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方法論記事

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

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DOI：

10.3791/59593

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2019年9月5日

 , 
1Blood Cell Development and Function Program, Fox Chase Cancer Center

この記事について

サマリー

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

要約

健康なマウスとMLL-AF9によって駆動されるAMLを有するマウスから、様々な生きた骨髄(BM)由来の幹および前駆細胞集団におけるミトコンドリアROSを分析するためのフローサイトメトリックアプローチを提示する。具体的には、健康または白血病BM細胞がミトコンドリアスーパーオキシドを検出するフルオロゲン性色素で最初に染色され、続いて使用されるフルオロクロム結合モノクローナル抗体による染色を行う2段階の細胞染色プロセスについて説明します。様々な健康で悪性の前駆体集団を区別する。また、フローサイトメトリーによるサンプルの取得と分析に関する戦略も提供しています。プロトコル全体は、3-4時間の短い時間枠で行うことができます。我々はまた、フローサイトメトリーによるフルオロゲン染料を用いた生造血および白血病の幹および前駆体のミトコンドリアコンパートメントにおけるROS産生のモニタリングの利点と限界を考慮すべき重要な変数を強調する。.さらに、ミトコンドリアROSの豊富さが、明確な健康なHSPCサブ集団と白血病前駆体の間で変化するデータを提示し、血液学的研究におけるこの技術の可能な応用について議論する。

概要

活性酸素種(ROS)は、分子酸素由来の反応性の高い分子です。ROS産生の最も明確に定義された細胞位置はミトコンドリアであり、酸化リン酸化(OXPHOS)中に電子輸送鎖(ETC)を通過する電子が特定の形成につながる分子酸素によって吸収されるスーパーオキシド1と呼ばれるROSの種類。スーパーオキシドジスムターゼまたはSODと呼ばれる一連の酵素の作用を通じて、スーパーオキシドは過酸化水素に変換され、その後、カタレーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)などの酵素によって水に中和されます。ROS調節機構の摂動は、多くの場合、高分子損傷(すなわち、DNA、タンパク質、脂質)などの有害で潜在的に致命的な細胞の結果を有する酸化ストレスと呼ばれるROSの過剰産生につながる可能性があります。さらに、酸化ストレスは、糖尿病、炎症性疾患、老化および腫瘍2、3、4などのいくつかの病理に関連している。酸化ホオスタシスを維持し、酸化ストレスを防ぐために、細胞は様々なROS調節機構を有する5.

特定のROSの生理学的レベルは、適切な胚および成人のヘマトポエシス6に必要である。しかし、過剰なROSは、造来茎および前駆体プールのDNA損傷、細胞分化および枯渇に関連している。また、レドックス生物学の変化は、白血病と健康な細胞の間で異なる可能性があるという証拠もあります。例えば、ROSレベルは、彼らの健康な相手に対して急性骨髄性白血病(AML)細胞で高くなる傾向があり、他の研究は、白血病幹細胞が生存7、8のためにROSの低定常状態レベルを維持することを示唆している。重要なことに、これらの酸化還元の違いを治療的に活用するための戦略は、いくつかのヒト癌の設定9、10で約束を示している。したがって、マウスモデルにおけるROSレベルの評価を可能にするアッセイは、これらの種が細胞生理学および疾患病因にどのように寄与するかについての理解を改善し、潜在的に有効性を評価するためのプラットフォームを提供する可能性がある。新しいレドックスターゲティング抗癌療法。

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プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての動物の手順は、フォックスチェイス癌センターの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。

注:プロトコルワークフローは図1に示すように4つの部分に分かれており、必要な試薬は材料の表に記載されています。

1. 骨髄(BM)分離

注:MLL-AF9白血病マウスは、前述の11として生成された。

  1. 前述の12、13、14、15、野生型C57.Bl6マウス(CD45.2先天性マーカーを発現する)およびC57から、単核骨髄細胞を回収する。MLL-AF9発現白血病細胞(CD45.2+)で移植したBl6-SJLマウス(CD45.1前生細胞を発現する)。
    注:BMは、12、13を粉砕するか、または骨14、15を洗い流すことによってマウスから回収することができる。ここで提示された実験では、BMは、フラッシングを介して健康マウスと白血病マウスの両方から回収された。

