ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X 染色体の薬理学的再活性化の可能性、忍容性及び安全性を試験するプロトコールについて述べる。
ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X 染色体の薬理学的再活性化の可能性、忍容性及び安全性を試験するプロトコールについて述べる。
X 染色体不活性化 (XCI) は、雌の 1 X 染色体のランダムサイレンシングで、男女間の遺伝子投薬バランスを達成する。その結果、全ての雌は X 結合遺伝子発現に対してヘテロ接合である。XCI の主要な調節因子の1つはXistであり、XCI の開始と維持に不可欠である。これまでの研究では、13のトランス作用 X 染色体の不活化因子 (XCIFs) を、大規模な機能喪失遺伝的スクリーンを用いて同定した。ACVR1 や PDPK1 などの XCIFs の阻害は、短ヘアピン RNA または低分子インヒビターを用いて、培養細胞において活性化 X 染色体結合遺伝子である。しかしインビボで不活性 X 染色体を再活性化することの実現可能性および忍容性は決定されないままである。この目的のために、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpマウスモデルは、1つの X 染色体上のXCIの欠失により非ランダム Xist で生成されました。このモデルを用いて、不活性 X 再活性化の程度を、XCIF 阻害剤による処置後のマウス脳に定量した。最近発表された結果は、初めて、生きているマウス脳の皮質ニューロンにおける不活性 X 染色体からの XCIFs の薬理学的阻害をMecp2したことを示す。
X 染色体不活性化 (XCI) は、女性1の x 染色体の1つのコピーをサイレンシングすることによって x 結合遺伝子発現のバランスをとった投薬補償のプロセスである。その結果、不活性 X 染色体 (Xi) は、ヒストン H3-リジン 27 trimethylation (H3K27me3) およびヒストン H2A ユビキチン化 (H2Aub) のような、DNA メチル化および阻害ヒストン修飾を含む heterochromatin の特徴的な特徴を蓄積する2. x 染色体サイレンシングのマスターレギュレータは x 不活性化センター (Xic) 領域、約100− 500 kb であり、x 染色体の計数および対形成、不活化のための x 染色体の無作為な選択、および開始およびX 染色体3に沿ったサイレンシングの広がり。X 不活性化のプロセスは、染色体全体のサイレンシングを仲介し、X 染色体4の三次元構造を改造するために、 cisで Xi を覆う x 不活性特異的転写物 (Xist) によって開始される。最近、いくつかのプロテオームおよび遺伝スクリーンは、 Xist相互作用タンパク質5、6
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マウスを含む作業は、バージニア大学機関動物ケア・ユース委員会 (IACUC; #4112) によって承認されました。
1. Xi に遺伝的に標識されたMecp2を持つ非ランダム XCI マウスモデルを生成する
注:研究で使用されたマウス系統は次のとおりであった: Mecp2/Mecp2 (Mecp2tm 3.1 鳥、材料のテーブル) およびXist/ΔXist (B6; 129-Xist < tm5Sado >; アントニオ・ Bedalov が提供したフレッドハチンソンがんセンター, シアトル).それぞれの菌株のうち繁殖戦略は、各菌株についてマウスコロニーを拡張するように設計されている。
2. XistΔを生成するマウス繁殖戦略を設計します: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp
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XistΔの実現可能性を示すために、 Mecp2/Xist: xi 再活性化研究のための Mecp2-gfp マウスモデルは、XCIF 阻害剤を媒介とする xi-結合Mecp2-gfpの再活性化をマウス胚線維芽細胞 (MEFs) で試験した。女性 MEFs は、第3項に記載されているように 15.5 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp胚の日から単離した (図 1a)。女性 XistΔの遺伝子型: Mecp2/Xist: Mecp2 MEFs は、前述したようにジェノタイピング− PCR によって確認された (図 1b)、および FACS ベースのアッセイ (図 1c)。MEFs は、DMSO または2つの薬剤 LDN193189 および GSK650394 (それぞれ0.5 μ m および2.5 μ m) .......
