調製

1. 「ブランク」サンプルを調製します(例えば、ガラスカバースリップを細胞チャンバに入れ、1 mLのバッファーを追加します)。このバッファは、前述の²⁴.
2. 任意のサンプル自己蛍光を決定するためにラベルのないサンプルを調製する(例えば、標識されていない気道平滑筋細胞25、26を含むガラスカバースリップを細胞室に入れ、1 mLのバッファーを加える)。
3. 実験で使用される蛍光ラベルごとに、次のように個別の単一標識サンプルを調製します。
   1. 100 nM濃度を達成するために緩衝液に希釈ミトコンドリアラベルを追加します。気道平滑筋細胞を含むカバースリップにこのバッファを追加します。20~25°Cで20分間インキュベートします。カバースリップをセルチャンバに移動し、1 mLのバッファを追加します。ミトコンドリアラベルの最適な濃度は、製造元、関連色、所望の特異性などの要因によって異なることを注意してください。
   2. GCaMP^{プローブ27}でトランスフェクトされた気道平滑筋細胞を含むカバースリップを細胞室に移動し、1 mLの緩衝液を加える。
4. 所望の蛍光標識の混合物を含む1つまたは複数の実験試料を調出す。
   1. GCaMPプローブでトランスフェクトした気道平滑筋細胞を含むカバースリップに1mLのバッファー(ミトコンドリア標識の100nM濃度)を加え、20〜25°Cで20分間インキュベートする。カバースリップをセルチャンバに移動し、1 mLのバッファを追加します。

5. データ取得:

