Method Article

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ウズラ胚モデル系における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にする方法として、メッセンジャーRNA(mRNA)エレクトロポレーションを報告する。この方法は、蛍光的に細胞を標識し、エレクトロポレーション直後のタイムラプス顕微鏡検査によって生体内の動きを記録するために使用することができる。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、mRNAエレクトロポレーションにより、生きているウズラ胚の細胞にDNAエレクトロポレーションよりも迅速かつ広範に標識する蛍光タンパク質を可能にすることを報告する。高いトランスフェクション効率は、少なくとも4つの異なるmRNAを~87%の効率で共生することを可能にします。電化mRNAのほとんどは、最初の2時間のエレクトロポレーションの間に分解され、発達中の胚で時間に敏感な実験を行うことを可能にする。最後に、様々な細胞内標的蛍光タンパク質をコードするmRNAでエレクトロポレートされた生きた胚を動的に画像化する方法について述べた。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エレクトロポレーションは、電気パルスを使用してプラズマ膜内に一時的な細孔を作り出し、核酸や化学物質などの物質がサイトソールに入り込むことを可能にする物理的なトランスフェクション方法です。エレクトロポレーションは、細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞1、2、3にDNAを提供するために広く使用されています。これは、発達中の鳥胚内の標的細胞および組織に遺伝的ペイロードを導入するために日常的に使用され、細胞4、5、6、細胞の集団の遺伝子制御または標識移動の遺伝子制御を研究する。 7.しかし、DNAエレクトロポレーション8にはいくつかの実験的な制限も存在する。例えば、DNAエレクトロポレーションは、多くの場合、細胞あたりの発現ベクターの非常に可変数を導入し、その後、それらがコードするmRNAとタンパク質を導入します。この変動性は、画像解析とデータ解釈9、10の両方を複雑にするかなりの細胞細胞の不均一性につながる可能性があります。さらに、DNAエレクトロポレーションからのタンパク質は、エレクトロポレーション後3時間しか発現し始め、12時間まで細胞数と蛍光強度の最大効率に達せず、核への転移に要する時間が原因で完了する可能性が高い。生体内11の転写と翻訳の両方.

対照的に、mRNAトランスフェクションは、マイクロインジェクション12、13によるキセノプス・レービス卵母細胞、mRNAリポフェクタミントランスフェクション14によるヒト幹細胞の再プログラミングを含む様々なモデルシステムで効果的に使用されている。、成体マウス15における再石灰性神経幹細胞を電気的にする。我々は、異なる蛍光タンパク質(GP)をコードするインビトロ合成mRNAを用いて、初期の鳥類胚発生時に細胞を効率的に標識するmRNAエレクトロポレーションの能力を試験した。我々の研究では、キセノプスおよびゼブラフィッシュ胚のタンパク質を発現するために一般的に使用される多目的発現ベクターであるpCS2+ベクターを用いて使用した。pCS2+におけるSP6およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターは、インビトロ転写/翻訳システムで使用した場合、任意のクローン遺伝子からのmRNAおよびタンパク質の合成を可能にします。

ここでは、mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証する。我々は、これらの研究で使用される発現ベクターの多くを設計し、生成した。例えば、LifeAct-eGFP遺伝子16をpCS2+ベクター17にサブクローニングし、CMVプロモーターおよびSP6プロモーターから発現した。挿入された遺伝子は、SP6プロモーターの下流にあり、SV40ポリ(A)テール18の上流にある。mRNAとDNAと共にエレクトロポレートされた胚では、インビトロ転写されたmRNAからコードされた胎児は、最初にエレクトロポレーションの20分以内に検出されたが、DNA発現ベクターからのGPは、核、ゴルジ、および核をコードする複数のmRNAの3時間後にのみ検出された。膜タンパク質は同時に胚にエレクトロポレートされ、個々の細胞内の複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現をもたらす。最後に、光漂白(FRAP)アッセイ後の生体内蛍光回収を用いて、電ポレートされたmRNAの大部分が2時間以内に崩壊することを示す。したがって、限られた新しいタンパク質翻訳と組み合わせた高速初期タンパク質産生は、発現の時間的制御が必要な場合にmRNAエレクトロポレーションを貴重な技術にする。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物の手順は、小児病院ロサンゼルスと南カリフォルニア大学機関動物ケアおよび使用委員会からの承認されたガイドラインに従って行われました。

