シロイヌナズナの底部のシンク組織に装填された CFDA トレーサーの Shootward 運動

サマリー

このプロトコルの目的は、シロイヌナズナの底部の異なるサイトに CFDA をロードする方法を示すことです。次に、シュートで CF の結果の分布パターンを提示します。

要約

Symplastic トレーサー 5 (6)-carboxyfluorescein スジ (CFDA) は、細胞間接続、師部輸送、血管パターニングを実証するために、生きた植物に広く適用されています。このプロトコルは、それぞれルート切断と胚軸の手順を使用して、シロイヌナズナ内の下から上の CARBOXYFLUORESCEIN (CF) の動きを示します。これらの2つの異なる手順は、CF の動きの異なる効率をもたらします: 約 91% 胚軸での芽の CF の外観, 一方、根切断手順で CF の約 70% の外観.ローディングサイトの単純な変更は、この symplastic 染料のモバイル効率の著しい変化をもたらし、CF の動きは、おそらく根胚軸接合部によって、symplastic 規制の対象となるかもしれないことを示唆している。

概要

5 (6)-carboxyfluorescein (CF)¹、8-hydroxypyrene-1、3、6-trisulphonic 酸²、ルシファーイエロー CH (LYCH)³、Esculin および結実⁴などのスペクトル特性の範囲を有する多くの蛍光トレーサーが開発され、symplastic の動きおよび師部の活動を監察するために植物で適用される。一般的には、symplastic 色素を標的組織の切断に装填し、レポーターを植物の他の部分に順次分散させることで、細胞間通信を実証することができます。色素吸収のメカニズムは完全には解明されていないが、生細胞内の CF 運動の根底にある原理は広く認められている。CF (CF スジ、CFDA) のエステル形態は非蛍光性であるが、膜透過性である。この特性は、色素の細胞への迅速な膜拡散を可能にします。生きた細胞の中で一旦、細胞内エステラーゼは、CFDA の 3 ' および 6 ' 位置で酢酸基を除去し、蛍光および膜非透過性 CF を放出する (図 1、またはライト et al.²を参照)。CF は、plasmodesmata を通って植物の他の部分に移動することができます。

プロトコル

1. MS 培地のシロイヌナズナ垂直成長

1. 層流キャビネットの内部は、使用前に30分の UV 光と15分の気流で処理する必要があります。UV ライトが点灯しているときは、必ずガラス扉を閉めてください。すべての工具とプレートを 70% のエタノールでスプレーしてから、キャビネットに入れます。
2. Murashige および Skoog (MS) 媒体を層流キャビネットの下の標準的な 90 mm のペトリ皿で準備しなさい。
   注: MS 媒体には、次のコンポーネントが含まれています。 20.6 mm NH₄NO₃, 18.8 mm KNO₃, 1.25 mm KH₂PO₄, 1.5 MM MgSO₄· 7h₂o, 3 mM CaCl₂· 2h₂o, 0.1 mm MnSO₄·H₂o, 1.03 μ m Na₂MoO₄・ 2h₂o, 0.1 mM H₃BO₃, 30 μ m ZnSO₄・ CuSO 2 o, 0.1μ m 4 ・....

結果

Symplastic 運動はしばしば環境変動の対象となる。植物成長状態の摂動、および組織調製のプロセスさえも、plasmodesmata のサイズ排除限界に影響を与え、従って symplastic 輸送²²に影響を与える。染色効率を向上させるために、温度と水分が厳重に管理されている成長室での作業を制限し、また、可能な限り迅速に (ペトリ皿の蓋を持ち上げてから10-15 分以内) 全体の手順を実行します。実験中にこれらの予防措置は、効果的にシュート染色の失敗率を減少させることができます。

我々は、CF シュートワード運動を実証するために、わずかに異なる2つの手順を説明した。通常、両方の手順は、摂食後約2時間のシュートにおける CF 染色につながる可能性がある (図 2)。それにもかかわらず、2つの手順は異なる染色効率をもたらします。胚軸によって、9.......

ディスカッション

新たな研究は、植物が迅速に実験手順²²に導入された操作を含む外部刺激²³に応答することができることを示している。最初の実験では、この知識の見落としはしばしば染色の失敗につながります。これらのレッスンでは、この実験を行う際に次の注意事項を念頭に置くことをお勧めします。 (1) 収穫後の種子は、低温と低水分に設定された貯蔵庫に保管する必要があります。(2) 植物の操作、特にキャビネット内の空気への暴露は、最小限の時間に抑える必要があります。(3) 実験条件は一定に保つ必要があります, 例えば, すべての手順は、成長室で実行する必要があります.

指摘する必要があるこの実験のもう一つの側面は、CFDA の積載量をできるだけ小さく保つべきであるということです。過剰な溶液は、しばしば過剰な CFDA 溶液が毛管作用を通してシュートまで拡散することができ、それによって若いシンクの葉の毛状を着色するアーチファクトにつながる。イメージング前に洗浄手順を実行すると、このアーティファクトが減少する可能性があり.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
KNO3	シノファーム化学試薬	10017218
KH2PO4	Sinopharm 化学試薬	10017608
MgSO4·7H2O	Sinopharm 化学試薬	10013018
CaCl2·2H2O	Sinopharm 化学試薬	20011160
MnSO4·H2O	シノファーム化学試薬	10013418
Na2MoO4·2H2O	Sinopharm化学試薬	10019818
ホウ酸	Sinopharm化学試薬	10004818
ZnSO4·7H2O	Sinopharm 化学試薬	10024018
CuSO4·5H2O	Sinopharm 化学試薬	10008218
CoCl2·6H2O	Sinopharm化学試薬	10007216
KI	Sinopharm化学試薬	10017160
FeSO4·7H2O	Sinopharm 化学試薬	10012118
EDTA	シノファーム化学試薬	10009717
NaOH	シノファーム化学試薬	10019718
KOH	シノファーム化学試薬	10017018
ショ糖	シノファーム化学試薬	10021418
ミオイノシトール	マックリン	I811835
ニコチン酸	マックリン	N814565
ピリドキシンHCl	マックリン	V820447
チアミンHCl	マックリン	T818865
グリシン	マックリン	G800880
寒天粉末	ノヴォン	ZZ14022
蛍光顕微鏡	ツァイス	アクシオズーム V16
解剖顕微鏡	SDPTOP	SRE-1030
200μ;lピペット	ドラゴン実験室の器械	713111110000-20-200ul
2.5μlピペット	Eppendorf	3120000011
Fine 鉗子	ピンセット	ST-15
パラフィルム	パラフィルム	PM-996
ステンレス製両面刃	ジレット	プラチナプラス 両刃

刃