2. ミトコンドリアROSフルオロゲン染料染色

  1. 単核骨髄細胞が健康なマウスおよび/または白血病マウスから回収されたら、トリパンブルーで細胞のアリコートを染色し、血球計を使用してカウントして、総BM細胞の開始数を決定します。
  2. 細胞を300 x gで5分間遠心分離し、F-PBS(PBSは2%の胎児牛血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンカクテルを補充)でペレットを再ステーペンし、2 x 106細胞/mLの濃度にします。
  3. 次のようにラベル付けされた9つの単色制御チューブにチューブあたりの細胞懸濁液のAliquot 200 μL:
    汚れなし、B220-Cy5-PE、cKit-Cy7-APC、Sca1-PacBlue、CD150-APC(健康なHPCのみ)、CD45.2-APC(白血病細胞のみ)、CD34-FITC、ミトコンドリアROS染料および生死細胞染色。
    注:(オプション)ミトコンドリアROSの誘導に対する陽性対照は、5%CO2インキュベーターで37°Cで1時間のメナジオンナトリウムビスルボディ(MSB)の20μMで200μLで2x105細胞を処理することによって調製することができる。ミトコンドリアROSのMSB媒介誘導を逆転させる第2の制御は、MSBの20μMに加えて100 μM N-アセチル-L-システイン(NAC)を5%CO2インキュベーターで1時間100μMで200μLで2x105細胞を処理することによって調製することができる。
  4. チューブ(実験管)の残りの細胞をアリコートし、遠心分離機を300 x gで5分間使用します。
  5. 製造元の指示に従って、生きている/死んだ細胞の汚れでF-PBSの細胞を再中断する。氷の上で30分間インキュベートし、単色のコントロールチューブに生きた/死んだ汚れを加えるようにしてください。
  6. 生きた/死んだ色素で染色された単色および実験管の両方に室温(RT)F-PBSの1.0 mLを加える。RTで300 x gで遠心分離機5分。
  7. ミトコンドリアROS色素の50μgをジメチルスルホキシド(DMSO)の13μLで再中断し、5mMストック溶液を得た。
  8. ベラパミル(50μM)の有無にかかわらずRT F-PBSで5μMの最終濃度にミトコンドリアROS色素を希釈します。
  9. 生きている/死んだ細胞の汚れの洗浄を吸引する。各実験チューブにベラパミルを含むミトコンドリアROS染料染料染色剤200μLを加え、ミトコンドリアROS染料単色制御チューブを追加します。
  10. 渦は、暗闇の中で37°Cで10分間混合し、インキュベートする。
  11. ミトコンドリアROS染色シングルカラーコントロールおよび実験チューブにRT F-PBSの1.0 mLを追加します。RTで300 x gで遠心分離機5分。
  12. 上清を吸引し、RT F-PBS の追加の 1.0 mL で細胞を洗浄します。RTで300 x gで遠心分離機5分。

3. リネージ抗体染色

  1. 表1に記載されている抗体カクテルを準備する。
    注:これらの抗体カクテルは、以前に14、15、16に最適化されている。
  2. 健康なBMを含む実験チューブの最終ミトコンドリアROS色素洗浄から上清を吸引し、各チューブに200μLの抗体カクテル#1を加える。混ぜる渦。また、単色制御チューブを準備します。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。
  3. 白血病BMを含む実験管の最終ミトコンドリアROS色素洗浄から上清を吸引し、各管に200μLの抗体カクテル#2を加える。混ぜる渦。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。
  4. RTで300 x gで1.0 mLの冷たいF-PBSおよび遠心分離機5分で洗う。
  5. 冷たいF-PBSの500 μLの細胞を再中断し、凝集体を除外するために40 μmフィルターを使用して流れサイトメーターチューブ内の細胞をろ過する。

4. フローサイトメトリーの取得と分析

注:いくつかの造血幹細胞および前駆体のサブセットは、長期造血幹細胞などまれである。したがって、理想的には、様々なHSPCサブセット内のミトコンドリアROSの十分な分析のために、フローサイトメトリー獲得時に各実験管に対して3〜500万のイベントを収集する必要があります。

  1. 無染色制御チューブを使用して、分析された細胞集団の大きさと複雑さに基づいて前方(FSC-A)と側(SSC-A)散布プロットを設定します。
  2. 無染色および単色制御管を使用して、フローサイトメーターを補正します。
  3. 前方および側面散乱プロットから余分な破片をゲートアウトします(図2A,B、左から最初のパネル)。
  4. 前方識別子などの二重識別子を使用して二重にゲートアウトします(図2A、B、左から2番目のパネル)。
  5. 図2A、Bで提案されているゲーティング戦略に従って、生細胞、系統低細胞および様々なHSPCおよび白血病サブセットを選択する。
  6. 対象の各集団について、ヒストグラムプロットにおけるTRPEチャネル(x軸)の中央値蛍光強度(MFI)を分析し、ミトコンドリアROSシグナルの違いを評価します(図3A-C、左パネル)。ミトコンドリアROSのレベルは、散布図中のミトコンドリアROS染色と特定の系統マーカーを比較することによって単一細胞レベルで評価することができる。