1. 生成 pCS2 ベースの式ベクトル

  1. pCS2.Lifeact-eGFPをクローンするには、適切な消化バッファー(材料の表を参照)でBamHI(10U)とBsrGI(10 U)を用いてpCS2.CycB1-GFP(異なるインサートを含む構造体)の2μgを消化してベクトルバックボーンを調製します(材料の表を参照)。37 °Cで1時間50μLの体積(クローニング手順の回路図については図1を参照)。
    1. エビアルカリホスファターゼ(1U)を添加して制限酵素反応からベクターバックボーンの自由3'OH端部を脱リン酸化する。37°Cで30分間インキュベートします。
    2. 1%のアガロースゲル/1xトリスアセテートEDTA(TAE)バッファーで全体の混合物を約50分間90Vで実行し、1x TAEバッファーで1x TAEバッファーで0.5 μg/mL溶液でゲルを汚し、穏やかな揺れで15分間染色します。また、DNAサイズを決定するために、自由なレーンに分子量マーカーをロードしてください。
    3. DNAのニッケルを避けるためにDNA安全なUVトランスイルミネーションを使用して、アガロースゲルからベクターバックボーン(4kbの予想バンドサイズ)を素早く切り取り、メーカーの指示に従ってゲル精製キットを使用してゲル片からDNA断片を分離します。
  2. ステップ1.1と同時に、BglII(10U)およびBsrGI(10U)を適切な消化バッファーで2μgのpEGFP-N1-Lifeactを消化して挿入を調製し、37°Cで1時間50μLの総反応量で1倍に希釈した。ステップ1.1.2-1.1.3で前述したように、1%のアガロースゲルで混合物全体を実行し、800 bpバンドを分離します。
  3. ベクターとインサートの両方を分光光度計で精製および定量した後、T4 DNAリガーゼを添加する前に、T4 DNAリガーゼバッファーに50ngのベクターと38ngのインサート(1:3モル比のインサート)を組み合わせて、ライゲーション反応を触媒する。さらに、DNA コントロールなし、ベクターのみのコントロール、および挿入のみのコントロールを設定します。室温ですべての反応を30分間インキュベートします。
    1. ライゲーション混合物の1 μLを有能な大腸菌DH10に変換します。また、水のみ陰性対照およびpUC19陽性対照の20pgを変換する。50 μg/mLアンピシリンを含む寒天プレートに細菌を広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
    2. 翌朝、各プレートのコロニーを数えます。
      注:理想的には、負の制御プレート上にコロニーがなく、ベクトル+インサートライゲーションプレート上にコロニーが100個あり、ベクトルのみのプレート上のコロニーが少なくなります。
    3. ベクター+インサートライゲーション混合物で形質転換された寒天プレートから少なくとも8つの細菌コロニーを選び、50 μg/mLアンピシリンを含む液体LBブロスの2 mLに滅菌爪楊枝またはピペチップチップを使用して接種します。
    4. 市販のプラスミドミニプレップキットを使用して、各クローンからDNAを抽出します。
    5. 37°Cで1時間に1xに希釈した適切な消化バッファーでNotI(10U)とBamHI(10U)を用いて各クローンから500ngのDNAを用いて診断制限ダイジェストを実行し、1x TAEバッファー内の1%アガロースゲル上で消化DNAを実行します。pCS2.Lifeact-eGFP 正のクローンの予想バンド サイズは 3.9 kb と 978 bp です。
    6. 陽性クローンから1pg-100 ngのDNAを有能な大腸菌DH10に変換し、前のステップで詳述したように3-4のミニプレップ反応を調製し、インビトロ転写反応(最小10μg)に十分な量のDNAを得た。

