生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

サマリー

我々は、RNA精製と組み合わせてリボソーム中の増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)のEC特異的遺伝的タグを介して、マウス脳、肺および心臓組織における血管内皮細胞(EC)からリボソーム結合mRNAを精製するアプローチを提示する。.

要約

多くの研究は、qPCRおよびRNAシーケンシングによる転写物および遺伝子発現のインビトロ分析のために、インビトロ細胞アッセイおよび全組織または動物からの特定の細胞型の単離に限定されている。複雑な組織や臓器における特定の細胞型の包括的な転写物および遺伝子発現解析は、遺伝子が調節される細胞および分子機構と組織恒常性および器官との関連を理解するために重要である。関数。本稿では、動物肺の血管内皮におけるリボソーム結合RNAを生体内で直接単離する方法論を例として示す。組織処理およびRNA精製のための具体的な材料および手順について説明し、RNAの品質と収量の評価、ならびに動脈系遺伝子アッセイのためのリアルタイムqPCRを含む。このアプローチは、リボソーム親和性精製(TRAP)技術の翻訳として知られており、複雑な組織における任意の特定のタイプの生体内で直接生体内の特定の細胞タイプの遺伝子発現およびトランスクリプトーム分析の特性評価に利用することができる。

概要

哺乳類の脳、心臓、肺などの複雑な組織では、細胞の不均一性の高いレベルは、組織サンプル全体から得られる遺伝子発現データの分析を複雑にします。生体内の特定の細胞型における遺伝子発現プロファイルを観察するために、最近新しい方法論が開発され、遺伝子決定された任意の細胞型の翻訳されたmRNA補体全体の尋問が可能になった。この方法論は、翻訳リボソーム親和性精製(TRAP)技術1、2として知られている。これは、動物の他の血管新生関連遺伝子を遺伝的に操作する場合、内皮細胞生物学と血管新生を研究するのに有用なツールです。

血管新生PKD-1シグナル伝達および血管新生遺伝子CD36の転写は、内皮細胞(EC)分化および機能血管新生3、4、5、6に重要であることを示した。遺伝子転写およびECトランス分化における血管新生および代謝シグナル伝達の分子機構を決定するために、TRAP技術1に基づいて特異的に削除された血管新生遺伝子を用いた遺伝子組み換えTRAPマウスを作成した。^,2.さらに、TRAP動物では、血管内皮またはcd36遺伝子の世界的な欠失にpkd-1またはcd36遺伝子欠損があるだけでなく、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)も遺伝的にタグ付けされています。ECのリボソームの翻訳TRAPは、標的組織の血管内皮から直接リボソーム結合mRNAの親和性精製を可能にし、遺伝子発現の解析とEC分化に関連する新しい転写物の同定を可能にし、生体内条件下で直接血管新生。これらの遺伝子組み換え動物では、内皮からリボソーム結合RNAを単離することに成功しました。精製されたRNAは、EC分化および機能の調節における血管新生または動脈系遺伝子のさらなる特徴付けに使用することができる。このプロトコルは、生体内で直接IC内のmRNAを単離するためのTRAPアプローチを実装するためのステップバイステップガイドを提供します。

プロトコル

動物実験のために、ここに記載されているすべての方法は、ウィスコンシン医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。

1. 試薬の準備

1. 10mM HEPES、pH 7.4、150mM KCl、5mM MgCl 2、0.5 mM DTT、100mg/mLシクロヘキシミド、プロテアーゼ阻害剤、および組換えRNase阻害剤の濃度に対するリシスバッファーを以下に説明する。
   1. RNaseフリー脱イオン水の500 mLに以下の試薬を追加:HEPESの1.19グラム、 KClの5.59g、MgCl₂の0.24g、DTTの35mg、シクロヘキシミドの0.5 mL、およびNaOHはpH 7.4まで必要に応じて、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤(10mLあたり1つのミニ錠剤)およびRNase阻害剤(10 μL/mL)。
   2. 4°Cの冷蔵庫に最大1ヶ月間保存してください。
2. 10 mM HEPES、pH 7.4、350 mM KCl、5 mM MgCl 2、1%vol/vol CA-630、0.5 mM DTT、および 100 mg/mL シクロヘキシミドの濃度に高塩ポリソーム洗浄バッファーを調製します。
   1. RNaseフリー脱イオン水の500 mLに以下の試薬を添加する:HEPESの1.19g、KClの13.05g、MgCl₂の0.24g、ニオニティック、非脱帰性洗剤の5mL、DTTの7.7mgチューブの5、および7.5mLのシメフロフが必要になるまで。
   2. 4°Cの冷蔵庫に最大1ヶ月間保存してください。
3. 実験開始前にタンパク質G磁気ビーズに抗GFP抗体を結合する。
   1. タンパク質Gビーズに200mLのPBSで希釈した抗GFP抗体を10mg添加する。
   2. 室温で10分間エンドオーバー回転でインキュベートします。
   3. ビーズを磁気ラックに置き、上清を取り除きます。
   4. ビーズを200mLのPBSで一時停止し、最大1週間4°Cの冷蔵庫に保存します。
4. 100 mg/mL シクロヘキシミドで氷冷PBSを調製します。
   1. 99体の氷冷PBSに1体のシクロヘキシミド溶液(100mg/mL)を添加する。