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以前は、哺乳動物雌細胞において Xi 結合遺伝子のサイレンシングに選択的に必要とされている XCIFs が、12を同定した。さらに、マウス線維芽細胞株、マウス皮質ニューロン、およびヒト線維芽細胞における Xi-結合Mecp2を効率的に再活性化する PDPK1 の ACVR1 や下流エフェクターなど、XCIFs を標的とする強力な低分子阻害剤を最適化しました。RTT の患者から導かれるライン。これらの結果は、Xi の再活性化が X 結合疾患患者の遺伝子欠損を救出するための妥当な治療アプローチであることを示唆している。しかし、in vivo の実現性は決定されたままである。最近、XCIF 阻害剤は、 Mecp2の非ランダムXistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2マウスモデルが生成されたインビボにおいて Xi −結合した発現を再活性化することが示された。
XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpモデルの魅力的な特徴はいくつかの理由の Xi-リンク.......
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作者は何も開示することはありません。
著者は、試薬を提供するためのアントニオ・ Bedalov に感謝します。バージニア大学 cryosectioning の組織体のコアバージニア大学フローサイトメトリーはフローサイトメトリー分析のコアです。キリスト教の青とジェノタイピングの技術支援のための Saloni シン。この作品は、Z.Z. へのダブルフー研究助成金によってサポートされていました, そして、バージニア大学-バージニア工科種子基金賞とハートウェル財団個々のバイオメディカル研究賞を S.B. にパイロットプロジェクトプログラム賞を受賞しました
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | ジャクソン研究所 | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | 提供:Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| 試薬 | |||
| mm カバースリップ | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡 Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm培養皿 | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| 塩化アンモニウム (NH4Cl) | フィッシャーケミカル | A661-3 | |
| 抗GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| 抗MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| ブプレノルフィン SR | Zoopharm | ||
| クエン酸 | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | フィッシャー バイオ試薬 | BP231-100 | |
| ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| エタノール | Decon Labs | 2701 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | VWR ライフサイエンス | 89510-198 | |
| ゼラチン | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| スライドガラス | Fisherbrand22-034-486 | ||
| ヤギ抗鶏FITC標識二次抗体 | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| ハミルトン10μl シリンジ | ハミルトン シグマ-アルドリッチ | 28615-U | |
| ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| ケタミン | ケタセット | NDC 0856-2013-01 | |
| 大型鈍器/鈍い湾曲ハサミ | ファイン サイエンス ツール | 14519-14 | |
| LDN193189 | ケイマン ケミカルズ | 11802 | |
| ロジキサノール | シグマ | ||
| 1343517塩化マグネシウム(MgCl2) | フィッシャーケミカル | M35-212 | |
| メチルセルロース | シグマ | M0262-100G | |
| 封入剤、DAPI | ベクタシールド | H-1200 | |
| ニードルチップ付き、26 GA x 1.25 " | PrecisionGlide | 305111 | |
| 眼科軟膏 | リフレッシュラクリルーブ | 93468 | |
| 最適な切断温度(O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| ペニシリン/ストレプトマイシン (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| 塩化カリウム (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| メスブレード | |||
| 浅いガラスまたはプラスチックトレイ | |||
| の皮膚接着剤/組織接着剤 | 3M Vetbond | 1469SB | |
| アジ化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | CAS 26628-22-8 | |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | フィッシャーケミカル | S642-212 | |
| 標準止血鉗子 | ファインサイエンスツール | 13013-14 | |
| 標準ピンセット | ファインサイエンスツール | 11027-12 | |
| ストレートアイリスハサミ | ファインサイエンスツール | 14058-11 | |
| ショ糖 | フィッシャーサイエンティフィック | BP220-1 | |
| ベース | フィッシャーバイオ試薬 | BP152-5 | |
| トンX-100 | ッシャーバイオ試薬 | BP151-500 | |
| プシンEDTA | ギブコ | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| 機器 | |||
| Zeiss AxioObserver ライブセル顕微鏡 | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm バリ | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| 遠心分離 | |||
| 機ガラスホモジナイザー | |||
| 細胞培養インキュベーター | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i 13-998-213 | ||
| Leica 3050S research cryostat | |||
| 定位プラットフォーム | |||
| サーモサイクラー | |||
| タイマー | |||
| 超遠心分離機 | ベックマン・コールター オプティマ L-100 XP | ||
| ウォーターバス(37ºC) | フィッシャーサイエンティフィックアイソテンプ2239 |
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