方法論記事

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

DOI：

10.3791/59611

⸱

2019年6月12日

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1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion-Israel Institute of Technology, 2Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion-Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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この方法では、細菌細胞における簡潔な生きたレポーターアッセイを用いて、RNA結合タンパク質(RBP)の結合親和性を、簡潔で生きたレポーターアッセイを用いて認知および非認知結合部位に定量する。アッセイはレポーター遺伝子の抑圧に基づいています。

要約

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タンパク質翻訳の開始ステップでは、リボソームはmRNAの開始領域に結合する。翻訳開始は、リボソーム結合を妨げるmRNAの開始領域へのRNA結合タンパク質(RBP)の結合によって遮断されうる。提示された方法では、このブロッキング現象を利用して、その認知部位および非認知結合部位に対するRBPの結合親和性を定量化する。これを行うには、レポーターmRNAの開始領域に試験結合部位を挿入し、試験RBPの発現を誘導する。RBP-RNA結合の場合、RBP濃度の関数としてレポーター発現のシグモイド式の抑圧を観察した。結合部位とRBPとの間に親和性がないか、または非常に低い親和性の場合、有意な抑圧は認められなかった。この方法は、生きた細菌細胞で行われ、高価な機械や洗練された機械を必要としません。これは、細菌で機能する異なるBRBの結合親和性を、設計された結合部位のセットと定量化し、比較するのに有用である。この方法は、構造の複雑度が高い部位をバインドする場合には不適切な場合があります。これは、RBPが存在しない場合に複雑なmRNA構造によるリボソーム開始の抑圧の可能性に起因し、これは基底レポーター遺伝子発現を低下させ、したがってRBP結合時に観察可能なレポーターの抑圧をもたらす。

概要

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RNA結合タンパク質(RBP)ベースの転写後調節、特にRBPとRNAとの相互作用の特徴付けは、ここ数十年で広範囲に研究されている。RbP阻害に起因する細菌における翻訳下調節の複数の例があり、または直接競合する、リボソーム結合1、2、3。合成生物学の分野では、RBP-RNA相互作用は転写ベースの遺伝回路4、5の設計のための重要なツールとして出現している。従って、このようなRBP-RNA相互作用の特性化に対する需要が細胞コンテキスト内で増加している。

タンパク質-RNA相互作用を研究するための最も一般的な方法は、インビトロ設定に限定される電気泳動シフトアッセイ(EMSA)6、およびCLIP法8、9を含む様々なプルダウンアッセイ7である。.このような方法は、デノボRNA結合部位の発見を可能にする一方で、労働集約的なプロトコルや高価な深いシーケンシング反応などの欠点に苦しんでおり、RBPプルダウンに対する特定の抗体を必要とする場合があります。RNAがその環境に対して感受性を持つため、多くの因子がRBP-RNA相互作用に影響を与える可能性があり、細胞コンテキストにおけるRBP-RNA結合を調知することの重要性を強調する。例えば、我々と他の人は、インビボとインビトロ10、11におけるRNA構造の間に有意な差を示した。

以前の研究12のアプローチに基づいて、我々は最近、バクテリオファージGA 13、MS214、PP715、およびQβ16からカプシドRBP用に事前に設計された結合部位を配置する際に10を実証した。レポーターmRNAの翻訳開始領域は、レポーター表現が強く抑圧されている。この抑圧現象に基づいて比較的単純で定量的な方法を提示し、生体内のRBPと対応するRNA結合部位との間の親和性を測定する。

