ショウジョウバエメラノガスターにおけるクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイ

ミトコンドリアは、トリカルボン酸サイクル(すなわち、クレブスサイクル)および酸化リン酸化を介してエネルギー通貨ATPを生成するほとんどの真核生物における発電性オルガネラとして最もよく知られています。ミトコンドリアはまた、アポトーシス^1、Ca2+恒常性^2、3、反応性酸化種(ROS)生成^4、および小胞体(ER)ストレス応答⁵の調節など、他の多くの生理学的過程において重要な役割を果たすることが判明している。ミトコンドリア機能障害は、任意の年齢で体内の任意の臓器に影響を与えることができるし、代謝、老化関連^6、および神経変性疾患の主な原因である^7。無傷のミトコンドリアは、ミトコンドリア機能に機械的に関連しています。従って、ミトコンドリア質量の適切な定量は、ミトコンドリア機能⁸を評価するために非常に重要である。クエン酸シンターゼは、トリカルボン酸サイクル9の第¹工程における速度制限酵素であり、真核細胞内のミトコンドリアマトリックスに局在し、従って無傷のミトコンドリア質量^9、10の存在のための定量マーカーとして使用することができる。クエン酸シンターゼ活性は、無傷のミトコンドリアタンパク質^11、12の正規化因子としても使用することができる。

フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターは、ミトコンドリアで重要な役割を果たす多くの分子および経路がショウジョウバエからヒト^13、14、15に進化的に保存されているので、ミトコンドリア機能を研究するための優れたモデルシステムである。ここでは、ショウジョウバエ組織中の比色アッセイによるクエン酸シンターゼ活性を96ウェルプレート^形式で均質化するクエン酸シンターゼ活性を測定するための迅速かつ簡単な方法のためのプロトコルを提示する。クエン酸シンターゼ活性アッセイにおいて、ショウジョウバエ組織中のクエン酸シンターゼは、アセチル補酵素A(アセチルCoA)とオキサロ酢酸塩の反応を触媒し、クエン酸CoA-SHおよび^H+を形成する。CoA-SHはその後、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)と反応して着色物を生成し、2-ニトロ-5-チオ安息香酸塩(TNB)を生成し、412nmで分光法で容易に測定することができる。クエン酸シンターゼ活性は、色の生産速度によって反映することができる。

1. D.メラノガスターの比色クエン酸シンターゼ活性アッセイ¹⁶

1. サンプルごとに10匹の大人のハエを収集します。各遺伝子型の少なくとも三重のサンプルを収集します。
2. 20 mM HEPES (pH = 7.2)、1 mM EDTA、および 0.1% トリトン X-100 を含む氷冷抽出バッファーを 1 サンプルごとに 1.5 mL 試験管に用意します。
3. 麻酔パッド上の_CO2で成人のハエを麻酔し、所望の組織を分離する。例えば、大人のフライ・トラックスを隔離するには、ハエの胸部を鉗子で固定し、はさみを使って胸部と腹部の境界に沿って切断してハエの腹部を隔離する。筋肉クエン酸シンターゼ活性アッセイのためのフライタラキックスを収集します。
   注:クエン酸シンターゼ活性を正規化するためにそれを使用する場合は、このステップで組織の新鮮な重量を決定します。
4. 10人の大人のフライ・トラクセンクスを直ちに100°Lの氷冷抽出バッファーに移し、氷上の害虫と均質化する。サンプルを氷冷状態に保つには、氷上で5~10sのサンプルを均質化し、サンプルを氷の上に5s置き、チューブ内のすべての組織が完全に均質化されるまで繰り返します。
   注:チューブをテープでテープに入れ、ホモジネテをチェックして、ホモジネテに血塊がないこと、チューブ内の組織が完全に均質化されていることを確認します。すべてのサンプル処理は氷上で行う必要があります。
5. タンパク質含有量測定用の新しいチューブで、各均質化サンプルの10μLを取ります。タンパク質測定用のサンプルを氷の上に保管してください。
   注:タンパク質サンプルを凍結し、後で分析するために-80°Cで保存することができます。タンパク質濃度は、クエン酸シンターゼ活性の正常化のための内部パラメータとして機能する。
6. 残りの各サンプルに400μLの氷冷抽出バッファーを加えて、合計体積を500°Lにします。反応ごとに、調製した反応液の150μL(20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1 mM DTNB、0.3 mMアセチルCoA、1mMオキサロ酢酸)に希釈された細胞溶解物を1μL添加します。気泡の形成を避け、穏やかにピペットで徹底的かつ直ちに混合します。10sの最小間隔で412 nmで吸光度を測定できるプレートリーダーを使用して、25°Cで4分間40〜30s毎に412 nmで吸光度を測定します。
   注:別の試薬を配管する前に先端を変更し、井戸に気泡を形成しないようにしてください。試薬の不完全な混合は、測定にばらつきを引き起こす可能性があります。クエン酸シンターゼ活性アッセイは、サンプルが採取された直後に室温で行う必要があります。反応バッファーは、使用の直前に準備する必要があり、保存しないでください。
7. 光学密度(OD)吸光度(abs)(Y軸)対時間(分)(X軸)としてデータをプロットします。次に、反応速度が
   
