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方法論記事

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

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DOI:

10.3791/59544

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2019年4月23日

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, The University of Michigan, 2Molecular & Integrative Physiology, The University of Michigan

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、マウス肝外胆管内 3 次元におけるシステムの運用について説明します。これらの肝オルガノイド cholangiocyte 生物を勉強する文化で維持できます。胆道 organoids 前駆細胞と胆管細胞のマーカーの表現し、偏光の上皮細胞で構成されています。

要約

胆道閉鎖症、原発性硬化性胆管炎、胆管癌、肝外胆管 (EHBDs) に影響を与える、Cholangiopathies が含まれます。彼らは効果的な治療オプションであるないです。EHBD を検討するためのツールは非常に制限されます。私たちの目的は、野生型および遺伝子改変マウスから簡単に生成することができます臓器特異、汎用性の高い、大人の幹細胞、臨床 cholangiocyte モデルを開発することでした。したがって、成体マウス EHBDs から EHBD (EHBDO) における文化システムの開発手法について報告する.モデルはコスト効率の高い、容易に分析することができる複数のダウン ストリーム アプリケーションであり。具体的には、マウスの EHBD 分離と単一細胞解離、organoid 文化発生, 伝ぱと長期的な保守とストレージの方法論について述べる。この原稿には、リアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT PCR) による免疫組織化学、蛍光顕微鏡および mRNA 豊富な定量処理 EHBDO もについて説明します。このプロトコルには、EHBD 固有オルガノイドを生産に加えて重要な利点があります。L 警告細胞馴化培地の使用このモデルのコストを大幅に削減します。EHBDs ・ マウスの使用は、人間の組織とは異なり、文化世代のほぼ無制限の組織を提供します。生成されたマウス EHBDOs 内皮前駆細胞のマーカーと上皮細胞の純粋な人口を含めるし、胆管細胞を分化します。オルガノイド培養は複数の通路を通って同種の形態を維持し、液体窒素で長期保管後回復することができます。モデル肝前駆細胞増殖に関する研究では、薬理学的、操作することができます、遺伝子組み換えマウスから生成される可能性があります。将来の研究は、めっき効率を高める機能を細胞の成熟と分化の直接評価するために培養条件を最適化するために必要です。共培養モデルともっと生物学的に中立的な細胞外マトリックスの開発も目指しています。

概要

Cholangiopathies は、内・肝外胆管 (EHBDs)1に位置する胆管細胞に影響を与える難病の慢性進行性疾患です。原発性硬化性胆管炎、胆管癌、胆道閉鎖症と総胆管の嚢胞のようないくつかの cholangiopathies は、EHBDs を主に影響します。Cholangiopathies 治療法の開発は、前臨床モデルの限られた供給によって制限されます。さらに、先行研究をまとめ cholangiopathies に焦点を当て: 肝臓、内および EHBDs。しかし、内 EHBDs 異なる胚起源を持っているし、したがって、異なる分子病態として考慮されるべき。肝内胆管は、肝膵板と肝憩室の頭蓋の一部から開発、肝憩室2の尾の部分から全体の EHBDs を開発します。彼らはまた、肝内胆管と EHBDs2,3の後腺ヘリングの運河を含む大人の恒常性の異なる前駆細胞コンパートメントに依存します。前臨床研究のための動物モデルの使用費用によって制限され、倫理的な理由のため最小限に抑える必要があります。したがって、還元、再現性のある、時間およびコスト効率の高い体外モデルは非常に望ましいです。

Cholangiopathies のほとんどの先行研究では、正常マウスまたはラット癌モデルまたは EHBDs4,5,6,7からひと胆管癌細胞の増殖を利用されています。ただし、これらは変換されたセルのモデルであり、通常 cholangiocyte 生物の恒常性や健康状態を再現できません。切片培養モデルの開発の最近の進展は、正常ではないマウス EHBDs8,9、肝胆道系組織を含む、異なる組織タイプから 3 次元構造の開発を許可しています。 10。これらの「オルガンのような"構造は主な組織模倣目的し、11臓器特異幹/前駆細胞の自己複製を支援人工ニッチで栽培されて。

「Organoid」は広範な言葉それほとんど一般幹細胞由来三次元組織モデルをについて説明します。オルガノイドをプログラムし直された多能性幹細胞は胚性幹細胞で表され、誘導多能性幹細胞から生成できます。彼らはまた臓器特異成体幹細胞12から生成できます。いくつかの cholangiocyte におけるモデルは、以前の研究で提案されている.したがって、ひと多能性幹細胞由来 organoids 報告7,9,13をされている、異なる種類の細胞を同時生成できる、貴重な時間の効率的なツールを提供します。ただし、構造と機能の主なアダルト EHBD 胆管に、完全に、これら多能性幹細胞由来 organoids は反映されません。

