ショウジョウバエ組織ホモジネテスにおける無傷のミトコンドリア塊を定量するためのクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイのためのプロトコルを提示する。
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方法論記事
ショウジョウバエメラノガスターにおけるクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイ
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ミトコンドリアは、酸化リン酸化を通じてATPを産生し、様々な生理学的プロセスを調節することにより、細胞代謝において最も顕著な役割を果たしています。ミトコンドリア機能不全は、多くの代謝および神経変性疾患の主な原因である。無傷のミトコンドリアは、その適切な機能のために重要です.クエン酸酵素シンターゼはミトコンドリアマトリックスに局在しているため、無傷のミトコンドリア塊の定量酵素マーカーとして使用することができます。ミトコンドリアで重要な機能を持つ多くの分子や経路がヒトとショウジョウバレの間で高度に保存されており、ショウジョウバアラで強力な遺伝的ツールの配列が利用可能であることを考えると、ショウジョウバヤはミトコンドリア機能を研究するための良いモデルシステムとして機能します。ここでは、ミトコンドリアを単離することなく、成体ハエ由来の組織ホモジネートにおけるクエン酸シンターゼ活性を迅速かつ簡単に測定するためのプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、幼虫、培養細胞、および哺乳動物組織におけるクエン酸シンターゼ活性を測定するのに適している。
概要
ミトコンドリアは、トリカルボン酸サイクル(すなわち、クレブスサイクル)および酸化リン酸化を介してエネルギー通貨ATPを生成するほとんどの真核生物における発電性オルガネラとして最もよく知られています。ミトコンドリアはまた、アポトーシス1、Ca2+恒常性2、3、反応性酸化種(ROS)生成4、および小胞体(ER)ストレス応答5の調節など、他の多くの生理学的過程において重要な役割を果たすることが判明している。ミトコンドリア機能障害は、任意の年齢で体内の任意の臓器に影響を与えることができるし、代謝、老化関連6、および神経変性疾患の主な原因である7。無傷のミトコンドリアは、ミトコンドリア機能に機械的に関連しています。従って、ミトコンドリア質量の適切な定量は、ミトコンドリア機能8を評価するために非常に重要である。クエン酸シンターゼは、トリカルボン酸サイクル9の第1工程における速度制限酵素であり、真核細胞内のミトコンドリアマトリックスに局在し、従って無傷のミトコンドリア質量9、10の存在のための定量マーカーとして使用することができる。クエン酸シンターゼ活性は、無傷のミトコンドリアタンパク質11、12の正規化因子としても使用することができる。
フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターは、ミトコンドリアで重要な役割を果たす多くの分子および経路がショウジョウバエからヒト13、14、15に進化的に保存されているので、ミトコンドリア機能を研究するための優れたモデルシステムである。ここでは、ショウジョウバエ組織中の比色アッセイによるクエン酸シンターゼ活性を96ウェルプレート形式で均質化するクエン酸シンターゼ活性を測定するための迅速かつ簡単な方法のためのプロトコルを提示する。クエン酸シンターゼ活性アッセイにおいて、ショウジョウバエ組織中のクエン酸シンターゼは、アセチル補酵素A(アセチルCoA)とオキサロ酢酸塩の反応を触媒し、クエン酸CoA-SHおよびH+を形成する。CoA-SHはその後、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)と反応して着色物を生成し、2-ニトロ-5-チオ安息香酸塩(TNB)を生成し、412nmで分光法で容易に測定することができる。クエン酸シンターゼ活性は、色の生産速度によって反映することができる。
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プロトコル
1. D.メラノガスターの比色クエン酸シンターゼ活性アッセイ16
- サンプルごとに10匹の大人のハエを収集します。各遺伝子型の少なくとも三重のサンプルを収集します。
- 20 mM HEPES (pH = 7.2)、1 mM EDTA、および 0.1% トリトン X-100 を含む氷冷抽出バッファーを 1 サンプルごとに 1.5 mL 試験管に用意します。
- 麻酔パッド上のCO2で成人のハエを麻酔し、所望の組織を分離する。例えば、大人のフライ・トラックスを隔離するには、ハエの胸部を鉗子で固定し、はさみを使って胸部と腹部の境界に沿って切断してハエの腹部を隔離する。筋肉クエン酸シンターゼ活性アッセイのためのフライタラキックスを収集します。
注:クエン酸シンターゼ活性を正規化するためにそれを使用する場合は、このステップで組織の新鮮な重量を決定します。 - 10人の大人のフライ・トラクセンクスを直ちに100°Lの氷冷抽出バッファーに移し、氷上の害虫と均質化する。サンプルを氷冷状態に保つには、氷上で5~10sのサンプルを均質化し、サンプルを氷の上に5s置き、チューブ内のすべての組織が完全に均質化されるまで繰り返します。
