ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X 染色体の薬理学的再活性化の可能性、忍容性及び安全性を試験するプロトコールについて述べる。
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この記事について
サマリー
要約
X 染色体不活性化 (XCI) は、雌の 1 X 染色体のランダムサイレンシングで、男女間の遺伝子投薬バランスを達成する。その結果、全ての雌は X 結合遺伝子発現に対してヘテロ接合である。XCI の主要な調節因子の1つはXistであり、XCI の開始と維持に不可欠である。これまでの研究では、13のトランス作用 X 染色体の不活化因子 (XCIFs) を、大規模な機能喪失遺伝的スクリーンを用いて同定した。ACVR1 や PDPK1 などの XCIFs の阻害は、短ヘアピン RNA または低分子インヒビターを用いて、培養細胞において活性化 X 染色体結合遺伝子である。しかしインビボで不活性 X 染色体を再活性化することの実現可能性および忍容性は決定されないままである。この目的のために、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpマウスモデルは、1つの X 染色体上のXCIの欠失により非ランダム Xist で生成されました。このモデルを用いて、不活性 X 再活性化の程度を、XCIF 阻害剤による処置後のマウス脳に定量した。最近発表された結果は、初めて、生きているマウス脳の皮質ニューロンにおける不活性 X 染色体からの XCIFs の薬理学的阻害をMecp2したことを示す。
概要
X 染色体不活性化 (XCI) は、女性1の x 染色体の1つのコピーをサイレンシングすることによって x 結合遺伝子発現のバランスをとった投薬補償のプロセスである。その結果、不活性 X 染色体 (Xi) は、ヒストン H3-リジン 27 trimethylation (H3K27me3) およびヒストン H2A ユビキチン化 (H2Aub) のような、DNA メチル化および阻害ヒストン修飾を含む heterochromatin の特徴的な特徴を蓄積する2. x 染色体サイレンシングのマスターレギュレータは x 不活性化センター (Xic) 領域、約100− 500 kb であり、x 染色体の計数および対形成、不活化のための x 染色体の無作為な選択、および開始およびX 染色体3に沿ったサイレンシングの広がり。X 不活性化のプロセスは、染色体全体のサイレンシングを仲介し、X 染色体4の三次元構造を改造するために、 cisで Xi を覆う x 不活性特異的転写物 (Xist) によって開始される。最近、いくつかのプロテオームおよび遺伝スクリーンは、 Xist相互作用タンパク質5、6、7、8、9などの XCI の追加のレギュレータを同定した,10,11,12.例えば、以前の研究では偏りのないゲノム全体の RNA 干渉スクリーンを用いて、13のトランス作用性 XCI 因子 (XCIFs)12を同定した。実施、XCIFs はXist発現を調節し、したがって、XCIFs 機能を妨害すると、欠損 XCI12が生じる。この分野における最近の進歩によって、XCI を開始し維持するために必要な分子機械についての重要性が理解されています。
XCI レギュレータの同定と XCI におけるそれらのメカニズムの理解は、レット症候群 (RTT)13、14などの X 結合されたヒト疾患に直接関連する。RTT は、主として女児15に影響を及ぼす X 結合メチル CpG 結合タンパク質 2 (MECP2) におけるヘテロ接合突然変異によって引き起こされる稀な神経発達障害である。MECP2は X 染色体上に位置しているため、50% の細胞が野生型を発現し、~ 50% の変異型MECP2を発現しているMECP2欠損症に対して RTT 女児がヘテロ接合である。注目すべきことに、RTT 突然変異細胞は、Xi 上でMecp2の休眠であるが野生型のコピーを提供し、活性化されればこの疾患の症状を緩和する可能性がある機能遺伝子の供給源を与える。RTT に加えて、いくつかの他の X 結合されたヒト疾患があり、そのために、Xi の再活性化は、DDX3X 症候群などの潜在的な治療的アプローチを表す。