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結果

提示されたのは、複数の健康およびMLL-AF9発現白血病前駆体のミトコンドリアにおけるROSを分析する方法である。図 1は、4 つの主要なステップで構成されるプロトコル ワークフローの概略図を示します: 1) マウスからの BM 分離;2)ミトコンドリアROS、特にスーパーオキシドを認識するフッ素色素でBM細胞を染色する。3)様々な健康および白血病血化集団を線引きする表面マーカー抗体染色;そして4)フローサイトメトリーの獲得と分析。

図 2A,Bは、健康で白血病BMにおける様々な造血幹細胞および前駆体集団を分析するための代表的なゲーティング戦略を示す。破片を除去するために FSC/SSC プロットが適用され、FSC 領域 (FSC-A) 対 FSC 高さ (FSC-H) プロットを使用して、二重子と凝集体を除外します。系統表面マーカー(表1およびステップ3.1)のパネルは、リンパ球、赤血球、顆粒球...

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ディスカッション

ROSの検出のために開発されたフルオロゲン染料は、フローサイトメトリー22により顕微鏡検査または生細胞中の固定細胞において頻繁に評価される。ミトコンドリアROSフルオロゲン染料を用いてBM細胞内のミトコンドリアROSのフローサイトメトリック評価には2つの大きな利点があります:1)生細胞分析に適した高速かつ簡単な技術であり、2)希少な区別と分析を可能にします。表面マーカー染色を使用してBMの単一細胞レベルでの集団。ここで提示されるステップバイステッププロトコルは、正常なマウスとフローサイトメトリーを用いたMLL-AF9によって駆動されるAMLのマウスモデルと同様に、造来性幹および前駆体集団の外生性レドックスステータスを研究するために開発された。このプロトコルの実行中に考慮する必要がある重要な技術的変数がいくつかあります。

第一に、プロおよび抗酸化コントロールの使用は、ユーザーがミトコンドリアROS染色の増加のためのベースラインを確立するだけでなく、染色の特異性を可能にする。ここで提示されたプロトコルについては、プロオキ...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、フォックスチェイス癌センター理事会(DDM)、米国血液学会学術賞(SMS)、米国癌学会RSG(SMS)および国防総省(賞#:W81XWH-18-1-0472)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
熱不活化 FBSVWR Seradigm LIFE SCIENCE97068-085メディア
ペニシリン ストレプトマイシンコーニング30-002-CIメディア
PBSフィッシャーサイエンティフィックBP399-20バッファー
15 mL コニカルチューブBD ファルコン352096組織培養
50 mL コニカルチューブBD ファルコン352098ティッシュカルチャーサプライ
40 μm細胞ストレーナーフィッシャーサイエンティフィック22-363-547組織培養用品
RBC溶解バッファーフィッシャーサイエンティフィック50-112-9751組織培養用品
メナジオン亜硫酸水素ナトリウムシグマアルドリッチM5750酸化促進
剤NACシグマアルドリッチA7250抗酸化剤
CD3 PE-Cy5クローン 145-2c11バイオレジェンド100310抗体
CD4 PE-Cy5 クローン RM4-5eBioscience15-0041-81抗体
CD8 PE-Cy5 クローン 53-6.7eBioscience15-0081-81抗体
CD19 PE-Cy5 クローン 6D5Biolegend115510抗体
B220 PE-Cy5 クローン RA3-6B2Biolegend103210抗体
Gr1 PE-Cy5 クローン RB6-8C5Biolegend108410抗体
Ter119 PE-Cy5 クローン Ter-119Biolegend116210抗体
CD48 PE-Cy5 クローン HM48-1Biolegend103420抗体
CD117 APC-Cy7 クローン 2B8Biolegend105825抗体
Sca1 peacific Blue clone D7Biolegend108120抗体
CD150 APC clone TC15-12F12.2Biolegend115909抗体
CD34 FITC クローン RAM34BD Bioscience553733抗体
CD45.2 APC clone 104Biolegend1098313抗体
MitoSOX赤サーモフィッシャーサイエンティフィックM36008染料
Mitotracker グリーンサーモフィッシャーサイエンティフィックM7514染料
ライブ/デッド イエロー染料サーモフィッシャーサイエンティフィックL34967染料

参考文献

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