方法論記事

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

DOI：

10.3791/59452

⸱

2019年7月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Cardiovascular Diseases, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Cardiac Surgery, The Second Xiangya Hospital of Central South University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、ヒト誘導多能性幹細胞を心筋細胞の分化および精製に使用する方法をデモンストレーションし、さらに、Rho関連タンパク質キナーゼ阻害剤による移植効率を改善する方法について説明します。マウス心筋梗塞モデルにおける前処理。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心筋再生の細胞療法の有効性を改善する上で重要な要因は、安全かつ効率的に細胞の生着率を高めることです。Y-27632は、Rho-関連のコイルコイル含有タンパク質キナーゼ(RhoA/ROCK)の非常に強力な阻害剤であり、解離誘発性細胞アポトーシス(アノイキス)を防ぐために使用されます。移植前にヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM+RI)に対するY-27632前処理が、急性心筋梗塞(MI)のマウスモデルにおける細胞移植率の向上をもたらすことを実証する。ここでは、Y-27632によるhiPSC-PM分化、精製、細胞前処理の完全な手順と、得られた細胞収縮、カルシウム過渡測定、マウスMIモデルへの移植について説明する。提案された方法は、細胞の生着率を大幅に増加させるシンプルで安全で効果的で低コストの方法を提供します。この方法は、細胞移植効率をさらに高めるために他の方法と組み合わせて使用するだけでなく、他の心臓疾患のメカニズムの研究のための有利な基礎を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

幹細胞ベースの治療法は、MI1によって引き起こされる心臓損傷の治療薬としてかなりの可能性を示している。差別化されたhiPSCの使用はhiPSC-CM2の無尽蔵の源を提供し、画期的な処置の急速な発展のためのドアを開く。しかしながら、移植細胞の移植率が著しく低い課題を含む治療翻訳には多くの制限が残っている。

トリプシンとの解離細胞は、低酸素環境が細胞死に向かう過程を加速する虚血性心筋のような過酷な環境に注入された後にのみ加速されるアノイキス3を開始する。残りの細胞のうち、大部分は移植部位から血流に洗い流され、周辺に広がる。主要なアポトーシス経路の1つは、RhoA/ROCK経路4です。以前の研究に基づいて、RhoA/ROCK経路は、細胞機能障害7、8を担当するアクチン細胞骨格組織5、6を調節する。ROCK阻害剤Y-27632は、体細胞および幹細胞の解離および通過時に広く使用され、細胞接着性を高め、細胞アポトーシス9、10、11を減少させる。本研究では、Y-27632は移植前のhiPSC-CMを治療し、細胞生着率を高めるために用いられる。

ヒートショックや基体膜マトリックスコーティング12など、細胞生着速度の向上を目的としたいくつかの方法が確立されている。これらの方法とは別に、遺伝技術はまた、心筋細胞増殖13を促進するか、または心筋細胞14に非筋細胞を逆転させることができる。バイオエンジニアリングの観点から、心筋細胞は、移植効率を向上させるために生体材料足場に播種される15.残念ながら、これらの方法の大半は複雑でコストがかかります。それどころか、ここで提案される方法は、シンプルで費用対効果が高く、効果的であり、移植前の基礎治療や他の技術との結合としても使用できます。

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プロトコル

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この研究のすべての動物の手順は、バーミンガムのアラバマ大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所動物ケアおよび使用ガイドライン(NIH出版No.)に基づいていました。85-23)。