XCIFs の阻害は、3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ− 1 (PDPK1)、およびアクチビン A 受容体タイプ 1 (ACVR1)、短いヘアピン RNA (shRNA) または小分子インヒビターによって、再活性化 Xi −連結遺伝子12による。Xi 結合遺伝子の薬理学的再活性化は、マウス線維芽細胞株、成体マウス皮質ニューロン、マウス胚性線維芽細胞、および RTT 患者12に由来する線維芽細胞株を含む様々な ex インビボモデルにおいて観察される。しかしながら、Xi 結合遺伝子の薬理学的再活性化がインビボで実現可能であるかどうかは、未だ実証されていない。1つの制限要因は、再活性化 Xi からの遺伝子の発現を正確に測定するための効果的な動物モデルの欠如である。この目的のために、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpマウスモデルは、母体 X 染色体16に Mecp2 でヘテロ接合欠失に起因する全ての細胞において Xi に遺伝的に標識されたXistを運ぶことを生成している。このモデルを用いて、Xi からのMecp2の発現は、生きているマウスの脳内の XCIFs 阻害剤による処置に続いて定量された。ここで、 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2マウスモデルの生成および免疫蛍光ベースのアッセイを用いた皮質ニューロンにおける Xi 再活性化を定量する方法論が記載されている。
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プロトコル
マウスを含む作業は、バージニア大学機関動物ケア・ユース委員会 (IACUC; #4112) によって承認されました。
1. Xi に遺伝的に標識されたMecp2を持つ非ランダム XCI マウスモデルを生成する
注:研究で使用されたマウス系統は次のとおりであった: Mecp2/Mecp2 (Mecp2tm 3.1 鳥、材料のテーブル) およびXist/ΔXist (B6; 129-Xist < tm5Sado >; アントニオ・ Bedalov が提供したフレッドハチンソンがんセンター, シアトル).それぞれの菌株のうち繁殖戦略は、各菌株についてマウスコロニーを拡張するように設計されている。
- 表 1に列挙した遺伝子特異的プライマーを用いて育種後に得られたすべてのマウス系統およびそれぞれの progenies に対して PCR ジェノタイピングを行う。
2. XistΔを生成するマウス繁殖戦略を設計します: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp
- Mecp2/Y オスと XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 メスを一緒に収容することによって繁殖ペアを設定する (12 h/12 h: 明暗サイクル) (図 1a)。理想的には、実行可能で肥沃なマウスを使用して、一度に少なくとも5つの繁殖ペアを設定します。妊娠中の女性が出産した後、彼女は男性と彼女の最初のごみを上げることができます。
注:父方のXistノックアウトは、インプリントされた XCI、投薬報酬、および分化経路17を損なうので、育種におけるXistΔ・ Mecp2/Yマウスの使用は、必要な遺伝子型を有する雌の仔を産生することに失敗するであろう。 - 出生後21日目 (P21) に XistΔを離乳した後、PCR ベースのジェノタイピングアッセイを使用して、 Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpメス仔を識別し、タグ付けします (図 1b)。
注:グループごとに必要な動物の数に関して、以下に報告された結果について、約10人の女性XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpマウスを発生させた5つの繁殖ペアをセットアップした。 - すべての提案された実験にメスマウスモデルを使用します。
