Method Article

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ウズラ胚モデル系における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にする方法として、メッセンジャーRNA(mRNA)エレクトロポレーションを報告する。この方法は、蛍光的に細胞を標識し、エレクトロポレーション直後のタイムラプス顕微鏡検査によって生体内の動きを記録するために使用することができる。

Abstract

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我々は、mRNAエレクトロポレーションにより、生きているウズラ胚の細胞にDNAエレクトロポレーションよりも迅速かつ広範に標識する蛍光タンパク質を可能にすることを報告する。高いトランスフェクション効率は、少なくとも4つの異なるmRNAを~87%の効率で共生することを可能にします。電化mRNAのほとんどは、最初の2時間のエレクトロポレーションの間に分解され、発達中の胚で時間に敏感な実験を行うことを可能にする。最後に、様々な細胞内標的蛍光タンパク質をコードするmRNAでエレクトロポレートされた生きた胚を動的に画像化する方法について述べた。

Introduction

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エレクトロポレーションは、電気パルスを使用してプラズマ膜内に一時的な細孔を作り出し、核酸や化学物質などの物質がサイトソールに入り込むことを可能にする物理的なトランスフェクション方法です。エレクトロポレーションは、細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞1、2、3にDNAを提供するために広く使用されています。これは、発達中の鳥胚内の標的細胞および組織に遺伝的ペイロードを導入するために日常的に使用され、細胞4、5、6、細胞の集団の遺伝子制御または標識移動の遺伝子制御を研究する。 7.しかし、DNAエレクトロポレーション8にはいくつかの実験的な制限も存在する。例えば、DNAエレクトロポレーションは、多くの場合、細胞あたりの発現ベクターの非常に可変数を導入し、その後、それらがコードするmRNAとタンパク質を導入します。この変動性は、画像解析とデータ解釈9、10の両方を複雑にするかなりの細胞細胞の不均一....

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Protocol

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すべての動物の手順は、小児病院ロサンゼルスと南カリフォルニア大学機関動物ケアおよび使用委員会からの承認されたガイドラインに従って行われました。

1. 生成 pCS2 ベースの式ベクトル

  1. pCS2.Lifeact-eGFPをクローンするには、適切な消化バッファー(材料の表を参照)でBamHI(10U)とBsrGI(10 U)を用いてpCS2.CycB1-GFP(異なるインサートを含む構造体)の2μgを消化してベクトルバックボーンを調製します(材料の表を参照)。37 °Cで1時間50μLの体積(クローニング手順の回路図については図1を参照)。
    1. エビアルカリホスファターゼ(1U)を添加して制限酵素反応からベクターバックボーンの自由3'OH端部を脱リン酸化する。37°Cで30分間インキュベートします。
    2. 1%のアガロースゲル/1xトリスアセテートEDTA(TAE)バッファーで全体の混合物を約50分間90Vで実行し、1x TAEバッファーで1x TAEバッファーで0.5 μg/mL溶液でゲルを汚し、穏やかな揺れで15分間染色します。また、DNAサイズを決定するために、自由なレーンに分子量マーカーをロードしてください。
    3. DNAのニッケルを避けるためにDNA安全なUVトランスイルミネーションを使用して、アガロースゲ....

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Results

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mRNAエレクトロポレーションはDNAエレクトロポレーションよりも効率的

私たちはpCS2+を使用しました。H2B-シトリンは、mRNAをインビトロで調製する。DNAエレクトロポレーションは通常1-2 μg/μLで行われるため、mRNAエレクトロポレーションにはmRNAの等化濃度(H2B-シトリンの場合は約0.25-0.5 μg/μL)を用いました。まず、pCS2+のエレクトロポレーション効率をテストしました。H2B-シトリンmRNAと比較したH2B-シトリンDNA(pCS2+のSP6プロモーターから転写したインビトロ。H2B-シトリン)は、DNAまたはmRNAをHH5ウズラ胚に別々に電気ポレートし、12時間後のエレクトロポレーションでエレクトロポレーション効率を調べることによって。DNAエレクトロポレーションは一部のエレクトロポレーション細胞において明るい蛍光を引き起こしますが、DNAエレクトロポレーションの効率は、.......