1. 培養メディア・文化プレートの作成

  1. 中程度の準備
    1. hiPSC培地の場合は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)基底培地(材料表1)の400mLと100mLのhPSC 5xサプリメントを混合する。混合物を4°Cに保存します。
    2. RPMI 1640/B27マイナスインスリン(RB-)培地の場合は、RPMI 1640の500 mLとB27サプリメントマイナスインスリンの10mLを混合する。
    3. RPMI 1640/B27(RB+)培地の場合は、RPMI 1640の500 mL、B27サプリメントの10mL、ペニシリン連鎖マイシン(ペンストレップ)抗生物質の5mLを混合します。
    4. 精製培地16の場合、無グルコースRPMI 1640の500mL、B27サプリメントの10mL、ペンストレップ抗生物質の5mL、および1,000 μLのDL-乳酸ナトリウム溶液(4mMの最終濃度で)を混合する。
    5. 中和液の場合は、RPMI 1640の200mL、胎児ウシ血清(FBS)の50mL、ペンストレップ抗生物質の2.5mL、およびY-27632の50 μL(最終濃度10μM)を混合する。
    6. 凍結培地の場合は、FBSの9mL、ジメチルスルホキシド(DMSO)の1mL、およびY-27632の10 μL(最終濃度10μM)を混合します。
    7. 細胞外マトリックス溶液(EMS)の場合、均一に一貫した液体状態になるまで4°Cで濃縮細胞外マトリックス(材料表1)を解凍する。350 μLのマトリックスアリコートを氷の上に作る前にピペットの先端とチューブをあらかじめ冷却し、アリコートを-20°Cに保存します。プレートをコーティングする前に、1つの解凍されたアリコートを24 mLの氷冷DMEM/F12培地(EMS)に希釈します。EMSを4°Cで最大2週間保持します。
      注:基体膜マトリックスの固化を防ぐために、氷上のすべてのコーティングステップを実行します。
    8. Tyrodeの溶液の場合は、組織培養等級水の最終的な必要量の90%を取り、以下の試薬の適切な量を加え、溶解するまで攪拌する。次に、1 N NaOH を使用して pH を 7.4 に調整します。塩化ナトリウム140mmol/Lナトリウム、塩化1mmol/Lマグネシウム、10mmol/L HEPES、塩化カリウム5mmol/Lカリウム、10mmol/Lグルコース、1.8mmol/L塩化カルシウムの最終濃度に余分な水を加えます。0.22 μmの膜を用いて濾過により殺菌する。
  2. 細胞培養プレートコーティング
    1. hiPSC培養プレートの場合は、6ウェルプレートの各ウェルにEMSの1 mLを適用し、37°Cで少なくとも1時間プレートをインキュベートします。細胞を播種する前にDMEM/F12溶液を吸引する。
    2. ゼラチンコーティングの場合は、0.2gのゼラチン粉末を組織培養グレードの水に溶解し、0.2%(w/v)溶液を作ります。121 °C、15 psiで30分間オートクレーブで殺菌し、溶液の2 mLで6ウェルプレートの各ウェルを塗り、37°Cで1時間インキュベートします。細胞を通過させる前に、溶液を吸引し、組織培養フード内の室温で少なくとも1時間乾燥させておきます。

2. hiPSC維持と心筋細胞の分化

  1. hiPSC培地でhiPSCを培養し(ステップ1.1.1参照)、細胞がウェル当たり80%~90%の合流点に達するまで毎日の培地変化を伴います。
    注:メンテナンスのために、hiPSCは一般的に4日ごとに通過する準備ができています。
  2. hiPSCを通過するには、培地を吸引し、1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でウェル1xを洗浄します。幹細胞剥離液(材料1)の0.5mLを各ウェルに加え、37°Cで5~7分間インキュベートします。
    注:インキュベーション時間は、細胞の密度と解離速度に依存し、顕微鏡下で観察することができます。
  3. 5 μM Y-27632を補充したhiPSC培地の1mLで幹細胞剥離溶液を中和する。15 mL遠心管で混合物を収集します。チューブを200xgで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を吸引し、次いで、5μM Y-27632を含むhiPSC培地の1mLで細胞を再中断する。
  4. 1:6から1:18の比率で新しいEMSコーティングされた6ウェルプレートにhiPSCをシードします。24 時間後に Y27632 を使用せずに培地を hiPSC メディアに変更します。
  5. 細胞を凍結させるには、凍結培地で解離したhiPSCを0.5〜100万/500 μLの濃度で再懸濁し、懸濁液を凍結液に入れ、-80°Cの冷凍庫に保管する。冷凍バイアルを24時間後に液体窒素に移す。
  6. 分化するには、hiPSC培地を80%~90%の細胞合流で10μM GSK-3β阻害剤CHIR99021(CHIR)で補充したRB-培地の2mLで置き換えます。24時間後にRB-培地の3 mLで培地を交換し、さらに48時間(3日目)インキュベートします。
  7. 3日目に、10 μM Wnt阻害剤IWR1を48時間(5日目)でRB-培地の3mLに変更し、その後、培地を3mLのRB-培地に置き換え、48時間(7日目)維持する。
  8. 7日目に、培地をRB培地の3mLに交換し、今後3日ごとに培地を交換する。hiPSC-Cの自発的な拍動は7日目から10日目の間に観察されるべきである。