注:性は XCI 研究の重要な生物学的変数であり、男性モデルはランダム XCI の交絡効果を考慮していない。 - 動物の研究を通して一貫しているし、動物の年齢の任意の効果を除外するには、5−8週齢の女性XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2マウスですべての実験を行います。
3. 単離雌XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2マウス胚線維芽細胞 (MEFs)
- Mecp2/YオスとXistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2メスの間の時間合致を設定します。妊娠の可能性を高めるために少なくとも3−4つの嵌合ケージを設置してください。
- 交尾後の朝に膣栓を確認した後、雌とこの日を分離し、胚の日 0.5 (E 0.5) と考えられる。妊娠している見込みのある女性の体重増加を監視し、マウスの腹部を目視で検査して、妊娠を確認します。E 14.5 −15.5 において、euthanize は子宮頸部脱臼を介して妊娠雌マウスを用いた。
- 層流のフードの下で、70% のエタノールで妊婦の腹部を拭きます。滅菌はさみを使用して、腹腔を解剖し、胚を含む子宮角を除去する。鉗子を使用して、残りの腹部組織を切断しながら静かに胚を取り出す (6 −12胚が通常予想される)。
- 10 mm 組織培養皿に胚を含む子宮角を配置する。生殖不能のはさみおよび鉗子を使用して、胚を運ぶ個々の嚢を隔離するために子宮の角に沿って切開をしなさい。慎重に、残りの胚を含む子宮角を、滅菌ハンクスの平衡塩溶液 (HBSS) の 30 mL に氷上に置く。
- 嚢を静かに切断し、滅菌はさみおよび鉗子を使用して胚を分離する。臍帯を切断して胎盤を取り除く。
- 胚を斬る。
注:胚組織の残りの部分はさらに処理されますが、胚の頭部からの組織は、ジェノタイピングのために DNA を分離するために使用されます。 - 生殖不能のはさみおよび鉗子を使用して胚の正中線を切ることによって腹部を開ける。心臓、肝臓、肺など内臓器官を取り除きます。
- 残りの胚組織を滅菌 60 mm 組織培養プレートに移し、はさみまたはかみそりの刃を使用して小片に切断します。細胞集塊を開いて破るには、トリプシン-EDTA を 3 mL 追加します (0.05%)37° c で15分間インキュベートします。
- トリプシン-EDTA を中和して、ダルベッコ改変の改変イーグル培地 (DMEM) を 10% のウシ胎児血清 (FBS) と10μ g/mL のペニシリン・ストレプトマイシン (pen/喉頭炎) をプレートに加え、繰り返しピペッティング (約20−30回) して組織を解離させる。
- 5分間 300 x gで細胞をスピンダウンし、10% FBS および10μ g/mL のペン/喉頭炎で 4 ML の DMEM 中で細胞ペレットを再懸濁させる。細胞を 60 mm 培養皿上にプレートし、5% CO2 の存在下で37° c で細胞を培養する。
- 各胚のためのステップ3.5 −3.10 を実行してください。
- ステップ3.11 で得られた培養 MEFs は、少なくとも3−4日間。
注:この段階で、MEFs は将来の実験のために凍結保存することもできます。 - 各胚の性および遺伝子型を決定するために、表 1に列挙したプライマーおよび PCR 条件を用いて胚の頭部から単離された DNA を用いてジェノタイピング− PCR を行う。
4. XistΔの脳における緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現の欠如を確認する: Mecp2/Xist: Ffluorescence 活性化細胞選別ベースのアッセイを用いた Mecp2-GFP マウス
- はさみを使用して、大脳皮質を残りの脳半球から分離し、250 mM ショ糖を含む氷冷核分離培地 (NIM) 緩衝液1ml、25 mM 塩化カリウム (KCl)、5 mM 塩化マグネシウム (MgCl2)、10 mm トリス-Cl、2% パラホルムアルデヒド (PFA)、および 0.1% 非イオン性界面活性剤 (材料の表) を添加した。
- 氷冷ガラスホモジナイザーを使用して均質化します。
- スピンダウン 600 x g、4° c で5分間均質化しました。