1. 適切なダイクロイックビームスプリッター(例えば、495 nmダイクロイックフィルタキューブ)、目的(例えば、水目的60倍)、およびカメラ(sCMOSカメラ)が選択されていることを確認します。
2. ステージにサンプルをロードします。
3. 露出[ms]の横にあるボックスをダブルクリックし、「100」と入力して露光時間を100ミリ秒に設定します。
4. 最初のサンプル表示のために、Micro-Managerメインウィンドウのドロップダウンメニューから475 nmを選択します。475 nm は、サンプルの表示や画像スタック全体で過飽和が発生するかどうかを判断するのに最適な波長ではない場合があることに注意してください。
5. [ライブ]をクリックしてサンプルを表示します。
   1. ウィンドウの下部にあるヒストグラムの横にある自動強度表示範囲ボタンAutoをクリックして、最小値と最大値を意味のある表示範囲にします。
6. 顕微鏡のフォーカスノブを使用してサンプルに焦点を合わせます。多くの場合、焦点を合わせるのに役立つサンプルのエッジを見つけるのに役立ちます。サンプルは、画像内のエッジ フィーチャがシャープに表示されたときにフォーカスされます。蛍光画像の表示に役立つフォーカス中に[自動]ボタンを数回クリックする必要がある場合があります。さらに、顕微鏡が透過モードの場合、一部のユーザーはサンプルに焦点を合わせるのが簡単な場合があります。
   1. 伝送モードでピントを合わせる場合は、安全のため、伝送イメージング用の光路を調整する前に、スペクトル光源が光をピースに送信していないことを確認してください。また、透過画像と蛍光画像の焦点との間に小さなずれがある場合があることにも注意してください。許容可能な焦点が達成されるとき、スペクトル蛍光イメージングのための光経路を再構成する。
7. マルチD Acqをクリックします。ウィンドウの左上にあるボタンをクリックして、マルチディクショナル取得ツールを開きます(セクション2で説明および構成)。
8. 多次元集録ツールウィンドウの右上にある[ロード...]ボタンをクリックし、励起設定に移動して、スペクトル集録に適切なスペクトル範囲(例えば、495 nmのダイクロイックフィルタの場合は360~485 nm)を選択します。(ステップ 2.1.4.10) 以前に保存されました。適切なスペクトル範囲に関する情報については、説明を参照してください。
9. 背景およびノイズの減算に使用する蛍光データを含たない背景/空白の画像を取得します。これは、空白のサンプル (手順 4.1) を使用するか、実験サンプルの空白領域に移動して実行できます。ステップ 5.6 で説明したように、これは、サンプルのエッジを見つけて、エッジが視野内で中央に配置することによって最も簡単に達成されます。
   1. 取得設定が確認され、背景領域が表示されたら、[取得!]ボタンをクリックして、背景とノイズを含むスペクトル 画像スタックを取得し、後で減算に使用します。なお、試料は試料の縁から離れてより強い蛍光を有する可能性が高い。サンプルの中を移動して「最も明るい」領域を見つけ、複数のテスト画像スタックを実行して適切な集録時間を決定し、露出過剰を回避することをお勧めします。
10. 強い蛍光を持っているように見えるサンプルの領域に単一の画像スタックを取り、波長の組み合わせがなく、露光時間が露出過剰に起こらないことを確認します。
11. ImageJ を使用して、波長に露出超過ピクセルが含まれていないことを確認します。
    1. ImageJ で、[ファイル > インポート > イメージシーケンス] をクリックし、手順 5.10 で撮影したスペクトル イメージを含むフォルダに移動します。新しいウィンドウが開きます。[画像数]の横にあるボックスをクリックし、スペクトル スキャンに含まれる波長の数を入力します (例: 26)。開始イメージと増分を "1" のままにします。[OK]ボタンをクリックして続行します。
    2. キーボードのMキーを押すと、ImageJのメジャー機能が利用できます。[最大数]に表示されている数が、カメラの上限検出限界 (65,535 など) ではないことを確認します。スペクトル スキャンの各イメージについて繰り返します。カメラの検出限界は、カメラ自体によって異ないことに注意してください。上限は、MicroManager のメイン ウィンドウにあるヒストグラムの右上の部分に表示されます。または、ImageJ でイメージを開き、イメージを調整 > 明るさ/コントラストに移動することで、上限を決定できます。結果のポップアップ ウィンドウの[設定]ボタンをクリックし、[最大表示値] の横の空白に過度に大きな値 (999,999 など) を入力し、[OK] をクリックして続行します。 新しいヒストグラムに表示される最大値は、カメラの上限検出限界である必要があります。
    3. カメラの上限検出限界(例:65,535)が含まれている画像がある場合は、スペクトルスキャンの露光時間を調整して、スペクトル範囲全体の最大信号がカメラのダイナミックレンジを超えないようにします。
12. ラベルのないサンプルからスペクトル画像データを取得し、自己蛍光を決定します。実験の残りの部分と同じ波長範囲とカメラ設定を使用して、ラベルのないサンプルのスキャンを取得します(例えば、波長あたり100ミリ秒で360〜485 nm)。
13. 単一ラベルのサンプルからスペクトル画像データを取得し、スペクトルライブラリを構築するためのスペクトルコントロールとして使用します。同じ波長範囲、露光時間、カメラ設定を使用して、各ラベルのスキャンを実行します。ノイズの影響を最小限に抑えながら正確なラベルスペクトル検出を可能にするために、一部のサンプルでは取得時間が長くなる場合があります。
14. 実験サンプル(例えば、GCaMPプローブおよびミトコンドリア標識を有するヒト気道平滑筋細胞)に対して測定を行う。
    1. 実験サンプルを含むスライドまたはカバースリップを顕微鏡に置きます。
    2. 組織の適切に標識されたセルを持つ視野を選択します。
    3. 前述のように、目的の取得設定を使用してスペクトル画像データを取得します。