2. 所望の組織を分離し、lyseする

1. ケタミン(500mg/kg/体重)とキシラジン(10mg/kg/体重)のIP注射によりマウスを安楽死させ、所望の組織(すなわち、心臓、肺)を分離する。すぐに次の手順に進みます。
2. 100 mg/mL シクロヘキシミドを使用して、所望の組織を 500 mL の氷冷 PBS に入れます。
3. モータ駆動ホモジナイザーまたは小クリアランスガラスホモジナイザーを用いた細胞懸濁液に組織をミンチする。モータ駆動ホモジナイザーを使用する場合は、RNAの不飽和を避けるために、低周波(<15,000 Hz)で均質化を1分未満に制限します。
4. ピペッティングとバッファの再描画により、200 mLのリシスバッファーで細胞ペレットを中断します。さらに、小クリアランスガラスホモジナイザーで10ストローク、またはモータ駆動ホモジナイザーで低周波(<15,000 Hz)で15秒間セルサスペンションを均質化します。
5. 遠心分離機は、4°Cで2,000 x gで10分間均質化し、ペレット核と大きな細胞の破片にし、上清を保ちます。
6. 上清に1%vol/volおよびDHPCに非変性の非変性洗剤を30mMに加える。氷の上で5分間インキュベートします。
7. 遠心分離機は、ペレット不溶性材料に16,000 x gで10分間溶解します。転送し、将来のステップのための入力としてクリアリサートの15%を維持します。

3. リボソーム/mRNA複合体の単離

1. 細胞リサート上清に50mLの抗体結合ビーズを加え、4°Cで混合物を30分間エンドオーバー回転でインキュベートします。これは、抗GFP抗体がGFPタグ付きリボソームに結合し、これらのリボソームからRNAをさらに単離することを可能にする場所です。
2. 磁気ラックにビーズを集め、高塩ポリソーム洗浄バッファーで5回洗います。
   1. チューブの側面にビーズが集まったら、液体を引き上げて捨てます。次にピペットを入れ直し、200mLの高塩ポリソーム洗浄バッファーを数回再描画する。この手順を 5 回繰り返し、最終的な繰り返しに続くすべてのバッファーを破棄します。すぐに次の手順に進みます。