3. hiPSC-MS精製と低分子前処理

注:高精製、組換え細胞解離酵素(材料表1)を用いてhiPSC-COMを解離した。

  1. hiPSC-CM分化後の21日目に、培地を吸引し、無菌PBSで細胞1xを洗浄する。37°Cで5〜7分間、ウェル当たり0.5mLの細胞解離酵素で細胞をインキュベートします。細胞を完全に解離するために、1 mLピペットを使用して細胞懸濁液を繰り返しピペットする。
  2. 細胞を解離した後、各ウェルに1mLの中和溶液を加え、15mL遠心管と遠心分離機に200×gで3分間細胞混合物を集動させる。
  3. 細胞をゼラチンコーティングされた6ウェルプレートに再植え付けし、ウェル当たり200万個の密度で再生します。
  4. 24~48時間後、培地を精製培地に置き換え、3~5日間使用します。
    注:各顕微鏡視野の細胞の90%以上が打っている場合、精製は完了します。心筋細胞へのさらなる損傷を防ぐために、5日を超えて精製期間を延長しないでください。最初のラウンドが必要な純度を得ない場合は、1日間RB+培地で精製媒体を交換し、その後、精製の第2ラウンドを完了します。
  5. 移植前に、10 μM Y-27632を補充したRB+培地で12時間の治療群の細胞を培養した。同様に、1μMベラパミルを12時間(hiPSC-PM+VER)でRB+培地中の細胞に対してベラパミル処理を行う。
  6. 治療後、HIPSC-SIM 1xをPBSで洗浄し、0.5mLの細胞解離酵素をウェル当たり最大2分間インキュベートし、1mLピペットを使用して細胞懸濁液を繰り返しピペットし、細胞を完全に解離します。中和液で細胞を中和し、15mL遠心管で細胞混合物を集め、200 x gで3分間遠心分離機を3分間、注入に備えて010万細胞/5μLの濃度でPBS内の細胞を再中断する。

4. 心筋梗塞と細胞移植

注:すべての外科器械はオートクレーブによって前殺菌され、熱いビーズの殺菌器を通して複数の外科の間に無菌状態で維持される(材料の表2)。

  1. 吸入イソファラン(1.5%~2%)でNOD/scidマウス(材料表2)を麻酔する。つま先のピンチに対するマウスの反応によって麻酔レベルを監視する。手術中に乾燥するのを防ぐために、獣医の光学系を目の上に置きます。
  2. 手術前の疼痛管理のために0.1 mg/kgのブプレノルフィンを皮下に供給する。
  3. 加熱された手術台の上の上の上の上の上の上の上の上の上の上の上の上の上の上の位置でマウスを固定し、脱毛クリームを使用して腹部の首の領域および左胸部から毛を取り除き、皮膚を露出させ、70%のアルコールでそれを消毒する。
  4. 外科用はさみを使用して首の中心に0.5cmの切開を切り、皮下脂肪を滅菌鉗子で分離し、気管を露出させる。挿管カニューレを気管に経口的に導入し、カニューレを小動物の人工呼吸器に接続し、換気設定を調整します(潮位を100~150μLに設定し、呼吸量を100x~150x/分に設定します)。
  5. マウスが安定した後、左胸の皮膚の中央に0.5cmの切開を切り取ります。鉗子を使用して筋肉層を鈍く分離し、胸腔を露出させるために5番目の肋間空間で小さな切開を行います。切開部にリトラクタを配置して胸腔を開き、左下下冠動脈(LAD)を見つけます。解剖外科顕微鏡の下で、8-0とLADをリゲートする非吸収性縫合糸。
  6. MI誘導の直後に、5 μLのhiPSC-CM-RI、hiPSC-CM-VER、hiPSC-CM+VER、または各部位のマウスの心筋に同量のPBSを注入する(3 x 105細胞/動物、1 x 105)細胞/部位)、梗塞領域に1つ、梗塞周辺に2つ。
    注:5μLは非常に小さい容積であるため、注射器で直接吸引して体積を正確に制御することは容易ではない。滅菌ペトリ皿のふたをひっくり返し、5 μLの細胞を最初にピペットでふたに堆積させることができる。表面張力のために、それは広がりませんが、小さな液体塊に凝縮します。これは容易に吸収され、マウスの心筋に注入することができる。
  7. 暖かい等方性生理洞溶液でそれを満たすことによって胸腔の残留空気を除去する。6-0吸収性縫合糸で肋骨、筋肉、皮膚を順番に縫い合わせる。イオフラン麻酔注射をオフにします。手術動物を暖房パッドの上に置き、完全な意識を取り戻しながら注意深く観察してください。その後、きれいなケージに動物を置きます。完全に回復するまで、他の動物の会社に動物を返さないようにしてください。
  8. 手術後、マウスにブプレノルフィン(0.1mg/kg)を3日間連続で12時間ごとに注射し、1日12時間ごとにイブプロフェン(5mg/kg)を注射する。指定した時点で後続の解析スタディを実行します。
    注:鎮鎮薬に関する地元の動物管理委員会のガイドラインに従ってください。