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プロトコル

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1. システムの準備

  1. 結合部位プラスミドの設計
    1. 図 1に示すように、バインディング サイト カセットを設計します。各ミニ遺伝子は、以下の部分(5'〜3'):Eagl制限部位、カナマイシン(Kan)耐性遺伝子の5'末端の40塩基、pLac-Araプロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー(δ)、RBP結合部位、5'末端の80塩基を含むmCherry遺伝子、およびApaLI制限部位の。
      注:アッセイの成功率を高めるために、各結合部位に対して3つの結合部位カセットを設計し、スペーサーは少なくとも1つ、2つ、および3つのベースで構成される。その他のガイドラインについては、「代表的な結果」セクションを参照してください。
  2. 結合部位プラスミドのクローニング
    1. 結合部位カセットを二本鎖DNA(dsDNA)ミニ遺伝子として注文します。各ミニ遺伝子は500bpの長さで、それぞれ5'と3'の端にEagl制限部位とApaLI制限部位が含まれています(ステップ1.1.1を参照)。
      注:本実験では、カナマイシン遺伝子の半分を含むミニ遺伝子を、陽性コロニーのスクリーニングを容易にするよう命じた。しかしながら、ギブソンアセンブリ17もまた、ここで適しており、その場合、結合部位は2つのより短い相補的な一本鎖DNAオリゴとして発注することができる。
    2. 制限プロトコル18によりEagl-HFおよびApaLIを用いてミニ遺伝子と標的ベクターの両方を二重消化し、カラム精製19.
    3. 消化されたミニ遺伝子を、残りのmCherryレポーター遺伝子、ターミネーター、およびカナマイシン耐性遺伝子20を含む結合部位バックボーンにライゲートする。
    4. ライゲーション溶液を大腸菌TOP10細胞21に変換する。
    5. サンガーシーケンスを使用して正の形質転換体を識別します。
      1. 対象地域に上流のプライマー 100 基を設計します (プライマー シーケンスについては、表 1を参照してください)。
      2. ミニプレップいくつかの細菌のコロニー22.
      3. プライマーの5 mM溶液の5 μLと80 ng/μL濃度でDNAの10 μLを調出します。
      4. 2 つのソリューションをサンガー シーケンシング23の便利な施設に送信します。
    6. 精製プラスミドを-20°Cで貯蔵し、グリセロールストック24として細菌株を、いずれも96ウェル形式で保存する。DNAは、4つの融合RBPプラスミドのいずれかを含む大腸菌TOP10細胞への形質転換に使用されます(ステップ1.3.5参照)。
  3. RBPプラスミドの設計と建設
    注:本研究で用いられるコートタンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列は表2に記載されている。
    1. 制限部位を持つストップコドンを欠くカスタムオーダーdsDNAミニジーンとしてストップコドンを欠いている必要なRBP配列を注文します(図1)。
    2. 試験済みのRBPを、誘導性プロモーターの直下流に停止コドンを欠き、開始コドンを欠く蛍光タンパク質の上流(図1)を、ステップ1.2.2-1.2.4と同様にクローンする。RBPプラスミドに結合部位プラスミドとは異なる抗生物質耐性遺伝子が含まれていることを確認してください。
    3. ステップ 1.2.5 と同様に、Sanger シーケンスを使用して正の変換体を識別します (プライマー シーケンスについては表 1を参照)。
    4. 1つの正の形質転換剤を選択し、それを化学的に有能な25にする。グリセロール精製プラスミドを-20°C、96ウェルプレートで-80°Cで-80°Cの細菌株24のグリセロールストックとして保存する。
    5. 96ウェルプレートに保存された結合部位プラスミド(ステップ1.2.6から)を、RBP-mCeruleanプラスミド21を既に含む化学的に有能な細菌細胞に変換する。時間を節約するために、ペトリ皿に細胞をめっきする代わりに、ルリア・ベルタニ(LB)26寒天を含む8レーンプレートに8チャンネルのピペッターを使用して、関連する抗生物質(カンとアンプ)を使用してプレートを付けます。コロニーは16時間で現れるはずです。
    6. 各二重形質転換剤に対して単一のコロニーを選択し、関連する抗生物質(カンおよびアンプ)とLB培地で一晩成長し、96ウェルプレートで-80°Cでグリセロールストック24として保存します。

2. 実験設定

注:ここで提示されるプロトコルは、インキュベーターおよびプレートリーダーと組み合わせて液体処理ロボットシステムを用いて行った。各測定は、24のインデューサー濃度について行い、各株+インデューサーの組み合わせに対して2つの複製を用いて行った。このロボットシステムを用いて、24のインデューサー濃度を有する1日あたり16株のデータを収集した。しかし、このようなデバイスが利用できない場合、または必要な実験が少ない場合は、8チャンネルのマルチピペットを使用して、それに応じてプロトコルを適応させることが容易に行えます。例えば、12インデューサー濃度と4つのタイムポイントを有する1日あたり4株の予備結果は、このように取得された。