6. 画像解析

1. フラットスペクトル応答に画像を修正します。
   1. セクション 5.9 で得られたバックグラウンド スペクトルを減算し、セクション 3.1.5 で決定された補正係数を乗算します。これは、単純な MATLAB スクリプトまたは ImageJ ルーチンを使用して行うことができます。減算/補正 MATLAB コード (この例で使用) は、サウス アラバマ大学バイオイメージング リソースの Web サイトで入手できます。
      1. MATLAB に減算/補正コードをロードします。
      2. [エディタ] タブで、[実行]をクリックします。Bsq補正ボタンを含む新しいウィンドウが開きます。[Bsq補正] ボタンをクリックすると、作業ディレクトリ、バックグラウンド ファイル、補正係数ファイル、および修正されていない tiff フォルダの選択肢を含む別のウィンドウが開きます。
         1. ブラウズを使用...[作業ディレクトリ]の横にあるボタンをクリックして、後続のウィンドウが開くファイル パスを選択します。保存されたバックグラウンドスペクトルを含むフォルダに移動します (.dat 形式)。
         2. ブラウズを使用...[バックグラウンド ファイル (.dat) の横にあるボタンをクリックすると、手順 6.1.1.2.1 で選択したディレクトリを開き、目的のバックグラウンド ファイル (.dat 形式) を選択します。[開く] ボタンをクリックして続行します。
         3. 補正係数を選択するには、[参照]ボタンを使用します。修正係数のディレクトリは、デフォルトでは親 MATLAB コードの場所に設定されます。必要に応じて、修正係数ファイルを含むサブフォルダに移動します (.dat 形式)。適切な補正係数ファイルを強調表示し、[開く] ボタンをクリックして続行します。
         4. [参照] ボタンを使用して、修正されていない Tiff フォルダの横にあるディレクトリを開き、手順 6.1.1.2.1 で選択したディレクトリを開き、背景減算と画像補正用のフォルダを選択します (通常は、すぐに生を含む Pos0 フォルダです)スペクトル画像)。[開く]ボタンをクリックして続行します。
         5. [スペクトル補正] ボタンをクリックします。処理が完了すると、ウィンドウが開き、「Bsq 補正完了」というメッセージが表示されます。[OK]ボタンをクリックして続行します。補正画像は、元の生のスペクトルイメージフォルダと追加の「_Corrected」(例えば、Pos0_Corrected)という名前の新しいフォルダに格納されます。
2. スペクトル ライブラリを生成します。ImageJ を含む画像からスペクトル データを抽出するために、いくつかのソフトウェア パッケージを使用できます。最良の結果を出すために、どの波長帯が最も強い値を持つかを決定し、各波長帯域での測定値をその最大値で除算することにより、各エンドメンバーを最大強度の波長帯に正規化します。また、自己蛍光サンプル内で生成された単一ラベルコントロールは、追加の変更28、29、30、31、32を必要とされることに留意すべきです。詳細については、手順 6.2.4 およびディスカッションを参照してください。
   1. ImageJ で、[ファイル][インポート> イメージシーケンス] をクリックします。新しいウィンドウが開きます。修正されたスペクトル イメージを含むフォルダに移動します。フォルダ内の画像ファイルをダブルクリックして、新しいウィンドウを開きます。[画像数]の横にあるボックスをクリックし、スペクトル スキャンに含まれる波長の数を入力します (例: 26)。開始イメージと増分を "1" のままにします。[OK]ボタンをクリックして続行します。
   2. ImageJ メイン ウィンドウで、[ポリゴン選択]アイコンをクリックし、画像をクリックしてマウス ポインターを使用して、蛍光データを含む領域の周囲にポリゴンを作成します。なお、初期波長には蛍光データがほとんどない、または全く存在しない場合があることに注意してください。別の波長画像に移動したり、明るさ/コントラストツールを使用したり(画像> 調整 > 明るさ/コントラスト >Auto) を使用して、目的の蛍光データを含む領域をより良く視覚化します。