- 上清および再懸濁ペレットを、NIM 溶液中の 25% イオジキサノールの1Ml で除去します。
- 4 mL ultracentrifuge チューブ (サンプルが用意されるまで氷の上に保存) に lodixanol の 29% の 1 mL を追加し、試料の1ml を慎重に層に入れます (25% lodixanol)。
- Ultracentrifuge で10分間 9000 x g、4° c で遠心分離します。
- 500μ l の蛍光活性化細胞選別 (FACS) バッファー (リン酸緩衝生理食塩水 [PBS]) 中の上清および再懸濁ペレットを 1 mM EDTA、0.05% アジ化ナトリウム、および 2% ウシ血清アルブミン [BSA] に添加した。
注:サンプルは4° c または1週間まで貯えることができる。 - 室温で5分間の 7-アクチノマイシン D (7-AAD; 50 mg/mL) を5μ l 添加して DNA を染色する。
- フローサイトメトリーを使用して、7つの AAD および緑色蛍光タンパク質 (GFP) シグナルのサンプルを分析します。
5. XistΔの実現性を判断する: Mecp2/Xist: Xi 再活性化のための Mecp2-Gfp マウスモデル
- シード 1 x 105細胞/ML メスXistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp MEFs、 Mecp2/Mecp2 、Xist /Y Mecp2 をステップ3.12 で6ウェルフォーマットおよびチャンバースライドにて、10% FBS および10μ g/mL ペン/MEFs を有する DMEM 中で、37° c で、5% CO2 の存在。
注:Mecp2/Mecp2およびXist-Mecp2/Y MEFs は、実験においてポジティブおよびネガティブコントロールとして使用される。 - 24時間後の細胞に新鮮な培地を追加します。XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2 MEFs には、XCIFs 阻害剤を添加した培地 (例えば、0.5 μ m LDN193189 および2.5 μ m GSK650394)、またはビヒクルのみを添加する。新鮮な阻害剤またはビヒクルを2日毎に単独で補充した培地を交換する。Mecp2/Mecp2およびXist-Mecp2/Y MEFs については、2日ごとに新鮮な培地を追加します。
-
阻害剤治療の1週間後に、RNA 単離 (6 ウェルプレート) または免疫蛍光のための細胞の修正 (チェンバースライド) のいずれかの MEFs を収穫します。Mecp2/Mecp2胚から分離した MEFs は、それぞれ陰性対照としてXist ・ Mecp2/Y胚として使用する。
- RNA 単離のために、グアニジニウムチオシアン酸ベースの RNA 抽出試薬によって全 RNA を単離し、逆転写酵素を用いて逆転写する。測定したMecp2-gfpは、 Mecp2およびMecp2を使用した定量逆転写酵素-Pcr (qRT)、および表 1に記載されているプライマーにより、前述のとおり12.
- 免疫蛍光については、抗 GFP 一次抗体 (1:100) で MEFs を染色し、前述したように12、16.薬物処理XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2 MEFs の定量免疫蛍光による GFP 強度を測定し、前に説明したとおり18。
6. XistΔの脳内の薬理学的 Xi 再活性化を示す: Mecp2/Xist: Mecp2マウスモデル
- 薬物と車両制御を準備します。
- 新鮮な、無菌のビヒクル溶液 (0.9% NaCl、0.5% メチルセルロース、4.5% ジメチルスルホキシド [DMSO]) を脳注射用に調製する。
- 1.5 mM LDN193189 (ACVR1 の低分子阻害剤) および 1.6 mM GSK650394 (SGK1 の低分子阻害剤、PDPK1 の下流エフェクター) を含む化学阻害剤をビヒクルで再懸濁させる (0.9% NaCl、0.5% メチルセルロース、4.5% DMSO)、またはビヒクルだけ。注入される化学阻害剤またはビヒクルの総量は、動物1回あたり10μ l である。
