蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Summary

相撲は必須で高度に保存された、小さなユビキチンのような修飾タンパク質です。このプロトコルでは、ストレス耐性組換え相撲捕捉タンパク質 (kmUTAG) を使用して、ネイティブ、タグなしの相撲コンジュゲート、およびさまざまな種類の細胞での局在を可視化することを説明しています。

Abstract

ここでは、哺乳動物細胞および線虫卵細胞におけるタンパク質およびそのサブ細胞局在の sumoylation を研究する新規な方法を提示している。この方法は、組換え改変された相撲捕集タンパク質断片を利用し、kmUTAG は、ストレス耐性出芽酵母Kluyveromyces marxianusの Ulp1 相撲プロテアーゼに由来する。我々は、抗体を使用せずに様々なモデルシステムで sumoylation を研究する目的で、kmUTAG の特性を適応してきた。相撲の研究のために、KmUTAG は抗体ベースのアプローチと比較するといくつかの利点があります。このストレス耐性の相撲捕集試薬は、組換えに生産され、多くの種から天然の相撲アイソフォームを認識し、かつ市販の抗体とは異なり、自由で非抱合型相撲に対する親和性の低下を示す。ここに示された代表的な結果は、哺乳動物組織培養細胞および線虫卵子における相撲コンジュゲートの局在を含む。

Introduction

この方法の目的は、組換え相撲捕獲 UTAG (ULp ドメインタグ) タンパク質を用いて、相撲共役タンパク質の研究と分析を容易にすることである。以下に詳述するように、UTAG は、他の試薬の代わりに、相撲修飾タンパク質を精製、検出、および視覚化するためのアプローチを使用することができます。成長条件に応じて、細胞は、相撲または相撲の鎖で修飾された数百または数千のタンパク質を含むことができる (レビューのために Kerscher et al. 2006¹および Kerscher 2016²を参照)。これは、特に特定の sumoylation の標的の一部分のみが実際に改変された³であるため、特定の相撲修飾タンパク質の機能解析にとってかなりの困難を表している。転写調節、タンパク質の恒常性、細胞ストレスへの反応、有糸分裂と減数分裂の間のクロマチンのリモデリングなどの重要な細胞プロセスにおけるそれらの役割に加えて、;現在では、相撲、相撲改変タンパク質、および相撲の経路構成要素も、癌や神経変性疾患などの病理のためのバイオマーカーとして可能性があることが十分に明らかになっています^{4,5,6 、7}。これは、さまざまな細胞およびサンプルにおける相撲修飾タンパク質の検出と機能解析のための、堅牢で信頼性が高く、入手しやすいツールと革新的なアプローチの必要性を強調しています。

多くのシステムにおいて、相撲特異的抗体は、相撲修飾タンパク質^8,9の検出、分離および機能分析のための選択の試薬です。しかしながら、いくつかの商業的に入手可能な相撲特異的抗体は、高価であり、量または可用性において制限され、乱暴に可変親和性および交差反応性を示す傾向があり、そしていくつかの例では再現性¹⁰を欠く。別のアプローチとしては、形質転換された細胞や生物におけるエピトープタグ付き相撲の発現があるが、エピトープタグを相撲に結びつけることは、タンパク質標的¹¹への共役を人為的に下げる可能性がある。さらに、エピトープは、未変換の細胞または組織が評価される場合には有用ではない。

Ulp1 は、相撲前駆体と desumoylates 相撲共役タンパク質¹²の両方を処理するs. セレビシエから保存された相撲プロテアーゼである。UTAG 試薬は、Ulp1's 相撲加工における触媒性システイン (C580S) の変異が相撲の切断を防ぐだけでなく、相撲共役タンパク質を高いものとして偶然という観測に基づいて開発されました。アビディティ¹².簡単にするために、我々は、UTAG (UD タグの略) として、このカルボキシ末端末端相撲トラッピング Ulp1 (C580S) 断片を言及しました。UTAG は、相撲修飾タンパク質の単離と検出に使用される、抗相撲抗体の有用な代替手段を表す組換え汎相撲の捕捉タンパク質である。重要なことに、それは具体的には、相撲の1つまたは複数のエピトープだけでなく、ネイティブに折り畳まれた相撲を認識しています。UTAG のタンパク質安定性と相撲の結合強度の両方を向上させるために、ストレス耐性酵母Kluyveromyces marxianus (Km) から UTAG の変種を生成した。KmUTAG は、相撲-コンジュゲートをナノモルアフィニティ¹³と緊密に結合します。さらに、kmUTAG は、高温 (42 ° c)、還元剤 (5 mM TCEP-トリス (2-carboxyethyl) 塩酸ホスフィン)、denaturants (最大 2 M 尿素)、酸化剤 (0.6% 過酸化水素)、および非イオン性洗剤に対して耐性があります。このストレス耐性は、過酷な浄化条件と長時間のインキュベーション時間の間に有益であり、その安定性と相撲捕獲活性を保証します。しかし、KmUTAG の相撲捕獲活動は、システイン修飾試薬やイオン性洗剤、完全に変性したタンパク質抽出物とは互換性がありません。KmUTAG の顕著な親和性および特性は、この試薬が複数の種に sumoylated タンパク質の研究のための標準的なレパートリーの一部となる可能性があることを示す。