注:チューブをテープでテープに入れ、ホモジネテをチェックして、ホモジネテに血塊がないこと、チューブ内の組織が完全に均質化されていることを確認します。すべてのサンプル処理は氷上で行う必要があります。 - タンパク質含有量測定用の新しいチューブで、各均質化サンプルの10μLを取ります。タンパク質測定用のサンプルを氷の上に保管してください。
注:タンパク質サンプルを凍結し、後で分析するために-80°Cで保存することができます。タンパク質濃度は、クエン酸シンターゼ活性の正常化のための内部パラメータとして機能する。 - 残りの各サンプルに400μLの氷冷抽出バッファーを加えて、合計体積を500°Lにします。反応ごとに、調製した反応液の150μL(20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1 mM DTNB、0.3 mMアセチルCoA、1mMオキサロ酢酸)に希釈された細胞溶解物を1μL添加します。気泡の形成を避け、穏やかにピペットで徹底的かつ直ちに混合します。10sの最小間隔で412 nmで吸光度を測定できるプレートリーダーを使用して、25°Cで4分間40〜30s毎に412 nmで吸光度を測定します。
注:別の試薬を配管する前に先端を変更し、井戸に気泡を形成しないようにしてください。試薬の不完全な混合は、測定にばらつきを引き起こす可能性があります。クエン酸シンターゼ活性アッセイは、サンプルが採取された直後に室温で行う必要があります。反応バッファーは、使用の直前に準備する必要があり、保存しないでください。 - 光学密度(OD)吸光度(abs)(Y軸)対時間(分)(X軸)としてデータをプロットします。次に、反応速度が
サンプルタンパク質濃度で値を割り、クエン酸シンターゼ活性を正規化する。クエン酸シンターゼ活性は、
注:サンプルタンパク質濃度は、タンパク質濃度アッセイキットにより測定することができる。
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結果
図1は、クエン酸シンターゼ活性比色アッセイを用いて得られた412nmにおけるOD吸光度に対する運動曲線の一例を示し、異なる遺伝子型のショウジョウバエ胸郭組織ホモジナートを測定する。PGC-1αがミトコンドリア生形成の主レギュレータであることはよく知られている。PGC-1αはショウジョウバアラとヒトの間で機能的に保存されています。ショウジョウバアラRNF34(dRNF34)は、ショウジョウバエPGC-1α、dPGC-1に対するE3ユビキチンリガーゼであり、dPGC−1タンパク質分解を促進する。透過型電子顕微鏡およびミトコンドリアDNA qPCRは、ショウジョウバエ筋におけるdRNF34のノックダウンがミトコンドリア含有量を増加させ、dPGC-117のノックダウンによって抑制されることを示している。これらの結果に基づいて、ショ...
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ディスカッション
ショウジョウバエをモデルとして使用した代謝研究は、ハエ18の遺伝的背景、食事、およびストックメンテナンスを考慮する必要があります。クエン酸シンターゼ活性の測定に異なる遺伝的背景の影響を避けるために、ショウジョウバエの異なる株は、10世代のコントロール株にバッククロスする必要があります。我々の実験で使用されるすべてのショウジョウバレ株の遺伝的背景はw 1118であり、我々は対照としてw1118を使用した。一般的に、w1118は、ほとんどのショウジョウバレ株の遺伝的背景であり、カントン-Sよりもバッククロスがはるかに簡単であるため、良好なコントロールであると考えています。食事と在庫の維持は、すべての実験グループでまったく同じでなければなりません。私たちの実験では、ハエは通常25°Cと50-60%の相対湿度で維持されます。サンプルの準備手順も注意して実行する必要があります。実験用に設定された十字架は、類似し...
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開示事項
著者は利益相反を宣言しない。
謝辞
この研究は、中国国立自然科学財団(31401013および31471010)、上海市科学技術委員会、上海浦江プログラム(14PJ1405900)、自然科学財団の助成金によって支援されました。上海 (19ZR1446400).
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸(DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| エチレンジアミン四酢酸(EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| ペレット乳棒 | Sangon | F619072 | |
| ペレット乳棒モーター | Tiangen | OSE-Y10 | |
| プレートリーダー | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| はさみ | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
参考文献
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