微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

Summary

このプロトコルは、インビトロ表面アッセイを用いて微小管の無標識、高コントラスト、高速イメージングのための標準的な蛍光顕微鏡上の干渉反射顕微鏡を実装するためのガイドです。

Abstract

表面付近の精製生体分子を可視化する方法はいくつかあります。全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は一般的に使用される方法であるが、分子の活性を妨げる蛍光標識を必要とする欠点を有する。また、光漂白や光の損傷も懸念されます。微小管の場合、干渉反射顕微鏡(IRM)を用いてTIRFと同様の品質の画像が得られることがわかった。これは、IRMがインビトロで大きな生体分子とオリゴマーのダイナミクスを可視化するための一般的な技術である可能性を示唆している。本論文では,IRM画像を得るために蛍光顕微鏡を改変する方法を示す.IRMは、差動干渉コントラスト顕微鏡や干渉散乱顕微鏡などの他のコントラスト技術よりも簡単でかなり安価です。また、暗視野顕微鏡よりも表面欠陥や溶液不純物の影響を受けにくいです。IRMを使用して、このホワイトペーパーで説明する画像解析ソフトウェアと一緒に、視野とフレームレートはカメラによってのみ制限されます。sCMOSカメラおよび広視野照明マイクロチューブの長さは10 Hzの帯域幅の20 nmまでの精密で測定することができる。

Introduction

微小管の標識フリーイメージングは、画像内にコントラストを生成するチューブリンの蛍光標識の必要性を回避する上で興味深い。蛍光標識にはいくつかの欠点があります:タンパク質濃度が^低い場合は実現不可能であり、光漂白および光損傷は観察時間を制限します。ビデオ強化差動干渉コントラスト顕微鏡検査(DIC)およびダークフィールド顕微鏡検査2、3、4、5を含む、ラベルフリーの微小管を画像化するためにいくつかの技術が使用されている。近年、干渉散乱顕微鏡(iSCAT)6、回転コヒーレント散乱顕微鏡(ROCS)7及び空間光干渉顕微鏡(SLIM)8も用いられる。 これらの技術はすべて微小管をイメージングすることができ、微小管ダイナミクスの研究に価値があることが証明されています。ただし、それぞれに独自の制限があります。DICでは、コントラストは微小管とノマルスキープリズム軸の間の角度に依存します。 ダークフィールドでは、微小管信号は不純物または表面欠陥からの散乱光によって分解される。iSCATは(単一のタンパク質まで)異常な感度を示し、ROCSはサンプルの中に微小管をより深く画像化することができますが、どちらの方法も技術的に要求が厳しく、レーザースキャナを必要とします。

このプロトコルは、干渉反射顕微鏡(IRM)9、10を微小管の標識のないイメージングのための代替技術として設定する方法を示す。IRMは標準的な蛍光顕微鏡に安価な50/50ミラーを加えるだけでよいので容易に実装できる。ここで説明するソフトウェアと組み合わせて使用すると、IRMは、高コントラスト微小管画像を生成し、高速で大きな視野を画像化することができ、ワンタイムアライメントを必要とし、蛍光イメージングなどの他の技術と容易に組み合わせることができる。

Protocol

1. 顕微鏡の改変と対物レンズ

1. 適切なフィルターキューブを使用して、蛍光顕微鏡のフィルターホイールに50/50ミラーを挿入します(図1)。50/50ミラーは反射防止コーティングが多いので注意して取り扱います。
   注:私たちは、顕微鏡の空のフィルタキューブに50/50ミラーを使用しました。50/50ミラーは、ダイクロイックミラーがある場所に挿入されます。
2. 高倍率/高NAオイルの目的を使用してください。
   注: このプロトコルでは、100x/1.3 NA の目的を使用しました。