ここでは、組換え蛍光 mCherry-KmUTAG 融合タンパク質 (kmUTAG) を使用して、哺乳動物細胞および線虫における相撲修飾タンパク質を検出する簡単な方法を提供します。

Protocol

1. 組換え KmUTAG-FL 相撲捕集タンパク質を用いた固定組織培養細胞における相撲検出

1. 6ウェル TC プレートの 22 mm の丸カバースリップの組織培養細胞を 70% – 80% のコンフルエントになるまで成長させます。6ウェルプレートでステップ 1.2 ~ 1.8 を実行します。
2. DPBS 1ml (ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水) で細胞を簡単に洗浄する
3. 固定のために、4% パラホルムアルデヒド (PFA) 溶液 (DPBS で希釈) の新鮮な溶液を調製します。細胞を固定するには、各ウェルに DPBS の 2 mL 4% PFA を追加します。室温で20分間細胞をインキュベートします。注: PFA を使用するすべてのステップは、ラボの安全フードで実行する必要があり、PFA は適切に配置する必要があります。
4. プレートを nutating ながら 1 mL DPBS で固定した細胞を3倍洗浄し、各洗浄を5分間行います。
5. 細胞を透過処理には、DPBS で 0.1% トリトン X-100 で15分間インキュベートします。
6. プレートを nutating ながら 1 mL DPBS で細胞を3倍洗浄し、各洗浄は5分間
7. 10の s の 0.1 M のグリシン-HCL (pH 2.0) の500μ l の細胞をインキュベートし、その後、15倍の相撲プロテアーゼバッファー (SPB) の500μ l で pH を直ちに中和します。
8. Nutating プレート、5分、各洗浄しながら、1 mL DPBS の細胞を3倍に洗います
9. 井戸からカバースリップを取り出し、湿度室に置きます。次に、カバースリップのインキュベーションを次のように進めます。
   1. UTAG-fl 染色のみ: 1 μ g UTAG を、チューブ内に 5mm TCEP を含む 1x SPB の100μ l で混合し、カバースリップ上の細胞にミックスをピペットで入れ、室温で湿度チャンバ内で1時間インキュベートします。
   2. 必要に応じて、UTAG および抗 SUMO1 抗体共染色のために、以下を続行する。
      1. チューブ1μ g UTAG および0.5 μ l SUMO2/3 8A2 (開発研究ではハイブリドーマバンク⁹) を100μ l のブロッキングバッファーに入れ、ミックスをカバースリップにピペットで移し、室温で1時間インキュベートします。
      2. 1回の洗浄で200μ l DPBS、5分間カバースリップで細胞を洗浄します。
      3. チューブ0.5 μ l 抗マウスアレクサ Fluor 488 共役抗体を100μ l ブロッキングバッファーに混合し、カバースリップに混合物をピペットで移し、室温で1時間インキュベートします。
10. カバースリップを洗浄するには、各カバースリップにピペット200μ l の DPBS を入れ、10分間放置します。洗浄をさらに2回繰り返します。
11. 最後の洗浄からカバースリップを削除し、取り付け媒体の滴で、事前に洗浄された顕微鏡のスライド上にそれを反転させます (材料の表を参照してください)。
12. 顕微鏡で見る前に-20 ° c のフリーザーで一晩保管してください。DAPI (DNA)、テキサス・レッド (kmUTAG)、および Alexa Fluor 488 (オプションの SUMO2/3 共染色が行われている場合) に適したフィルターセットを使用して、可視化します。