   3. ポリゴンを描画した後、[イメージ > スタック> プロット Z 軸プロファイル]をクリックして Z 軸プロファイルを生成します。新しいウィンドウが開きます。スペクトル データを .csv ファイルとして保存するには、[保存] をクリックします。
   4. 減算を実行して、自己蛍光汚染を欠く純粋なラベルを持つ適切なスペクトルライブラリを確保します。次の式²⁹を使用して、単一標識と蛍光の混合物から純粋なスペクトルを分離します。
      (1)
      どこ:S_純粋はラベルの純粋なスペクトルであり、S_混合は自己蛍光で汚染されたサンプルの測定スペクトルであり、S _autoFLは測定された自己蛍光スペクトルであり、「a」はスカラーである自己蛍光スペクトルの乗数(0~1;例えば0.4)と「オフセット」はオフセット(通常は0)です。自己蛍光の明らかな寄与度がゼロに近い値が達成されるまで、「a」項を変えます。追加情報は、いくつかの出版物28、29、30、31、32で見つけることができます。
3. スペクトル画像データのミックスを解除します。混合解除工程は、各蛍光標識に対して豊富な画像を生成し、ここで、それぞれの標識からの画像中の相対蛍光シグナルの量である。ImageJ^33、34、35で使用できるいくつかのアンミキシング アルゴリズムを使用できます。さらに、スペクトルアンミキシングMATLABコード(この例で使用)は、サウスアラバマ大学バイオイメージングリソースのウェブサイトで入手できます。スペクトルアンミキシングのより包括的な概要^は、36で利用可能です。
   1. MATLAB でスペクトルアンミキシング コードをロードします。
   2. 実験条件に対応するようにWavelength.matファイルとLibrary.matファイルを編集します(例えば、「波長」は360~485を5単位で)。
      注:これらの波長の対応する値は、各蛍光ラベル(および自己蛍光)の「ライブラリ」にロードする必要があります。Endmember_Name は、"ライブラリ" の列値と同じ順序でラベルを一覧表示する必要があります。Library.mat ファイルには、"ライブラリ" 変数と "Endmember_Name" 変数の両方が含まれている必要があります。
   3. [エディタ] タブで、[実行]をクリックします。これにより、ユーザーがディレクトリを選択できる新しいウィンドウが開きます。混合されていないスペクトル イメージを含むフォルダに移動します。一度選択すると、新しいウィンドウが開きます。
   4. 結果として得されるブランクでは、画像名(例えば、GCaMPおよび水戸FOV1を有するHASMC)、波長帯域の数(例えば、26)、タイムポイントの数(例えば、1)、およびFRET測定がそれぞれのブランクに望まれるかどうか(例えば、n)を入力する。FRET に "n" が選択されている場合は、両方のエンドメンバーブランクを空白のままにします。[OK]を押して続行すると、新しいウィンドウが開きます。
   5. Wavelength.mat ファイルを含むフォルダに Naviagate します。選択したら、[開く]をクリックして続行し、新しいウィンドウを開きます。
   6. Library.mat ファイルを含むフォルダに移動します。選択したら、[開く]をクリックして続行すると、スペクトル イメージを含むディレクトリ内の新しい "混在しない" フォルダに混在していないイメージが保存されます。
4. 混合されていないスペクトル画像の品質を調べ取る。
   1. 混合されていない各画像を開き、純粋なコンポーネントの分布を視覚的に検査します。
      1. エラー画像の大きさと混在していない画像の大きさを比較します(ステップ5.11と同様に、これはImageJの測定関数を使用して行うことができます)。誤差画像の大きさが混在していない豊富な画像と大きさが類似している場合、スペクトルライブラリと線形スペクトルアンミックス処理によって正確に説明されていないスペクトル画像データに信号が存在する可能性があります。
      2. エラー・イメージを混在しないイメージと比較して、未確認の残留構造があるかどうかを確認します。