2.表面に微小管を付着させるチャンバー製剤

1. きれいな顕微鏡スライドおよび22のmm x 22のmmカバースリップ(直立した顕微鏡のため)または22のmm x 22のmmおよび18のmm x 18 mmカバースリップ(反転顕微鏡のため)。必要に応じてサーフェスを変更します。例えば、アルカリ性洗剤(材料の表を参照)を使用してカバーリップをきれいにし、その後100%エタノールを蒸留水洗浄^で11の間と後に洗浄します。
2. カミソリの刃と別の顕微鏡スライドをエッジとして使用して、プラスチックパラフィンフィルム(材料の表を参照)の3ミリメートル幅のストリップをカットします。
3. 2枚のプラスチックパラフィンフィルムストリップを3mm離して、きれいな22 x 22mmカバースリップに置きます。次に、18 mm x 18 mm のカバースリップを配置してチャネルを形成します。直立した顕微鏡を使用する場合は、きれいな顕微鏡スライドの上にストリップを置き、上にカバースリップを置きます。
4. パラフィンフィルムの場合、100°Cのヒートブロックにカバースリップ(またはスライド)を置き、密閉されたチャネルを形成します。
5. ピペットを用いた灌流により抗体の50 μg/mL(ブリンクリーバッファー1980(BRB80))内)に流れる。10分間インキュベートします。
   注:我々は、表面にローダミン標識微小管種子を結合するために抗ローダミン抗体を使用しています。あるいは、アビジンは、ビオチン標識微小管種子を結合またはビオチン化金粒子に使用することができる。溶液中にチューブリンが存在しない場合の微小管を単に見る(すなわち、非動的アッセイ)、抗チューブリン抗体を使用することができる。
6. BRB80バッファーで5回洗浄します。0.22 μm フィルターを使用してソリューションをフィルタリングすることをお勧めします。
7. BRB80中の1%ポロクサマー407(トリブロック共重合体)で流れ、非特異的結合に対して表面を遮断する。10分間インキュベートします。
8. BRB80バッファーで5回洗浄します。
9. サンプルは顕微鏡に置かれる準備ができている。サンプルが乾燥するのを防ぐために、チャネルの端にBRB80バッファーの2つの液滴を追加し、必要に応じて補充します。

3. 顕微鏡アライメント

1. サンプルを顕微鏡ステージに置きます。エピイルミネーション光源をオンにします。
2. サンプル表面に焦点を合わせます。オプティカル パス内の光学系からの光の背面反射により、目的が上下に移動するにつれて、複数のサーフェスが観察されます。サンプル表面を見つける良い方法は、パラフィンフィルムエッジに焦点を当てることを目的としています。サーフェスが見つかったら、視野をチャンバーの中心に設定します。
3. フィールドダイヤフラムを半分に閉じ、調整ネジを使用して、視野のダイヤフラムを中央にします。位置合わせが完了したら、ダイヤフラムを再度開きます。
   注:ネジ調整は散発的に行う必要がありますが、おそらく3~6ヶ月ごと、またはトラブルシューティングを行う場合のみ行う必要があります。
4. ベルトランレンズをスライドさせて、目的の出口瞳(背面焦点面)を表示します。
5. 目的の出口瞳孔の端を越えて絞りダイヤフラム(AD)を閉じます。
6. 調整ネジを使用して、AD を出口の瞳孔と中央に合わせて使用します。AD を開き、そのエッジを終了瞳孔のエッジと一致させることで、ダブルチェックします。
   注: この調整は散発的に行う必要があります。
7. 絞りダイヤフラムを目的のNAの約2/3に設定します。絞りダイヤフラムを最適化するための詳細な手順については、セクション 7 を参照してください。

4. 安定した微小管または40nmの金粒子のイメージング

注:安定した微小管および金ナノ粒子はよい制御サンプルとして役立つ。IRM性能を評価し、最適な絞り横隔膜開口部の設定に役立つ最初のステップとして、表面に取り付けられた微小管または金ナノ粒子を画像化することをお勧めします(セクション7)。