9の人間の成人の幹細胞から派生したオルガノイドとネコ10肝はまた提案しました。猫のモデルは広く利用可能ではないと研究用ツール装備一式が限られています。また、これら肝臓由来成人幹細胞オルガノイドむしろ肝内胆管、肝外胆管にモデル化を行います。

EHBD organoid 世代は人間普通 EHBDs14マウス EHBD 肝門部胆管癌の15から報告されました。EHBD 人体へのアクセスは非常に限られた organoids に由来する胆管細胞癌15の遺伝的マウスモデルは恒常性の生物学の健康的な cholangiocyte ではないし、遺伝子組換え細胞由来します。

多能性幹細胞と肝臓由来 cholangiocyte organoid モデルおよび前臨床モデルで必要とされる人間の組織への限られたアクセスの制限に対処するには、マウス EHBD organoid モデル (図 1 a) を開発しました。本稿では、マウス成体組織から EHBD 派生オルガノイドの技術の開発について説明します。EHBDOs の名前これら EHBD オルガノイド EHBDs cholangiocyte の恒常性と病気プロセス、cholangiopathies などの基になるメカニズムの研究のための重要な生体外のツールになります。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ミシガン大学によって承認されています。

1. マウス EHBD 分離用装置および材料の準備

  1. 播種培地と 50 mL の洗浄バッファー (材料表) の円錐管を準備し、使用するまで 4 ° c または氷の上にそれらを保ちます。
  2. 手術台 (図 1 b) を設定します。滅菌外科用器具 (図 1) を準備します。
  3. それをあらかじめ温めて 37 ° C 培養インキュベーター滅菌 24 ウェル プレートを配置します。
  4. 氷の上地下行列の因数を配置します。それは完全に液化するときだけ地下の行列を使用します。

2. EHBD の単離と胆汁培養

  1. 分離およびマウス EHBD の単一細胞懸濁液の準備
    1. 制度のガイドラインによると (2 か月より古い) アダルト マウスを安楽死させます。仰臥位にマウスを配置します。正中アプローチを用いた腹部キャビティを開き、横隔膜の上に肝を撤回します。
    2. すぐ下に肝門部注意深く引いて、止血と近位十二指腸胆管を識別します。メス刃を使用して周囲の組織から EHBD を分離します。鉗子で総胆管の近位端を持ち、遠位十二指腸との合流点のすぐ上にそれを解剖し、肝臓 (図 1) からダクトの近位端を解剖します。すぐに冷たい洗浄液に分離 EHBD (図 1E) を配置します。
    3. 洗浄バッファーから、EHBD を外し、生殖不能のメスの刃を使用して 0.5 mm セクションにミンチします。プロシージャ (図 1 b) の間に氷の上のガラス板に組織を配置します。
    4. 500 μ L の解離バッファーを含むチューブに EHBD セクションを配置します。37 ° C で 20 分間インキュベートします。冷たい細胞培養液 500 μ L を追加することにより解離バッファーを中和します。
    5. 上下に 20 回ずつ、18 G と 20 G の針を進める細胞懸濁液をカップ刻んだ。70 μ m セル ストレーナーを介して細胞懸濁液をフィルタ リングし、50 mL のチューブの流れを収集します。
      注:事前条件の 500 μ L 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 細胞懸濁液の通過を容易にフィルター処理する前のとストレーナー。
  2. EHBD オルガノイドの確立
    1. 4 ° C で 5 分間 (300 x) g 2.1.5 ステップからフローを介して遠心
    2. 上清を慎重に取り外します。1 mL の氷冷滅菌 PBS に細胞を再懸濁します。新しい 1.5 mL チューブに再懸濁を転送します。2.2.1 手順を繰り返します。
    3. 遠心分離の後チューブ下部洗浄細胞から培養上清を慎重に取り外します。P200 でもヒントを使用して上下ピペッティングによる液化冷たい地下行列の 120 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。
      注:地下のマトリックス細胞ペレット濁は、氷浴で実行されるが。
    4. 予め温めておいた 24 ウェル プレートには井戸の中心に地下のマトリックスでセル巻き上がり 40 μ L をプレートします。
      注:バブル形成を防ぐために地下の行列を操作しながら空気を吸引を避けます。
    5. プレートを 37 ° C 培養インキュベーター 15 分または地下の行列が固化するまでに地下の行列で再停止されるセルに返します。播種培地の 600 μ L 温めても (資材表)、37 ° C を追加します。プレートを 37 ° C 培養孵卵器に戻ります。
    6. 3 日間、その後は 3 日おきに新鮮な organoid 培地の 600 μ L で播種培地を置き換えます。倒立顕微鏡における成長を監視します。下流のアプリケーションや分割蓄積腔内の破片や organoid 崩壊の前にすべての 7 〜 9 日間使用 organoids 観察 (図 2 a)。