結果

このプロトコルからいくつかの重要な手順は、イメージングとスペクトルアーティファクトの正確さと欠如の両方のデータの収集を確保するために必要です。これらの手順をスキップすると、重要に見えるが、他のスペクトルイメージングシステムでは検証または再現できないデータが生成され、その結果、そのデータで行われた結論が事実上無効になります。これらの重要なステップの中で主なものは、適切なスペクトル出力補正(セクション3)です。補正係数は、調整可能興奮系のスペクトル出力における波長依存的変動を補正します。これは、光照明パワーが低出力励起の波長に匹敵するように高出力励起で波長をスケーリングすることによって達成され、平坦なスペクトル励起プロファイルを達成します。不適切な補正係数の例としては、1 つまたは複数の波長で非常に低い値 (<0.001 など) が含まれているものがあり、それらの波長で測定される強度値をフラットなスペクトル応答を達成するために大幅に減衰する必要があることを示しています。

ディスカッション

励起スキャンハイパースペクトルイメージングセットアップの最適な使用は、光路の構築から始まります。特に、光源、フィルタ(tableおよびdichroic)、フィルタ切り替え方法、およびカメラの選択は、利用可能なスペクトル範囲、可能なスキャン速度、検出器感度、および空間サンプリングを決定する。水銀アークランプは、多くの励起波長ピークを提供しますが、フラットなスペクトル出力を提供せず、スペクトル画像データをNISTトレーサブル^応答38に戻すために、出力ピークで大幅な信号低減を必要とします。Xeアークランプおよび白色光超連続レーザーのような代替光源は、励起走査熱ハイパースペクトルイメージング38、39、40に適したより均一なスペクトル出力を提供してもよい。光源、微工フィルタ、およびダイクロイックフィルタの選択により、使用可能なスペクトル範囲が決まります。この範囲は、実験サンプルの所望のスペクトル情報を慎重に考慮し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
気道平滑筋細胞	National Disease Research Interchange (NDRI)NDRI	から得られたヒト肺組織から単離	高自家蛍光、カルシウム感受性細胞
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	光退色を最小限に抑えるリモートコントロールシャッター
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	複数の視野やスティッチ画像を自動的に収集するためのリモートコントロールステージです。
自動ステージコントローラー (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	コンピューターおよびジョイスティックとの自動ステージとのインターフェース用
社内	製 バッファー 自社製		145 mM NaCl、4 mM KCl、20 mM HEPES、10 mM D-グルコース、1 mM MgCl2、1mM CaCl2、pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber、 A7816	外科用ステンレス鋼とゴム製Oリングで構成されたカバースリップホルダーで、媒体を密封し、サンプルや対物汚染を防止します
励起フィルター	Semrock Inc.	TBP01-378/16	中心波長範囲 (340-378 nm), 帯域幅 (最小 16 nm, 公称 FWHM 20 nm), 屈折率 (1.88)
	株式会社セムロック	TBP01-402/16	中心波長範囲 (360-400 nm), 帯域幅 (最小 16 nm, 公称 FWHM 20 nm), 屈折率 (1.8)
	株式会社セムロック	TBP01-449/15	中心波長範囲 (400-448.8 nm), 帯域幅 (最小 15 nm, 公称 FWHM 20 nm), 屈折率 (1.8)
	株式会社セムロック	TBP01-501/15	中心波長範囲 (448.8-501.5 nm), 帯域幅 (最小15 nm, 公称FWHM 20 nm), 屈折率 (1.84)
	株式会社セムロック	TBP01-561/14	中心波長範囲 (501.5-561 nm), 帯域幅 (最小 14 nm, 公称 FWHM 20 nm), 屈折率 (1.83)
蛍光フィルターキューブ ダイクロイックビームスプリッター	セムロック	FF495-Di03	495 nmで励起光と発光光を分離(350-488 nmで>98%反射、502-950 nmで>93%透過)、フィルター有効指数(1.78)
蛍光フィルターキューブロングパスフィルター	株式会社セムロック	FF01 496/LP-25	496 nm(503.2-1100 nmの平均透過率>93%)より長い光の通過を許可し、屈折率(1.86)
GCaMPプローブ	Addgene	G-CaMP3;プラスミド #22692	単一波長GCaMP2ベースの遺伝的にコードされたカルシウムインジケーター
積分球	オーシャンオプティクス	FOIS-1	広角照明の正確な測定に使用
倒立蛍光顕微鏡	ニコンインスツルメンツ	TE2000	倒立顕微鏡は、媒体や組織の層を貫通することなく、サンプルを直接励起することができます。
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	ラベル ミトコンドリア
NISTトレーサブルキャリブレーションランプ	オーシャンオプティクス	LS-1-CAL-INT	標準として使用するための既知のスペクトルを持つランプ
NISTトレーサブルフルオレセイン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	F36915	システムの適切なスペクトル応答を確認するため
NucBlue	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R37605	ラベル 細胞核
対物レンズ (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	広い視野に便利
対物レンズ (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	組織サンプルに最もよく使用されます
対物レンズ (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	細胞サンプルに最も頻繁に使用されます
sCMOS カメラ	フォトメトリクス	プライム 95B (リビジョン A8-062802018)	高感度デジタル画像の取得用
分光計	オーシャンオプティクス	QE65000	励起スキャンスペクトルシステムのスペクトル出力を測定するために使用されます
チューナブルフィルターチェンジャー	サッター機器	ラムダ VF-5	自動励起フィルターチューニング用電動ユニット/
キセノン アークランプ	Sunoptic Technologies	Titan 300HP 光源	比較的均一なスペクトル出力を持つ光源