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Discussion

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このプロトコルでは、ウズラ胚をガストレーションする細胞にmRNAを正確にマイクロインジェクトして電気ポレートする方法について段階的に説明しました。インビトロ合成mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証した(図2および3)。電気起電mRNAから翻訳されたH2B-シトリンタンパク質からの蛍光は、約20分以内に共焦点顕微鏡検査によって検出され、FP蛍光で1時間増加した(図3、補足ムービー1)。これは驚くほど速く、シトリン32、33の推定成熟時間に近い。DNAベクターから発現した胎児は、2〜3時間後に検出された(図3、補足。ムービー 1) は、以前

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Disclosures

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著者は、宣言する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

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この作品に役立つ洞察をデビッド・ハスに感謝します。この研究は、ローズヒルズ財団サマーリサーチフェローシップ(2016-2018)とUSCプロボストのM.T.、サバン研究所内壁画研修前博士賞、および大学の一部で支援されました。南カリフォルニア学部研究員プログラム賞

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFニューイングランドバイオラボR3136L
BglIIニューイングランドバイオラボR0144S
BsrG1-HFニューイングランドバイオラボR3575S
NotI-HFニューイングランドバイオラボR3189L
SalI-HFニューイングランドバイオラボR3138L
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールサーモフィッシャー
SP6 mMessage Machine in vitro転写キットサーモフィッシャーAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, ポリエチレングリコール tert-octylphenyl ether
DAPIシグマアルドリッチD95422-(4-アミジノフェニル)-6-インドールカルバミジン二塩酸塩、4′、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩、DAPI二塩酸塩
ワットマンNo.1濾紙シグマアルドリッチWHA1001125
グリセロールシグマアルドリッチG9012
素シグマアルドリッチ51457
pmTurquoise2-ゴルジAddgene36205pmTurquoise2-ゴルジは、ドルスガデラ(Addgeneプラスミド#36205;http://n2t.net/addgene:36205 ;RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methods 2008;5:605-7.PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneこの論文
pCS.H2B-citrineAddgene53752pCS-H2B-citrine は、Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ;RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherryはSean Megasonからの贈り物でした(Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ;RRID:Addgene_53750)
ツァイス LSM-780 倒立顕微鏡カール・ツァイス顕微鏡GmbHLSM-780は、バイタルイメージング作業に必要な感度を提供する共焦点・多光子顕微鏡です。電動ステージ、オートフォーカスデバイス、フルステージトップブラックアウトインキュベーターを装備した780は、ハイエンドの生細胞/胚イメージングに最適な顕微鏡です。高感度の32チャンネルクエーサー検出器により、スペクトルイメージング、リニアアンミキシング、高色数(>4)の画像取得が可能です。励起は、6ラインの単一光子レーザー(405、458、488、514、564、633 nm)、カメレオン(コヒーレント)2光子レーザー(690nm〜1000nmの範囲)で実行でき、ZEN 2011 SP7(Black)システムソフトウェアで実行できます。
CUY-21 EDIT in vivoエレクトロポレーターベックス(株)
白金平角電極 一辺長5mmベックス(株)
オリンパス MVX10 FL 実体顕微鏡オリンパス ライフサイエンス
XM10 モノクロカメラオリンパス ライフサイエンス
<ストロング>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) HCR (10倍、pH 7.4) L を調製するには、NaCl 80 g (Sigma-Aldrich S3014)、KCl 2 g (Sigma-Aldrich P9541)、Na2HPO4 (無水;Sigma-Aldrich S3264)、および 2.7 g の KH2PO4 (無水;Sigma-Aldrich P9791)。HClでpHを7.4に調整し、超高純度H2Oで最終容量を1Lにします。HCRのPBSでCaCl2およびMgCl2を使用することは避けてください。HCR用のPBSは、RNaseフリー溶液として調製することが重要です(例:ジエチルピロカーボネート[DEPC]処理)。
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton1mL 1 mL の Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) と 100 mL の 10× を加えます。PBSを890mLの超高純度蒸留H2O.溶液を0.2μでろ過します。mフィルターをかけて4 ?使用までC。
1倍;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(DEPC処理;pH 7.4)
0.1% Triton X-100
15593031尿LF701P5E1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and ins....

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