4. mRNAの単離

1. ビーズを RLT バッファーに配置します。次の手順は、RNeasy ミニ キット プロトコルから直接実行され、展開されませんでした。
   注意: RLT バッファーにはグアニジン塩が含まれています。漂白剤と混ぜないでください。
2. 遠心分離機は、フルスピード13,000 rpmまたは4°Cで16,000gで3分間リザートします。ピペッティングにより350mLの上清を慎重に取り除き、新しいマイクロフュージチューブに移します。後続の手順では、この上清 (リサート) のみを使用します。
3. マイクロフュージチューブに70%エタノールを同量に加えます。
4. 2 mL回収管に入れられたスピンカラムに、形成された可能性のある沈殿物を含む試料の最大700 mLを転送する。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄します。
5. 350 mL のバッファ RW1 をスピンカラムに追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄し、次のステップで収集チューブを再利用します。
   注意: バッファ RW1 にはグアニジン塩が含まれています。漂白剤と混ぜないでください。
6. 350 mL のバッファ RW1 をスピンカラムに追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15~8,000 x gで閉じます。フロースルーを破棄します。
7. スピンカラムに500 mLのバッファRPEを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄します。
8. スピンカラムに500 mLのバッファRPEを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を2分間≥8,000 x gで閉じ、スピンカラム膜を洗います。次に、コレクション チューブからスピン カラムを慎重に取り外し、列がフロースルーに接触しないようにします。
9. 新しい2 mLコレクションチューブにスピンカラムを配置し、フロースルーで古いチューブを廃棄します。蓋を軽く閉じ、遠心分離機を全速力で1分間閉じ、残留バッファーを取り除きます。
10. スピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに入れます。スピンカラム膜に直接RNaseフリー水の30-50 mLを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を1分間≥8,000 x gで閉じてRNAを溶出します。
11. 予想されるRNA収率が>30 mgの場合は、RNaseフリー水の別の30-50 mLでステップ4.10を繰り返すか、ステップ4.10から溶出を使用します(高い[RNA]が必要な場合)。ステップ 4.10 からコレクション チューブを再利用します。
12. 精製RNAを使用して、RNAシーケンシングまたはリアルタイム定量PCRを含む下流分析に使用するか、またはRNaseフリーH2Oに溶解した保存RNAを最大1年間-80°Cで保存します。

結果

我々の以前の研究4,7は、CD36がLPA/PKD-1シグナル伝達経路を介した動脈分化および毛細血管動脈化のスイッチとして機能する可能性があることを示唆している。LPA/PKD-1-CD36シグナル伝達軸が生体内の動脈形成に不可欠であるかどうかを調べるために、我々は、グローバルCD36欠乏症または内皮特異的CD36-またはpkd-1欠乏症を有するだけでなく、選択的分離を可能にする新しいTRAPラインを確立した。GFPによるクレマークされた細胞系統からのリボソーム結合RNAの、およびクレ活性化蛍光^{レポーター2}として有用である。

ジェノタイピングを行うことにより、cd36遺伝子が世界的に、または内皮特異的cd36ヌルマウス(データを示さない)の血管内皮内で削除され、pkd-1遺伝子も血管内皮で削除されたことが観察された。図1は、作成されたグローバルcd36 TRAPまたは内皮特異的pkd-1 TRAPマウスラインを示す代表...

ディスカッション

血管新生は、EC特異的血管新生遺伝子転写および発現がEC分化および血管新生リプログラミング3、4において重要な役割を果たす複雑な多段階プロセスである。細胞の多様性と建築の複雑さから、生体内の分子レベルで哺乳類血管系の機能をよりよく理解するために、EC特異的なCD36を伴うEC特異的TRAPマウスを作成しました。 、EC特異的pkd-1欠乏またはグローバルcd36欠乏は、他の遺伝子操作マウスラインと組み合わせてPu実験室2で生成された汎用性の高いフロキセドTRAPマウスモデルまたはEGFP-TRAPを用いて用いる。これにより、pkd-1またはcd36遺伝子発現8におけるEC特異的な生体内の無傷組織からの血管ECの翻訳されたmRNA補体全体の検査が可能となり、これは、調査に不可欠である。生理学的および病理学的血管新生

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2100 ナノチップとピコチップス付き電気泳動バイオアナライザー	Agilent	G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
セルスクレーパー	Sarstedt	83.1832
ホモジナイザー	フィッシャーサイエンティフィック	K8855100020
マグネット (Dynamag-2)	Invitrogen	123-21D	精製スケールによります; 1.5 mLチューブ内のサンプルは濃縮できますDynaMag-2
ミニ遠心分離機	フィッシャー・サイエンティフィック	05-090-100
NanoDrop 2000C 分光光度計	サーモ・サイエンティフィック	ND-2000C
1.5mL微量遠心チューブ用ローター付き	遠心分離機	Eppendorf	5430R
RNaseフリー1.5mL微量遠心チューブ	Applied Biosystems
Rnaseフリー50mLコニカルチューブ	Applied Biosystems
RNaseフリー 1000-μl フィルターチップ	レイニン	RT-1000F
RNase-free 200-μl フィルターチップ	レイニン	RT-200F
RNaseフリー 20-μl フィルターチップ	レイニン	RT-20F
ホモジナイザー用ローター	大和	LT-400D
チューブローテーター、Labquakeブランド	サーモフィ	ッシャー13-687-12Q