- 脳注射のための動物を準備します。
- ベンチと加熱パッドを消毒剤 (次亜塩素酸ナトリウム溶液) で拭いて外科領域を準備します。
- 麻酔は、それぞれ 140 mg/kg および 10mg/kg の用量でケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射を行う4週齢マウスを投与した。麻酔のレベルを決定するために、ペダル離脱反射を使用してください。
- 角膜乾燥を防ぐために、麻酔の誘導の後で目に眼科用軟膏を塗布してください。
- 首からマウスの頭の上に毛皮を剃ります。
- マウスの切歯歯を鼻の拘束具の咬合バーに引っ掛けることで、マウスの頭部が水平面上にあることを確認しながら、鼻の上にノーズクランプをきつく締めることによって、定位プラットフォームにネズミを配置します。
- 耳のバーの高さを調整し、外耳道の尾部に到達させ、マウスの頭が水平な平面にあり、指のタッチで固定化されるようにそれらを固定する。
- ポビドンヨウ素および 70% エタノールのような局所防腐剤の交互のワイプでマウスの頭部を消毒します。
- 薬を投与する。
- 生殖不能のメスを使用して、中間頭皮の 0.75 cm の横の切り傷を作ってください。
- 0.45 mm のバリを使用して、右と左の皮質半球の上に2つの対称的な穴 (矢状縫合糸から2mm、lambdoid 縫合線から2mm、約頭頂骨の中央) をドリルします。
- 10μ l のシリンジを定位プラットフォームにしっかりと取り付けます。
- 化学阻害剤の溶液を混合し、注射器に10μ l の溶液を引き込む。シリンジ内の気泡を避けてください。
- 針を垂直に維持するバリの穴に注射針を進めます (90 °) 頭蓋骨に.針が頭蓋骨を横断するとき、定位デジタルディスプレイの座標をゼロにし、2.5 mm の深さに達するまで針の先端を進めます。
- 2つの mm のための深さに針0.5 の mm を撤回しなさい。
- 10μ l の溶液 (~ 1 分) をゆっくりと注入します。注射が完了した後、〜1分間脳内の針を残し、その後、針を撤回します。
- 2番目の半球 (車両専用コントロール) の射出を繰り返します。
- 縫合糸また > は「皮膚の接着剤」を使用して、マウスの皮膚を閉じてください (傷が0.5 センチメートルの場合は、縫合糸と「皮膚接着剤」の両方を使用する必要があります)。
- 耳のバーを緩め、定位装置からマウスを取り外します。
- 鎮痛薬を投与します (のブプレノルフィン SR 0.5 mg/kg IP) そして、動物が意識を取り戻すまで、37° c に設定された加熱パッドの上にマウスを置きます.
- マウスが警告と応答性になったら、動物を元のケージに戻します。
- この手順を2日ごとに20日間繰り返します。その後の注射では、この領域の穴あけ加工は必要ありません。
- マウスの脳を分離します。
- 投与レジメンが完了したら、マウスを CO2 室に euthanize。
- 針を使って表面にマウスを固定します。
- はさみと鉗子を使用して、胸郭のすぐ下に外皮と腹壁を通して横切開を行います。慎重に横隔膜から肝臓を分離します。
- はさみを使用して、横隔膜を切って胸郭の全長に沿って切断を続け、胸膜腔を露出させます。
- はさみを使って、左心室の後端まで切開をします。
- すぐに、〜15ミリリットルの PBS で右心室を注入開始 ~ 2 分間の肝臓の色変化を赤から淡いピンクに、良好な灌流を示す。
- マウスの心臓の右の部屋を〜10ml の 4% のパラホルムアルデヒドで約2分間 PBS に注入する。
- マウスを斬るし、はさみを使って頭皮の正中切開を行い、頭蓋骨を露出させます。
- はさみの先端を円孔開マグナムに置き、頭蓋骨に向かって横に切ります。反対側のために繰り返します。脳の損傷を避けるために、はさみの端をできるだけ表面的に保つようにしてください。
- 目とマウスの鼻の上の領域をカットするためにはさみを使用してください。
- 脳半球から頭蓋の骨を優しく剥離するために鉗子を使用してください。
- スパチュラで脳を持ち上げ、はさみを使用して頭蓋骨に固定する脳神経線維を慎重に解剖します。
- プラスチック皿に脳を置き、小脳と嗅球を切り取り、4% PFA で満たされた 15 mL チューブに脳を置きます PBS です。
- クライオセクションマウスの脳.