  1. 調製は、予め、0.5gのトリプトン、0.3mLのグリセロール、5.8gのナクル、1M MgSO4の50mL、10倍リン酸緩衝生理食生(PBS)バッファーpH7.4、および950mLの二重蒸し水(DL)を混合して、1Lのバイオアッセイバッファー(BA)を調製する。オートクレーブまたは無菌フィルタBAバッファ。
  2. 適切な抗生物質(25μg/mLの最終濃度でカナマイシン、最終濃度100μg/mLでアンピシリン)を1.5mL LBで振る37°Cおよび250rpmで二重形質菌株を48ウェルプレートで、18時間(一晩)に成長させます。
  3. 午前中は、以下の準備をしてください。



    1. figure-protocol-1

    2. figure-protocol-2

    3. figure-protocol-3


  1. figure-protocol-4


  3. figure-protocol-5

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結果

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提示された方法は、mRNA分子に結合するためのRBPとリボソームとの間の競争を利用する(図1)。この競争は、インデューサーの濃度の増加に起因するRBP-mCeruleanの生産増加の関数としてmCherryレベルを減少させることによって反映されます。mCerulean蛍光を増加させる場合、mCherryに有意な変化はなく、RBP結合の欠如が推測される。正と負のひずみの両方の代表的な結果を図 2に示します。図 2Aでは、OD チャネル、mCherry チャネル、および mCerulean チャネルは、T0 = 1 h および Tファイナル= 3.5 h で、4 時間の範囲にわたって時間とインデューサーの関数として表示されます。図2Bにおいて、平均mCerulean蛍光(上)およびmCherryの...

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ディスカッション

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本稿に記載の方法は、大腸菌細胞におけるRBP-RNA結合親和性の生体内測定を容易にする。プロトコルは比較的簡単で、高度な機械を使用せずに行うことができ、データ分析は簡単です。さらに、結果は、次世代シーケンシング(NGS)結果に関連する比較的長い待ち時間なしで、すぐに生成されます。

この方法の 1 つの制限は、細菌細胞でのみ動作することです。.しかしながら、以前の研究12は、哺乳動物細胞におけるL7AE RBPに対する同様のアプローチを用いて抑圧効果を実証している。この方法の追加の制限は、mCherry開始領域における結合部位の挿入が基底mCherryレベルを抑圧しうる点である。結合部位の構造的複雑さまたは高い安定性は、RBPが存在しない場合でもリボソーム開始を妨げることができ、その結果mCherry基底レベルが低下する。基底レベルが低すぎる場合、RBPの濃度を増加させることによってもたらされる追加の抑圧は観察できません。このような場合には、開始領域にまだ結合部位を持つ結合部位カセットを設計するのが最善であるが、開始領...

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

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このプロジェクトは、計画予算委員会のI-COREプログラムとイスラエル科学財団(助成金第152/11)、マリー・キュリー再統合助成金第1号から資金を受け取りました。PCIG11-GA- 2012-321675、および補助金契約第664918号の下で欧州連合のホライズン2020研究革新プログラムから - MRG-文法。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アンピシリンナトリウム塩SIGMAA9518
硫酸マグネシウム (MgSO4)ALFA AESAR33337
48 プレートAxygenP-5ML-48-C-S
8 レーンプレートAxygenRESMW8I
96 ウェルプレートAxygenP-DW-20-C
プレートリーダー用 96 ウェルプレートPerkin Elmer6005029
ApaLINEBR0507
結合部位配列Gen9 Inc. および Twist Bioscience表 1
E. coli TOP10 細胞InvitrogenC404006
Eagl-HFNEBR3505
グリセロールBIO LAB071205
インキュベーターTECANliconicインキュベーター
Kanamycin solfateSIGMAK4000
KpnI- HFNEBR0142
LigaseNEBB0202S
液体処理ロボットシステムTECANEVO 100, MCA 96チャンネル
Matlab分析ソフトウェアMathworks
Multi- pipette 8レーンAxygenBR703710
N-ブタノイル-L-ホモセリンラクトン (C4-HSL)caymanK40982552 019
PBS bufferBiological Industries020235A
PlatereaderTECANInfinite F200 PRO
Q5 HotStart PolymeraseNEBM0493
RBP seqeuncesAddgene27121 &40650表 2
塩化ナトリウム (NaCL)BIO LAB190305
SV ゲルおよび PCR クリーンアップ システムPromegaA9281
トリプトンBD211705
を参照してください。

参考文献

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RBP RNA mRNA mCherry

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