1. カメラの露出時間を 10 ミリ秒に設定し、カメラのダイナミック レンジをほぼ飽和するようにイルミネーションを調整します。
2. BRB804、12、13(または40nmの金粒子)のグニリンリン(α、β)-メチレン-二ホスホネート(GMPCCP)またはタキソール安定化微小管の10μLの流れは、新鮮なサンプルおよびモニターへのピペットを用いて灌流することによって表面をイメージそれによって結合する。10~20個の微小管が視野内に結合したら、BRB80でサンプル2xを洗浄します。
   注:よく整列された顕微鏡を使用すると、微小管は背景減算なしで見える必要があります。
3. 1秒の遅延期間を10秒(10ミリ秒露出時)に設定して10枚の画像を取得します。
4. 背景画像を取得します。これを行うには、ステージコントローラまたはコンピュータソフトウェアを使用してステージを長軸に沿って移動し、遅延なく100枚の画像を取得します(つまり、100 fps @ 10ミリ秒の露出に近いストリーミング)。
   注: 背景は 100 画像の中央値です。中央値を取ることによって、照明プロファイルおよび光学系の汚れのような他の静止した特徴は他のすべてがろ過される間維持される。これはステージが移動され、最終的に背景画像を劣化させるにつれて軸位置の変化につながるので、サンプルに傾きがあってはならない。チルトを避けることができない場合は、シードを流す前に平均的な背景画像を取得する方法があります。
5. イメージの処理と分析については、手順 6 に進みます。

5. イメージング微小管ダイナミクス

1. 脳チューブリンを用いた微小管ダイナミクスの場合は、サンプルヒーター温度を37°Cに設定します。
2. BRB80¹¹におけるGMPCCP安定化微小管種子の10μL中の流れは、新鮮なサンプルにピペットを用いて灌流することにより、表面に結合して表面に結合することを監視する(すなわち、ストリーミング中)。10-20種子が視野で結合したら、BRB80で2xチャンネル体積を使用してサンプルを洗浄します(BRB80は37°Cまたは少なくとも室温で予め温める必要があります)。
   注:よく整列された顕微鏡を使用すると、種子は背景減算なしで見える必要があります。
3. 重合ミックス中の流れ(7.5 μM無標識チューブリン+1mMグアノシン三リン酸(GTP)+BRB80バッファー内の1mMジチオスレイトール(DTT))。微小管の成長を測定するには、取得ソフトウェアを使用してタイムラプスを設定し、5 秒ごとに画像を取得します (0.2 フレーム/秒 (fps)) 15 分間。
4. コントラストを高めるには、各時点で 10 個の画像を取得し、平均します。微小管収縮の場合は、時間遅延を0に設定し、露出時間を10msに設定することで100fpsで画像を取得します(使用するカメラに応じて、対象領域が小さい方の方が高いfpsが可能です)。
5. ステップ 4.4 のように背景イメージを取得します。

6. 画像処理・解析

注:分析のために、このプロトコルは^{フィジー14}を使用しますが、読者は彼女/彼が適切と思う任意のソフトウェアを自由に使用することができます。

1. 保存した背景画像を開きます。
2. イメージ > スタック > Z プロジェクト > 中央値を使用して中央値イメージ (バックグラウンド) を計算します。
3. ファイル > オープンを使用して、スタックとしてマイクロチューブダイナミクスムービーをスタックとして開きます (非動的微小管の場合は同じ)
4. プロセス > イメージ電卓を使用して、スタックから背景イメージを減算します。「32ビット(浮動小数点)結果」オプションを必ず確認してください。
5. 動的微小管の場合、線ツールを使用して目的の微小管に沿って線を引き、"t"を押して関心のあるマネージャの領域に追加します。目的のすべての微小管について繰り返します。
6. 動的微小管の場合は、マルチカイモマクロ(補足ファイル1)を実行します。マクロは、ROIマネージャのすべての微小管のビデオとキモグラフを生成します。すべての微小管は一意の識別子を取得します。
7. 動的微小管の場合は、Kymo分析マクロ(補足ファイル2)を実行し、その手順に従って微小管の成長率と収縮率を測定します。