- 4% のパラホルムアルデヒドで 4% の脳を固定します。
- 4° c で PBS で脳を5分間少なくとも3倍ずつすすいでください。
- ティッシュの cryopreserving のための使い捨て可能な型にラベルを付けなさい。
- はさみと鉗子を使って脳の前部を切り出します (注射部位から 5 mm の切片を作り始めます)。
- 脳の前部を下に向けて cryomold に脳を移し、コロナの部分を得る。脳を含む型を最適な切削温度化合物 (OCT) に沈めます。
- 10 mm のプラスチック製ペトリ皿に液体窒素を注ぎ、脳をクライオモールドに入れて窒素にする。
注:脳の断面を導くためにステップ6.5.5 で説明したように組織を配向させることが重要である。 - OCT が白く点灯したら、凍結した脳を-80 ° c の冷凍庫に入れて保管します。
- 平衡化は、クライオスタットおよび cryosection (5 −6μ m 厚) 脳での断面化の前に、少なくとも30分間脳を-20 ° c にし、スライドあたり2−3セクションを取り付ける。スライドは、後で使用するために-80 ° c で保存することができます。
- 免疫蛍光ベースのアプローチを使用して Xi 再活性化を決定します。
- 染色手順を開始する前に、脳切片を4° c で一晩乾燥させる。
- 、スライドを抗原検索ソリューション (0.1 M、クエン酸、0.1 M トリスベース、pH = 6.0) に100° c のヒートブロックで5分間浸します。
- 室温で5分ごとに 1x PBS でスライド4枚を洗浄します。
- スライドをブロッキング溶液 (0.1 M NH
4CL/PBS/0.2% ゼラチン/0.05% 非イオン性界面活性剤) に浸し、室温で20分間浸漬します。 - 洗浄緩衝液 (PBS/0.2% ゼラチン) を室温でそれぞれ5分間洗浄します。
- 抗 GFP-AlexaFluor647 (1:100) および抗 MAP2 (1: 1000) 培養培地中の抗体 (PBS/0.2% ゼラチン/1% BSA) において脳切片を染色し、4° c で一晩インキュベートします。
- 一次抗体を回収する (再利用可能)。洗浄緩衝液でスライドを4倍にし、室温で合計30分間洗浄します。
- ヤギの抗チキンフルオレセインイソチオシアナート (FITC) 標識された二次抗体で脳切片 (1: 1000) をインキュベートし、暗所で室温で1−2時間インキュベートします。
- 洗浄緩衝液でスライドを4倍にし、室温で合計30分間洗浄します。
- 22 mm x 50 mm のカバースリップに4′、6-diamidino-2-フェニル (DAPI) の取り付け媒体を1滴入れ、その後、すべての組織切片をカバーするスライド上にカバースリップを反転させます。
- 顕微鏡で画像を表示し、コントラストと明るさの画像を調整します。画像を捕捉し、薬物治療およびビヒクル処理 XistΔの両方についての GFP 陽性細胞の数を定量化する: Mecp2/Xist: Mecp2マウス脳半球。
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結果
XistΔの実現可能性を示すために、 Mecp2/Xist: xi 再活性化研究のための Mecp2-gfp マウスモデルは、XCIF 阻害剤を媒介とする xi-結合Mecp2-gfpの再活性化をマウス胚線維芽細胞 (MEFs) で試験した。女性 MEFs は、第3項に記載されているように 15.5 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp胚の日から単離した (図 1a)。女性 XistΔの遺伝子型: Mecp2/Xist: Mecp2 MEFs は、前述したようにジェノタイピング− PCR によって確認された (図 1b)、および FACS ベースのアッセイ (図 1c)。MEFs は、DMSO または2つの薬剤 LDN193189 および GSK650394 (それぞれ0.5 μ m および2.5 μ m) ...
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ディスカッション
以前は、哺乳動物雌細胞において Xi 結合遺伝子のサイレンシングに選択的に必要とされている XCIFs が、12を同定した。さらに、マウス線維芽細胞株、マウス皮質ニューロン、およびヒト線維芽細胞における Xi-結合Mecp2を効率的に再活性化する PDPK1 の ACVR1 や下流エフェクターなど、XCIFs を標的とする強力な低分子阻害剤を最適化しました。RTT の患者から導かれるライン。これらの結果は、Xi の再活性化が X 結合疾患患者の遺伝子欠損を救出するための妥当な治療アプローチであることを示唆している。しかし、in vivo の実現性は決定されたままである。最近、XCIF 阻害剤は、 Mecp2の非ランダムXistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2マウスモデルが生成されたインビボにおいて Xi −結合した発現を再活性化することが示された。
XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfpモデルの魅力的な特徴はいくつかの理由の Xi-リンク...