2. インビトロ転写によるmRNAの調製

  1. pCS2.LifeAct-eGFPの10 μgを、一晩37°Cで50μLの総反応量で1倍に希釈した適切な消化バッファーでNotI(10 U)を挿入して3'端部に直線化します。
    注:RNase汚染を防止し、mRNAの分解を低減するために、mRNAサンプルを取り扱いながら手袋を着用してください。
  2. フェノールの混合物を使用してDNAを精製する:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、v/v)。
    1. 150 μL の RNase フリーウォーターを追加し、消化反応の総体積を 200 μL にします。次に、フェノールの200μLを添加する:クロロホルム:イソアミルアルコールおよび渦混合物を20s用に加える。
    2. 最大速度(18,400 x g)のマイクロフュージで2分間遠心分離機は、線形化されたDNAを含む上部水相を慎重に取り除きます。追加の不純物を除去し、底と上部の液体相の間に形成される可能性のある白い沈殿物を破壊しないように注意するために、この手順を繰り返します。
  3. 1/10体積3M酢酸ナトリウム(RNaseフリー)と100%エタノールの2.5体を添加して線形化DNAを沈殿させる。混合物を-20 °Cで>30分間放置し、その後、最大速度(18,400 x g)で遠心分離してDNAをペレットします。
    1. DNAペレットを70%エタノールで洗浄し、ペレットを5分間空気乾燥させます。
    2. DNAペレットをRNaseフリー水の5μLに溶解します。分光光度計でDNAを定量します。
      注:予想DNA濃度は~0.5-1 μg/μLで、A260/A280比は1.7~2.0です。
  4. 線形化pCS2.LifeAct-eGFP DNAの1 μgをインビトロ転写(IVT)に使用します。商用キット(材料表参照)のメーカーの指示に従って、10 μLのキャップアナログ(最終濃度0.8mM)とNTP(ATP、CTP、TTPの最終濃度1 mM、GTPの場合は0.2mM)、10倍の反応バッファーの2μL(最終濃度)を含む。1x)、SP6 RNAポリメラーゼの2μL、および20 μLまでのRNaseフリー水。
    1. 転写物のサイズに応じて、IVT混合物を約2時間以上インキュベートする。
      注:2時間のインキュベーションは3 kbのトランスクリプトに適していますが、一晩インキュベーションは5 kbを超えるトランスクリプトの方が適しています。
    2. 転写反応からフリーヌクレオチドを除去するには、LiCl RNA沈殿液(塩化7.5M、50mM EDTA)を30μL添加してmRNAを沈殿させる。混合物を短時間で渦にし、-20°Cで30分間保存し、mRNAを最大速度(18,400 x g)でマイクロフュージで15分間スピンダウンし、70%エタノール(RNaseフリー)ですすいでください。
  5. 合成したmRNAを15μLのRNaseフリー水で溶解させる。合成されたmRNAを5 μL/チューブ(3チューブ合計)で分配し、-80°Cに置いて長期保存します。分光光度計でmRNAを定量します。
    注:期待降伏量はmRNAの15-20 μg(約1 μg/μL)です。1 μL(1 μg/μL)は、mRNAが1μg/μLから500ng/μLに希釈され、各胚が〜200 nLで注入されると仮定して、〜10個の胚を用いた実験に十分である。したがって、各チューブには、~5の実験に十分なmRNAが含まれている必要があります。
  6. RNase除去液ですべてのゲル装置を洗浄した後、1x TAEバッファーで1%のアガロースゲルでmRNAの〜300 ngを実行し、mRNAが1つのバンドとして現れることを確認します(二次構造形態の場合は複数のバンドが存在する可能性があります)。RNAの劣化を示すゲルレーンのピア。