   
   
   サンプルタンパク質濃度で値を割り、クエン酸シンターゼ活性を正規化する。クエン酸シンターゼ活性は、
   
   
   
   注:サンプルタンパク質濃度は、タンパク質濃度アッセイキットにより測定することができる。

図1は、クエン酸シンターゼ活性比色アッセイを用いて得られた412nmにおけるOD吸光度に対する運動曲線の一例を示し、異なる遺伝子型のショウジョウバエ胸郭組織ホモジナートを測定する。PGC-1αがミトコンドリア生形成の主レギュレータであることはよく知られている。PGC-1αはショウジョウバアラとヒトの間で機能的に保存されています。ショウジョウバアラRNF34(dRNF34)は、ショウジョウバエPGC-1α、dPGC-1に対するE3ユビキチンリガーゼであり、dPGC−1タンパク質分解を促進する。透過型電子顕微鏡およびミトコンドリアDNA qPCRは、ショウジョウバエ筋におけるdRNF34のノックダウンがミトコンドリア含有量を増加させ、dPGC-117のノックダウンによって抑制されることを示している。これらの結果に基づいて、ショウジョウバエ筋におけるdRNF34のノックダウンは、dPGC-1のノックダウンによって逆転するはずのミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を増加させるという仮説を立てた。実際、ここで説明するクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイを用いて、ショウジョウバエ筋におけるdRNF34のノックダウンは、dPGC-1のノックダウンによって逆転したミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を増加させることを発見した。具体的には、ここで説明する方法を用いて、アッセイごとに初期線形酵素速度が確立された(図1)。その式と決定係数(R2)を含む傾向線がグラフに示されています(図1)。トレンドラインの傾きは、異なる遺伝子型の最大クエン酸シンターゼ活性に相当する最大反応速度を表します。異なる遺伝子型の傾きは異なります(図1)。決定係数は 1 に近くなります。傾向線の数式の方が信頼性が高くなります。異なる遺伝子型のプロテノ化最大クエン酸シンターゼ活性をプロマル化したタンパク質濃度を図1データから算出した(図2)。筋肉特異的dRNF34ノックダウンを伴うフライトラックスの最大クエン酸シンターゼ活性が増加し、これは筋肉特異的なdPGC-1ノックダウンによって逆転した(図2)。

図1:クエン酸シンターゼ活性の比色アッセイの運動曲線の例。成人フライトラックスホモジナート(a)24B-Gal4>+ ( b ) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), (c) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), dPGC-1RNAiをクエン酸シンハス活性の比色アッセイを行った。水平軸は反応時間を表し、垂直軸は 412 nm の OD 吸収性を表します。遺伝子型ごとに線形酵素速度が確立された。傾向線が描画され、傾向線の数式と R2がグラフに表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:運動曲線から算出され、タンパク質濃度によって正規化された最大クエン酸シンターゼ活性。筋肉特異的dRNF34ノックダウンを伴うフライトラックスの最大クエン酸シンターゼ活性が増加し、筋肉特異的なdPGC-1ノックダウンによって逆転した。すべてのデータは、平均 ± SEM (*p < 0.01、ANOVA 検定、および複数比較の Tukey の検定 、 n = 3、 10 トーラックス)として表されます。この図はWeiら17から改変されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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