2. UTAG を使用して固定線虫腺の相撲検出

1. 成人 hermaphrodites を、ポリ L-リジンで被覆されたプラス帯電スライド上の8μ l 液滴の卵緩衝液¹⁴に移す。27.5 G 針を使用して、ワームから生殖腺を解放します。抗体ラベリングまたは UTAG-fl ラベリングを続行します。
2. 抗体標識サンプルについては、次の手順に従います。
   1. 液体窒素中でサンプルを凍結クラックし、Coplin 瓶内で-20 ° c のメタノール中で一晩固定します。
   2. また、Coplin では、1個の PBS でスライドを3回洗浄し、その後、0.5% BSA および 0.1% トゥイーンスパンを含む PBS で20分間ブロックします。
   3. 試料を覆う各スライドに30μ l の抗相撲6F2 抗体 (1:10) を加えます。4° c の湿度室で一晩インキュベートします。
      注: 相撲6F2 はハイブリドーマバンク¹⁵の発達研究から得られた。
   4. Coplin 瓶の中で、1個の PBS で2分間スライドさせると、30μ l の DyLight 488 ヤギ抗マウス二次抗体 (1:200) を室温の湿度室で1.5 時間、試料を覆い、インキュベートします。
   5. Coplin の瓶で、1個の PBS で2分間スライドさせることで、dH₂0 で素早くディップし、取り付け媒体でスライドをマウントします (「材料の表」を参照)。
3. KmUTAG-fl ラベリングについては、次の手順に従ってください。
   1. 細胞を固定するには、最終濃度 4% PF のサンプルに 8% PF のボリュームを1つ追加します。湿度室で10分間固定し、0.1 M グリシンを有する 1x PBS を含む Coplin 瓶に少なくとも5分間スライドを移して反応をクエンチする。
   2. Coplin 瓶では、細胞を 1x PBS で5分間洗浄し、その後、10分間 0.1% トリトン X を含む 1x PBS 中のサンプルを透過処理します。
   3. Coplin 瓶を 1x PBS で5分以上洗浄し、スライド上のサンプルに 0.1 M グリシン-HCl (pH = 2.0) の200μ l を10秒間添加します。すぐに pH を中和するために 10x SPB の200μ l を加えてください。
   4. スライドを Coplin 瓶に入れた 1x PBS で5分間洗浄します。
   5. ウォッシュとピペットからスライドを削除し、100μ l の 1x SPB + 5mM TCEP を線虫の UTAG の2μ g を含む、スライド上の虫に、揺れなしで1時間湿度室でインキュベートします。
   6. スライドを Coplin ジャーに戻し、1x PBS で15分間洗浄します。
   7. スライドを洗浄から取り出し、実験室用ワイプを使用してサンプルの周囲を乾燥させてから、5μ l の取り付け媒体 (材料の表を参照) でスライドを取り付けます。スライドは4° c で保管してください。DAPI (DNA)、テキサス・レッド (kmUTAG)、DyLight 488 (SUMO2/3) に該当するフィルター・セットを使用して可視化します。

Results

KmUTAG-fl は、組み換え、mCherry タグ付きの相撲トラッピングタンパク質です。KmUTAG を作製するために、コドン最適化された mCherry kmUTAG を pSPOT1 細菌過剰発現プラスミドにクローニングした (図 1)。誘導後、kmUTAG タンパク質をスポットトラップ上で精製し、溶出し、さらに使用するまで凍結した。KmUTAG の相撲捕獲活動を確実にするために、SUMO1 に結合したビーズと、相撲猫融合タンパク質の沈殿 (図には示されていないが、前の作業¹³を参照してください) への拘束力を確認しました。

固定 PNT2 細胞と共にインキュベートされた KmUTAG は、適切なフィルターセット (クロマ) と、Epifluorescent ツァイス Axioplan 顕微鏡上の100x 油浸目的 (

Discussion

ここでは、固定された哺乳動物細胞における相撲の機能研究のための組み換えタンパク質である kmUTAG の使用について紹介し、線虫生殖腺を解剖した。KmUTAG は、相撲をコンジュゲートしたタンパク質と相撲チェーンを認識し、トラップするストレス耐性の pan 相撲特異的試薬です。相撲の三次構造が高度に保存されているため、追加モデルや非モデル系からの相撲の変種を kmUTAG 試薬で分析できる可能性が高い。そのため、KmUTAG-fl は、従来の抗体染色プロトコルのための有用な代替または二次試薬を表すことができる。

炭水化物の検出のためのレクチンと同様にタンパク質のインビボ標識のためのアプタマーヌクレオチドおよび affimer ペプチドを含む非抗体代替の使用のための十分な前例があります^{16,17,18 、19}。さらに、affime...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% パラホルムアルデヒド (ホルムアルデヒド) 水溶液	電子顕微鏡 科学	30525-89-4
6 ウェル 細胞培養プレート	ジェネシー サイエンティフィック/オリンパス プラスチック	25-105
アレクサ フルーア 488 アフィニピュア ヤギ 抗マウス IgG (H+L)	ジャクソン イムノリサーチ	115-545-003	マウス モノクローナル抗体 DPBS の二次抗体として使用
、カルシウムなし、なしマグネシウム	フィッシャーサイエンティフィック	Gibco 14190144
Dylight 488 コンジュゲート アフィニピュア ヤギ アンチムー IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	マウスモノクローナル抗体の二次抗体として使用
成長用フィッシャーブランド カバーグラス	ッシャーブランド	12545101
FLUORO-GEL II と DAPI	、電子顕微鏡 Sciences	50-246-93)	ステップ1.11の封入剤
FLUORO-GEL with DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	with DAPI added to 1 & micro;g/mL;ステップ 2.2.5
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-FL	Kerafast		KmUTAG 試薬は、Kerafast.com
Oneblock Western-CL ブロッキングバッファー	Prometheus	20-313
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher で入手できますBioReagents	BP3994
PNT2細胞株	Sigma-Aldrich	95012613	正常な前立腺上皮はSV40で不死化しました。
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 は、Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 抗体 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2 によって DSHB に寄託されました。	SUMO-2 8A2 は Matunis, M. によって DSHB に寄託されました (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	DPBS/PBS の 0.1% での透過処理に使用 (ワーム用)