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開示事項
作者は何も開示することはありません。
謝辞
著者は、試薬を提供するためのアントニオ・ Bedalov に感謝します。バージニア大学 cryosectioning の組織体のコアバージニア大学フローサイトメトリーはフローサイトメトリー分析のコアです。キリスト教の青とジェノタイピングの技術支援のための Saloni シン。この作品は、Z.Z. へのダブルフー研究助成金によってサポートされていました, そして、バージニア大学-バージニア工科種子基金賞とハートウェル財団個々のバイオメディカル研究賞を S.B. にパイロットプロジェクトプログラム賞を受賞しました
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | ジャクソン研究所 | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | 提供:Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| 試薬 | |||
| mm カバースリップ | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡 Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm培養皿 | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| 塩化アンモニウム (NH4Cl) | フィッシャーケミカル | A661-3 | |
| 抗GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| 抗MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| ブプレノルフィン SR | Zoopharm | ||
| クエン酸 | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | フィッシャー バイオ試薬 | BP231-100 | |
| ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| エタノール | Decon Labs | 2701 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | VWR ライフサイエンス | 89510-198 | |
| ゼラチン | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| スライドガラス | Fisherbrand22-034-486 | ||
| ヤギ抗鶏FITC標識二次抗体 | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| ハミルトン10μl シリンジ | ハミルトン シグマ-アルドリッチ | 28615-U | |
| ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| ケタミン | ケタセット | NDC 0856-2013-01 | |
| 大型鈍器/鈍い湾曲ハサミ | ファイン サイエンス ツール | 14519-14 | |
| LDN193189 | ケイマン ケミカルズ | 11802 | |
| ロジキサノール | シグマ | ||
| 1343517塩化マグネシウム(MgCl2) | フィッシャーケミカル | M35-212 | |
| メチルセルロース | シグマ | M0262-100G | |
| 封入剤、DAPI | ベクタシールド | H-1200 | |
| ニードルチップ付き、26 GA x 1.25 " | PrecisionGlide | 305111 | |
| 眼科軟膏 | リフレッシュラクリルーブ | 93468 | |
| 最適な切断温度(O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| ペニシリン/ストレプトマイシン (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| 塩化カリウム (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| メスブレード | |||
| 浅いガラスまたはプラスチックトレイ | |||
| の皮膚接着剤/組織接着剤 | 3M Vetbond | 1469SB | |
| アジ化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | CAS 26628-22-8 | |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | フィッシャーケミカル | S642-212 | |
| 標準止血鉗子 | ファインサイエンスツール | 13013-14 | |
| 標準ピンセット | ファインサイエンスツール | 11027-12 | |
| ストレートアイリスハサミ | ファインサイエンスツール | 14058-11 | |
| ショ糖 | フィッシャーサイエンティフィック | BP220-1 | |
| ベース | フィッシャーバイオ試薬 | BP152-5 | |
| トンX-100 | ッシャーバイオ試薬 | BP151-500 | |
| プシンEDTA | ギブコ | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| 機器 | |||
| Zeiss AxioObserver ライブセル顕微鏡 | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm バリ | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| 遠心分離 | |||
| 機ガラスホモジナイザー | |||
| 細胞培養インキュベーター | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i 13-998-213 | ||
| Leica 3050S research cryostat | |||
| 定位プラットフォーム | |||
| サーモサイクラー | |||
| タイマー | |||
| 超遠心分離機 | ベックマン・コールター オプティマ L-100 XP | ||
| ウォーターバス(37ºC) | フィッシャーサイエンティフィックアイソテンプ2239 |
参考文献
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
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