3. EHBD Organoid 通路とストレージ

  1. 1:4 9 に 7 日ごとに EHBD organoids 1:3 の通路
    1. 井戸からメディアを削除し、氷冷 PBS の 400 μ L を追加します。軽くピペッティング混合物、上下 10 回井戸の中で、オルガノイドを再懸濁します。1.5 mL チューブに混合物を転送します。
    2. オルガノイドを分離するに 4 回 25 G 針を通して混合物を通路します。4 ° C で 4 分の 400 x gで混合物を遠心分離します。
    3. 上清を慎重に削除や地下の行列 (1:3 1:4) さらに (ステップ 2.2.4。) を培養するために細胞を再懸濁します氷冷 PBS のセルを洗浄してさらに処理するため。
      注:通常、250-300 セルは下流用 24 ウェル プレートにメッキが。オルガノイドの数を数えると初期細胞数から彼らの % の計算により継代した後 3-5 日目で倒立顕微鏡を用いた明視野顕微鏡によるめっき効率を評価できます。mRNA は EHBDOs ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出法を用いた標準的なプロトコルを使用して PBS で洗浄のから分離することができます。
  2. EHBD オルガノイドの長期保管
    1. 井戸からメディアを取り出して、室温 PBS とオルガノイドを洗います。PBS を井戸から地下行列ドロップを乱すことがなく削除します。
    2. 冷たいセルフリーズの井戸の中に媒体の 500 μ L を追加します。軽く液化地下マトリックスおよびセルフリーズの中でオルガノイドを再懸濁します、セラム チューブに混合物を転送します。
    3. 気相に 48 h. 転送-80 ° C でバイアルの窒素タンク長期保存のために瓶を格納します。

4 パラフィン包埋用 EHBD における Pprocessing

  1. 5 〜 10 倍上下ピペッティングで 500 μ L の氷冷 PBS (4 ° C) で EHBDOs を再懸濁します。1.5 mL チューブに液化地下行列の再懸濁の EHBDO を収集します。
    注:オルガノイドを破損しないよう、P1000 先端の 2-3 mm の底を切り取り、非常に慎重に上清を削除します。
  2. 350 x gで 5 分間の遠心 EHBD organoids は organoid ペレットを乱すことがなく上澄みを慎重に取り外します。
  3. オルガノイドに冷えた 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 1 つの mL を追加し、4 %pfa が 4 ° C で一晩オルガノイドを孵化させなさい削除 4% PFA organoids 一晩インキュベートした後 P1000 チップを使用してから。
  4. Organoids 管に室温 PBS の 1000 μ L を追加し、室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。350 x gで 5 分間繰り返しで PBS で organoids 管 2 回以上このプロセスを遠心します。
  5. PBS を削除し、オルガノイドを 30% エタノール 1 mL を追加します。右で 5 分間インキュベートします。
  6. ルート削除 30% エタノールで 5 分間 350 x gでチューブを遠心します。70% エタノール 1 mL を加えて、室温 5 分間インキュベート
  7. 5 分削除 70% エタノール 350 x gで centrifugate。100% エタノール 1 mL を加えて、室温 5 分間インキュベート
    注:処理前に最大 48 時間室温で 100% エタノール オルガノイドを保つことができます。
  8. 20 電子レンジで試料処理ゲルの熱 s または液化まで。試験片加工オルガノイドのチューブにゲルの 50 μ L を追加します。試験片のゲルを加工が固化するまで、氷の上管を配置します。
  9. 試験片加工 organoids チューブからゲルのドロップを取り外し、さらにティッシュ プロセッサで処理するためのカセットで青いスポンジ パッドの間。さらに処理中にパラフィン embedder の各ステップの 15 分を使用.
  10. セクション パラフィン organoids 試験片加工では、免疫組織化学的染色法上記16と続行は、4 μ m でゲルします。

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結果

提案プロトコルでは、組織特異的幹細胞から派生した大人は、マウス EHBD オルガノイドの世代について説明します。オルガノイド培養される後、嚢胞構造形成 EHBD 分離後 1 日も早く観測できます。通常、線維芽細胞の混入は文化の生成中には反映されません。EHBDO めっき効率は約 2% (2 か月より古い) 新生児または成人から分離されたときマウス (図 2 b)。通路 2 のまま安定した (図 2 b) 11% に増加を大人のマウスから派生する EHBD オルガノイドの効率をメッキします。オルガノイドの大半は、珍しい「不規則な」オルガノイド (図 2-E) と、すべての通路を通って嚢胞形態を示しています。Organoids 5-7 日後、彼らは腔内の残骸を集めるを起動し、(図 2 a) を悪化で成長のピ...