7. 絞りダイヤフラムサイズ

注:IRMを用いて微小管の高コントラスト画像を取得するための重要な要因は、照明数値開口部(INA)を正しく10、15に設定することです。INAは、ADのサイズによって制御される目的の出口瞳孔の着信照明ビームのサイズを変更することによって変更することができる(ADは、目的の出口の瞳孔(背部焦点面)とのコンジュゲート平面に位置する)、図1):

D_ADが絞りダイヤフラムの直径である場合、f _目標は目的の焦点距離であり、D _epは目的の出口瞳孔径です。通常、AD は蛍光イメージング用に完全に開いたままになっているので、INA は目的のNAと等しくなります。 蛍光顕微鏡では、ADスケールはその直径を示さないため、INAは計算できません。目的の助けを借りて AD サイズを調整することは可能です。しかし、AD サイズはコントラストが最も高いサイズに固定されるので、必要ありません。

1. 表面に貼り付けられた蛍光標識された安定化微小管のサンプルを調製する(ステップ4.1-4.2)。
   注:テトラメチルロダミン標識微小^管16(例:550nm、Em:580nm)を用いた。
2. 顕微鏡のピント合わせノブを使用して微小管をフォーカスし、蛍光的にイメージングします(微小管にラベルが付いていない場合は、IRM¹⁵またはDIC⁵で画像化してください)。
3. カメラ ソフトウェアを使用して、カメラの露出を 10 ミリ秒に設定します。
   注:この露出は任意であり、100ミリ秒の露出も動作します。
4. AD を最小の開口部まで閉じます。カメラのダイナミックレンジをほぼ飽和させるか、可能な限り最大にイルミネーションを調整します。
   注: ガイドとして、通常は取得ソフトウェアによって提供されるルックアップ テーブルを使用します。
5. 10以上の微小管を含む視野の10枚の画像(ストリーミングまたは毎秒画像を撮影することによって)を取得します。
6. ステップ 4.4 のように背景イメージを取得します。
7. AD のサイズを変更し、AD の開始範囲全体に対して手順 7.5 ~ 7.6 を繰り返します (閉じた値から終了瞳孔サイズまで、図2)。AD サイズを変更するたびに、ステップ 7.4 のイルミネーション強度を調整します。
8. 取得したすべてのビューフィールドについて、プロセス> 画像計算機を使用して対応する背景を減算し、ドロップダウンメニューから「減算」を選択します。「32ビット(浮動小数点)結果」オプションがチェックされていることを確認します。次に、イメージ > スタック > Z プロジェクト > 平均を使用して結果の画像を平均します。
9. 微小管信号の平均強度(微小管の強度から背景の強度を差し引いた)として定義された微小管の信号対バックグラウンドノイズ比(SBR)を、背景の標準偏差で割った(図3)
10. 開口部のサイズごとに微小管の平均 SBR を計算して最適な AD サイズ (つまり最適な INA)を決定し、AD サイズを最も高い SBR を生成するサイズに設定します (図2)。同等の^{コントラスト15}を生み出すADサイズの範囲がある可能性があります。

Results

前述のように、よく整列した顕微鏡では、微小管は背景減算なしで見える必要があります(図4A)。背景を減算すると(図4B)、微小管のコントラストが高まる(図4C)。コントラストをさらに高めるために、平均化またはフーリエフィルタリングまたは両方の組み合わせを使用することができます(図4D、F、E)。図 4Gのライン スキャンは、画質の段階的な向上を示しています。各処理ステップでバックグラウンド ノイズが低減されることに注意してください。

タイムラプスムービーから生成された微小管ダイナミクスのキモグラフの例を図5に示す。動画は0.2fps(遅い)と100fps(高速)の2つのフレームレートで取得されました。前者は成長率の測定に適していますが、後者は成長率よりも速い程度の収縮率を測定するのに適しています。