5. カルシウム過渡性および収縮性記録

  1. オートクレーブ15ミリメートル直径カバースリップ(材料2の表)と121 °Cで小さなガラスビーカーでピンセット、15分間15 psi. カバースリップとピンセットを4°Cで予め冷却します。
  2. ピンセットを使用して、カバースリップを12ウェルプレートに入れ、各カバースリップに細胞外マトリックスのピペット300 μLを配置します。
    注:マトリックスのコーティング量を減らさないよう、マトリックスがカバースリップの端を超えないようにしてください。12ウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターで1時間インキュベートします。
  3. 精製されたhiPSC-COMを使用したゼラチンコーティングされた6ウェルプレートに培地を吸引し、PBSで1倍洗い、0.5mLの細胞解離酵素で1.5分の細胞解離酵素で消化します。200 x gで3分間遠心分離します。
  4. カバースリップからコーティングされた細胞外マトリックスを吸引します。細胞数を数え、中和溶液中球を40,000/300 μLの濃度に再懸濁し、各カバースリップに300μLの細胞懸濁液を加えます。プレートを37°Cインキュベーターで培養する。
  5. 24h後、中和溶液を穏やかに吸引し、プレートの各ウェルにRB+培地の500μLを加え、2日間培養を続ける。
  6. Y-27632(10 μM)、Rhoキナーゼ活性化剤(RA、100 nM)、ベラパミル(1μM)、または同量のPBSをhiPSC-PMの培養培地に加え、カルシウム過渡および収縮性検出の前に12時間。
    注:化学処理の12時間後に細胞の一過性および収縮性の検出に加えて、これらのパラメータの検出は、化学的撤退後の12、24、48、および72時間でテストされた。
  7. プレートを取り出し、中程度を捨て、PBSでプレートを1x洗います。界面活性剤ポリオール(材料1)、5μMカルシウムインジケータ(材料1)、対応するY-27632(10μM)、RA(100nM)、ベラパミル(1μM)、または等しい体積を含むフェノール赤色フリーDMEMに媒体を変更します。PBSの、37°Cで30分間プレートをインキュベートします。
  8. 上清を廃棄し、無染料DMEM培地で細胞を3倍に洗浄し、培地を30分間休止させてマッピング色素を脱エステル化する。
  9. 細胞種子カバースリップをオープンバス室に置き、自動温度コントローラ(材料2の表)で37°Cに平衡化されたマイクロインキュベーションシステムにチャンバを挿入し、Tyrodeの溶液と一緒に浸透し、継続的に追加します。ローキナーゼ阻害剤(RI)、RA、またはPBSを灌流液に対する。
  10. 逆蛍光顕微鏡(材料表2)とレーザー走査ヘッド(材料表2)を使用して、染料励起用の488nmアルゴンレーザーと515±10nmを使用して、X-tラインスキャンを使用して一過性の自発的なカルシウムを記録します。発光光を収集するためのバリアフィルター。共焦点顕微鏡の差動干渉コントラスト機能を使用してhiPSC-COMの自発的な収縮を記録する(材料2)。
    注:カルシウム過渡記録は、MATLAB R2016Aソフトウェア(材料4の表)を用いて処理および分析された。細胞収縮変化アッセイは、ImageJソフトウェア(材料4の表)を用いて行った。

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結果

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この研究で使用されるhiPSC-PMは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つヒト起源に由来した。従って、生体内移植細胞の生存率は、生物発光イメージング(BLI)17(図1A、B)により検出した。組織学的心臓切片については、ヒト特異的心臓トロポニンT(hcTnT)およびヒト核抗原(HNA)二重陽性細胞を生着生hiPSC-COM(図1C)に分類した。いずれの結果も、Y-27632前処理が細胞生着速度を有意に改善したことを示した。hiPSC-CM+RI群のルシフェラーゼ活性は、移植後の3日目、7日目、及び28日目に約6倍増加し、hiPSC-CM-RI群の活性と比較して増加した(図1B)。また、hcTnT/HNA発現はhiPSC-CM+RI群において7倍近く...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究の主なステップは、純粋なhiPSC-PMの取得、Y-27632前処理によるhiPSC-PMの活性の向上、そして最後に、正確な量のhiPSC-PMをマウスMIモデルに移植することである。