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ディスカッション

この作品では、マウス EHBD 胆管の切片 3次元モデルの生成について説明します。EHBDO 文化世代の重要なステップは、膵臓細胞汚染、細菌および真菌の汚染と遠心分離を避けるために後慎重に操作を防ぐために滅菌条件の整備を避けるため細心の EHBD 郭清、細胞材料の損失。記載されている温度条件との密着が必要です。手法にいくつかの制限があります。成体マウスの EHBDs、小さな (約 1 mm の直径。図 1E) の分離のための技巧が必要な。解剖顕微鏡は、郭清を支援するために使用できます。

このプロトコルで使用される地下の行列は、既知および未知の成長因子19、うち濃度はロットごとに変わることができるを含む生物学的マトリックスです。技術的な複製は、同一ロットおよび/または地下行列の因数を使用して変動は避けるようにお勧めします。また、マイコ プラズマ汚染のため L 警告細胞培養と WNT 活動11馴化培地を定期的にチェックをお勧めします...

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開示事項

著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

謝辞

この作品は、アメリカ協会 (ノーマン ・) に研究の肝疾患ピナクル賞、国立衛生研究所、国立糖尿病、消化器・腎臓病 (ノーマン ・ J.L.M. に影響するもの P01 DK062041 に P30 DK34933 賞受賞) によって支えられました。この方法論の開発と彼の援助ありがとう博士ラモン Ocadiz-ルイス (ミシガン大学)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
L-WRN 細胞培養培地
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
ウシ胎児血清 (FBS)1%Life Technologies10437-028
ペニシリン-ストレプトマイシン100 U/mLLife Technologies15140-122
<ストロング>洗浄バッファー
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)50 mLLife Technologies10010-023
ペニシリン-ストレプトマイシン125 U/mLLife Technologies15140-122
アムホテリシンB 6.25 以上g/mLLife Technologies15290-018
オルガノイド培地
L-WRN 調整培地 1:1ATCCCRL-3276
Advanced DMEM/F121:1Life Technologies12634-010
ペニシリン-ストレプトマイシン100 U/mLLife Technologies15140-122
N-グルタミン10 & マイクロ;l / mLLife Technologies35050-061
N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸、HEPES10 mMLife Technologies15630-080
B2710 & micro;l/mLGibco17504-044
N210 µl/mLGibco17502-048
オルガノイド播種培地
オルガノイド培地 
上皮成長因子 (EGF)50 ng/mLInvitrogenPMG8041
線維芽細胞増殖因子-10 (FGF10)100 ng/mLPeproTech100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) 抗体, Rabbit1:250Abcamab53119
性決定領域Y-Box 9 (SOX9) 抗体, Rabbit1:200Santa Cruzsc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) 抗体, Rabbit1:2000DSRBF109-D12
E-cadherin 抗体, Goat1:500Santa Cruzsc-31020
Acetylated &α;-tubulin antibody, Mouse1:500Sigma-AldrichT6793
二次抗体
488 標識抗ウサギ、Donkey IgG1:1000InvitrogenA-21206
594 標識抗ヤギ、Donkey IgG1:1000InvitrogenA-11058
568 標識抗マウス、ヤギ IgG2b1:500InvitrogenA-21144
TopFlash Wnt レポーターアッセイ
TopFlash HEK293 cell lineATCCCRL-1573
ルシフェラーゼの検数のキットBiotium30003-2
0.05% Trippsin-EDTALife Technologies25300054
0.4% Trypan Blue SolutionLife Technologies
15250061Additional Materials and Reagents
Basement Matrix, phenol free Matrigelコーニング356237
解離バッファー、AccutaseGibcoA1110501
細胞培養凍結培地、RecoveryLife Technologies12648010
細胞ストレーナー (70 µm、滅菌済み)フィッシャーブランド22363548
グアニジニウムチオシアン酸フェノールRNA抽出、TRIzolInvitrogen15596026
検体処理ゲル、HistoGelサーモフィッシャーサイエンティフィックHG-4000-012
ユニバーサルマイコプラズマ検出キットATCC30-1012K
1.5 mL 微量遠心チューブフィッシャーブランド05-408-129
24ウェルプレートUSA ScientificCC7682-7524
50 mL 円錐形遠心分離管Fisher scientific14-432-22
蛍光顕微鏡NikonEclipse E800
倒立顕微鏡Biotium30003-2
剖検トレイFisherbrand13-814-61

参考文献

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