顕微鏡の設置に金ナノ粒子を用いる場合、例の画像を図6に示す。金ナノ粒子は、表面に受動的に取り付けられた。40nm粒子が推奨されるが、20nm粒子を画像化することも可能であり、しかも低いコントラストで。

図 1.IRM の概略表現。(A)光源からのエピイルミネーションは、50/50ミラーに到達する前に開口ダイヤフラムを通過します。絞りダイヤフラムは、このようにイルミネーションNAのビーム幅を設定します。50/50ミラーは、サンプルを照らす目的までの光を部分的に反射します。サンプルから反射された光を収集し、カメラチップ(チューブレンズによる)に投影し、画像を生成するのを妨げる。画像コントラストは、ガラス/水界面(I1)から反射される光と、水/微小管界面(I2)から反射される光との間の干渉の結果です。微小管/表面距離(h)に応じて、I1とI2の間の光路の差は、建設的な(明るい信号)または破壊的な(暗い信号)またはその間の何かをもたらす。例えば、波長600nmの光をイメージングに使用すると、微小管の高さが約100nm変化すると、コントラストが暗く、明るい色合いが切り替わります。アスタリスクは、コンジュゲート平面を示します⁽¹⁵から変更)。(B) 50/50 ミラー・インストールの例。適切なフィルタキューブを開き、通常はダイクロイックミラーが座っている場所にミラーを挿入しました。ミラーは、製造元の指示に従って配向されました。その後、立方体を顕微鏡に戻して挿入したフィルターホイールに挿入した(図示せず)。取り付け中は手袋を使い、鏡は縁のみで保持されていました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.最適な絞りダイヤフラム設定。(A)同じ視野は、背景減算なしで異なる開口の開口部で画像化された。視覚的には、絞り横隔膜の大きさが高原に達し、その後劣化し始めるまで、コントラストが増加しました。これは、背景減算画像の(B)SBR測定によって確認された。誤差符は標準偏差です。 スケールバーは500 μm(AD)と3μm(微小管)です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.信号対バックグラウンドノイズ比の測定。微小管は関心のある領域で隔離された。対象の各領域は、微小管を背景から分離するために閾値化された。平均微小管信号は、微小管を横切るラインスキャンから得られた。スキャンライン幅は、微小管長と等しくなります。このように、スキャン上のすべての点は、その点に平行な微小管軸に沿ったすべてのピクセルの信号の平均です。バックグラウンド ノイズは、しきい値を下回るすべてのピクセルの標準偏差です。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.画像処理。生画像(A)を取得した後、背景(B)を減算し(C)して微小管コントラストを高めた。コントラストをさらに向上させるために、画像は平均化(D)またはフーリエフィルタリング(E)または両方(F)であった。線スキャン(G)は、(A) の赤い破線で示される位置が、(A)から(F)のさまざまな画像と一致する色です。下隅の数値は、視野全体で測定される平均 SBR です。スケールバーは5 μm(15から変更)です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5.キモグラフの例。(A) 0.2 fpsで得られたタイムラプスムービーから生成された微小管ダイナミクスのキモグラフ例。(B) 100 fps で取得したムービーから生成された収縮イベントの例を示すカイモグラフ。破線は、種子をマークします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6.IRMで画像化した金ナノ粒子の例。サイズ20及び40nmの金ナノ粒子を受動的に表面に取り付けた。10枚の画像を取得しました。背景減算の後、画像はコントラストを高めるために平均化されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 7.微小管長 IRM 画像の精度を追跡します。安定した微小管(すなわち、固定長)を100fpsで200倍に画像化し、その後平均10fpsでコントラストを高めた。次に、微小管の長さは、Fiesta¹⁷トラッキングソフトウェアを用いて測定した。すべての微小管について、平均長さと標準偏差は図に示すように計算された(破線は標準偏差を表し、実線は標準偏差を表し、長さは3971 ±20nmである。全体的なトラッキング精度は、追跡されたすべての微小管の標準偏差の平均でした(n = 6微小管x 20データポイント= 120データポイント)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 2. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルは、微小管ダイナミクスのイメージングおよび測定のためのIRMの成功した使用を実証した。画像コントラストに最も強い影響を与えるため、照明の数値絞りを正しく設定するように注意する必要があります。また、高いNA目標は低NA目標と比較して高い光収集力を持っているので、高い解像度/高コントラスト画像を得るためには、高い数値絞り(NA)の目的を使用することが重要です。表面と溶液がクリーナーは、汚れが表面に取り付け、画像にノイズのような(実験中に)斑点を追加することになるので、ノイズを低く使用しました。背景画像の取得は重要であるだけでなく、照明の不均一性、静的ノイズ、表面の凹凸を除去します。