3. mRNAエレクトロポレーションミックスの調製

  1. 所望の濃度でmRNAを解凍および希釈します(RNaseフリー水中の250-500 ng/μLは、本研究で試験されたすべてのmRNAに適しています)。着色色素の1/10体積を追加し(材料の表、RNAseフリー、0.1%の最終濃度を参照)、mRNA注入部位を視覚化し、電極を適切に配置するのに役立ちます。
    注:DNA    とRNAを組み合わせて共エレクトロポレーションを行う場合は、mRNAとDNA混合物の前にフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿を使用して、DNAがRNasesを汚染していないことを確認してください。
    1. 模擬(RNA添加なし)エレクトロポレーション溶液を使用して、必ず陰性コントロールを準備してください。可能であれば、事前に検証されたmRNA(以前の実験でFPを正常に産生することが示されているmRNA)を用いて陽性対照を準備する。
      注:陰性制御は、データの正規化のための背景蛍光レベルを確立するために、すべての画像実験に不可欠です。正の制御は、エレクトロポレーション設定が働いていることを確認することにより、新しく転写されたmRNAを使用する場合に特に重要です。
  2. mRNAエレクトロポレーション溶液を氷スラリーに保存し、エレクトロポレーションを進める準備ができるまで劣化を防ぎます。

4. 生きたウズラ胚への電極mRNA

  1. 毎日作りたての受精ウズラの卵を集め、1週間以内に加湿した冷蔵庫で13°Cに保管してください。所望の胚発生段階19、20、21まで38°Cでウズラの卵をインキュベートする。
    注:HH3からHH5は、静的および動的イメージングの両方に使用された。HH3胚の場合、卵を収穫前に室温で2時間放置すると、胚が冷却されたときに一般的に物理的な操作に対して耐性が高くなるため、分離プロセスがはるかに容易になります。
  2. EC培養システム22に従って胚を分離して調作する。条件ごとに少なくとも5個の胚を採取し、少なくとも1つを含む負の対照(電気的ではない)として機能させる。
    1. 卵を10cmのペトリ皿にそっと割って注ぎます。転写ピペットで厚いアルブミンの大部分を取り除き、胚が紙のリングにしっかりとくっつくようにするために、組織拭きで卵黄の表面を静かに拭くことによって、胚の周りの残りの厚いアルブミンを取り除きます。
    2. プリカットフィルターペーパー(材料の表を参照)を胚の上に置き、はさみを使用して胚の周囲を滑らかに切ります。
    3. パスツールピペットを使用して、PBSで胚の根元に、穏やかな流れを使用して胚に付着する黄身を空にします。
      注:これらの胚は黄身に固執する傾向があり、その後の洗浄工程中にビテリン膜から剥離することが多いため、このステップは若い(
    4. 胚/紙のリングを斜めの角度でゆっくりと引き上げ、さらに洗浄するためにPBSで満たされたペトリ皿に卵黄をオフにします。卵黄の大部分が取り除かれたら、寒天/アルブミンの半固体混合物で覆われた35mmペトリ皿の上に胚の腹部側を置きます。
  3. ガラスマイクロピペットプーラー器具を使用して、6~8個の長さ10cmのガラスマイクロキャピラリー(O.D.= 1.2 mm)を準備します。
  4. 胚の腹部側をPBSで満たされたエレクトロポレーション室に置きます。ガラスマイクロキャピラリーを用いて、所望の領域を覆うエピブラストとビテリン膜の間の空洞にmRNAまたはDNA/mRNAエレクトロポレーションミックスの200nLのボーラスを注入する。
    注:ペルシダの前部領域全体とオパカの一部の領域は、この原稿に示す実験のほとんどで電気ポレートされた。
  5. 正極と負極(プラチナ平らな正方形の電極、5mmの側面長)をそれぞれ胚の上下に置き、次のパルスシーケンスを使用して電気ポレート:5Vの5つの正方形の電気パルス、100ミリ秒間隔の50ミリ秒の持続時間生体内エレクトロポレーターを使用しています。電極間の距離が~5mmであることを確認します。
    注:エレクトロポレーションパラメータを最適化することは、脆弱な胚細胞を殺すことができる条件を避けるために重要です。電圧、パルス長、パルス間隔、DNAおよびmRNAのパルス数のパラメータは、様々なエレクトロポレーションデバイスで考慮する必要があります。
  6. 電気刺激胚を38°Cで所望の発達段階にインキュベートする。
    注:蛍光解剖ステレオスコープ(材料の表を参照)は、トランスフェクトされた胚と非トランスフェクト胚をスクリーニングするのに役立ちます。
  7. 胚を静的に画像化する場合は、室温で1時間、または4°Cで一晩PBSで4%パラホルムアルデヒドで固定します。
    1. フィルターペーパーの周囲をハサミで滑らかに切り、鋭い鉗子で後面の光沢のある膜を剥離することにより、ビテリン膜から胚を取り除きます。
    2. 固定胚をPBS/トリトンで洗浄する (0.1%)2x 5分間、必要に応じてその中でハイブリダイゼーションまたは免疫染色を続けます。
    3. 最後に、PBS/トリトン(0.1%)で胚を0.5 μg/μL DAPIで染色する室温で少なくとも30分間。PBS/トリトン2xで胚を5分間洗浄し、SCALE-U2溶液23で胚を一晩クリアします。
  8. エレクトロポレーションの効率を分析するには(図 2を参照)、ImageJ のバイナリおよびパーティクル解析ツールと DAPI チャネルを使用して、画像内のすべてのセルから核の輪郭を取得します。
    1. ImageJ でバイナリ ツールを使用するには、大部分のセルを含む DAPI チャネルで単一の Z スライスを使用し、[プロセス > バイナリ > バイナリを作成]をクリックします。近くのセルを分離するには、[プロセス > バイナリ >流域] をクリックします。[パーティクルの分析]、サイズを 100~500 (μm 2) に設定した [分析] をクリックしてセルのアウトラインを取得します。
    2. セルの大部分が DAPI チャネルで概説されていることを確認し、[その他 ]をクリックしてセルのアウトラインを保存します。
    3. これらのアウトラインを使用して、mRNA または DNA チャネル内の単一の Z スライスで以前に保存したファイルを開き、ROI マネージャーの [測定] をクリックして、mRNA および DNA チャネルの蛍光強度値を取得します。
    4. 最後に、これらの強度値をフィルタリングし、<6,000 蛍光強度を非トランスフェクトとして細胞をカウントし、トランスフェクトとして>6,000蛍光強度を有する細胞をカウントします。