ここで取り上げられた主な問題は、まず、グルコースフリー精製方法19を最適化し、新規の効率的な精製システムを確立したことです。システム手順には、細胞解離酵素の適用、ゼラチンコーティングプレートでの細胞の再植え付け、再平色後の24時間の中和培地で細胞を培養し、移植前の細胞の消化時間を最小限に抑えることなどが含まれていました。そのうちの純粋な心筋細胞を得ながら細胞の最高活性を達成するために行われた。

第二に、細胞注入前12時間にY-27632を使用したhiPSC-PMの前処理について詳しく説明した。アノイキスは、通常、インテグリン4、20およびN-カドヘ

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、Fluc-GFPコンストラクトを親切に提供してくれたジョセフ・C・ウー博士(スタンフォード大学)とヤンウェン・リウ博士に優れた技術支援を提供してくれたことに感謝しています。この研究は、米国国立衛生研究所RO1助成金HL95077、HL114120、HL131017、HL138023、UO1 HL134764(J.Z.)、およびHL121206A1(L.Z.)、およびR56助成金HL142627(米国科学者への)によってサポートされています。16SDG30410018、およびバーミンガム教員開発助成金(W.Z.)のアラバマ大学。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagent
Accutase(幹細胞剥離液)STEMCELL Technologies#07920
B27マイナスインスリンフィッシャーサイエンティフィックA1895601
B27サプリメントフィッシャーサイエンティフィック17-504-044
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
DMEM (1x)、高グルコース、HEPES、フェノール不レッド サーモフィッシャー20163029
ウシ胎児血清Atlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM (カルシウムインジケーター)Invitrogen/ThermofisherF14201
グルコースフリー RPMI 1640Fisher Scientific11879020
IWR1Stem Cell Technologies72562
マトリゲル(細胞外マトリックス)フィッシャーサイエンティフィックCB-40230C
mTeSR(ヒト多能性幹細胞培地)STEMCELL Technologies85850
連鎖球菌ペン連鎖球菌抗生物質フィッシャーサイエンティフィック15-140-122
プルロニックF-127(界面活性剤ポリオール)シグマ・アルドリッチP2443
Rho活性化剤II細胞骨格CN03
RPMI1640Fisher Scientific11875119
Sodium DL-lactateSigma-AldrichL4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes)Fisher Scientific12-605-010
VerapamilSigma-AldrichV4629
Y-27632STEMCELL Technologies72304
名前会社カタログ番号コメント
機器および消耗品
IVIS Lumina III 生物発光機器PerkinElmerCLS136334
15 mm カバースリップワーナーCS-15R15
遠心分離機エッペンドルフ5415R
共焦点顕微鏡オリンパスIX81
クライオスタットサーモサイエンティフィックNX50
デュアル自動温度コントローラーワーナーインスツルメンツTC-344B
電気泳動 電源BIO-RAD1645050
蛍光顕微鏡オリンパスIX83
ハイスピードカメラpco1200 s
レーザースキャンヘッドオリンパスFV-1000
ロープロファイルオープンバスチャンバー (上記のマイクロインキュベーションシステムに取り付け)ワーナーインスツルメンツRC-42LP
マイクロインキュベーションシステムワーナーインスツルメンツDH-40iL
ミニベントマウスベンチレーターハーバード装置845
NOD/SCIDマウスジャクソン研究所001303
プレキャストタンパク質ゲルBIO-RAD4561033
PVDF トランスファーパックBIO-RAD1704156
トランスブロットシステムBIO-RADトランスブロットターボ
ホットビーズ滅菌器ファインサイエンスツール18000-45
名前<strong>会社カタログ番号コメント
抗体
抗ヒトヌクレオリン(Alexa Fluor 647)Abcamab198580
Cardiac Troponin TR&D SystemsMAB1874
Cardiac Troponin CAbcamab137130
Cardiac Troponin IAbcamab47003
Cy5-ロバ 抗マウスジャクソン免疫研究所715-175-150
Cy3-ロバ 抗ウサギジャクソン免疫研究所711-165-152
Fitc-ロバ 抗マウスジャクソン免疫研究所715-095-150
GAPDHAbcamab22555
ヒト心臓トロポニン TAbcam ab91605
インテグリン & ベータ;1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-cadherinAbcam ab18203
リン酸化ミオシン軽鎖 2細胞シグナル伝達技術3671s
NameCompanyカタログ番号コメント
Software
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g
使用

参考文献

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Rho Y 27632

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