推奨される変更は、イルミネーション パスにロング パス フィルタ (>600 nm) を導入することです。白色光源のスペクトルは、通常、微小管を損傷することができるUV中の波長を含みます。さらに、IRMと蛍光を組み合わせる場合にIRMに長波長を使用すると便利です(例えば、微小管関連タンパク質(AMP)が微小管ダイナミクスに及ぼす影響を調べるとき)。消費時間のイメージングでは、サンプルドリフト(特に光軸に沿って)は、背景面からのイメージ平面の偏差による画像コントラストが低下することに注意してください。現代の顕微鏡は、多くの場合、安定化機構(例えば、完璧な焦点(ニコン)、明確な焦点.2(ツァイス)、IX3-ZDC2(オリンパス))が装備されています。別の解決策は、受動的またはアクティブ^に18またはドリフト19、20、21を修正することによって、セットアップを熱的に安定させることです。最後に、微小管コントラストは、フィールドダイヤフラムのサイズを小さくすることによって増加させることができる(70%の開口部は、増加するコントラストと視野サイズの間のバランスであるので良い選択である)15。

IRMは微小管のイメージングに適していますが、単一のタンパク質を検出するのに十分な感度ではありません。このようなアプリケーションに対して、iSCATはより適切な手法である。同様に、蛍光とiSCATは、10 nm未満のトラッキング精度が必要な場合に適しています。IRM の場合、測定された長さの追跡精度は、図 7に示すように ~20 nm です。

表面アッセイにおけるIRMの使用は、微小管を超えて行くことができます。例えば、分子モータは金ナノ粒子で標識され、微小管と相互作用する時に追跡することができます。さらに、反射干渉コントラスト顕微鏡(RICM)22として知られているより高度な形態のIRMは、原則として、微小管コントラストをさらに高め、より高いトラッキング精度を得るために使用することができる。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
顕微鏡	ニコン	Ti-Eclipse	expriments
50/50 ビームスプリッター	Chroma	21000	を購入するときは、顕微鏡で使用されるキューブに適合するスプリッターの寸法を選択するようにしてください
ニコンプラン 蛍光 100X/0.5-1.3 アイリス対物	ニコン	MRH02902	イメージング対物レンズ。この対物レンズは、NA 1.3
Mucasolユニバーサル洗剤	Sigma-aAldrich	Z637181-2L	カバースリップとスライドプラスチック
パラフィンフィルム(商業名Parafilm M)	Sigma-aAldrich	P7793	流路の構築に使用されます
抗TAMRA抗体	Invitrogen	A-6397	TAMRA標識分子(微小管など)をサンプル表面に結合するために使用されます。RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (商品名Pluronic F-127)	Sigma-aAldrich		チャネル表面を遮断して非特異的な結合を防ぐために使用されます
40 nm 金ナノ粒子	Sigma-aAldrich	753637	対照サンプルとして使用
20 nm 金ナノ粒子	Sigma-aAldrich	753610	対照サンプルとして使用
Zyla 4.2 カメラ	Andor	Zyla 4.2	2048x2048ピクセル(6.5µmピクセルサイズ)72%の量子効率と16ビットのダイナミックレンジ
Feista追跡ソフトウェア			https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA
安定化マイクロチューブ			(テキストの参考文献を参照)