5. エレクトロポレーションmRNAによってコードされる画像FP

  1. 蛍光解剖ステレオスコープの下ですべての電気起電胚を見た後、動的イメージング実験のための最も健康的で最高の電気ポレート胚を選択してください。
    1. 実験中に他の電気起電胚と非電気起電胚(陰性対照)を別のインキュベーターでインキュベートし続け、この胚が実験中に死亡した場合に選択した胚をイメージングする。
  2. 動的イメージングの場合は、前述の24、25、26を反転共焦点顕微鏡で使用する。
    注:    顕微鏡はイメージ投射の間に36 °Cで温度を維持するステージ上のインキュベーター(材料のテーブルを参照)が装備されている。36°Cでインキュベートした胚は、レーザーが胚に局所的な加熱を引き起こす可能性があるため、より高い温度で長く生き残ることを顕微鏡セットアップ中に観察した。読者は、独自の顕微鏡セットアップのための最適なステージ上のインキュベーション温度を決定する必要があります。
    1. 胚発生を動的に画像化して可視化するには、電解胚をPBSで簡単にきれいにし、PBSクリーンで鉗子を使用して胚を動かすことによって、エレクトロポレーションプロセス中に胚の後側に形成される可能性のある気泡を除去する。ソリューション。
    2. きれいな胚を、アルブデン寒天(〜150μL)の薄い層を含むイメージング皿の上に直接置き、胚22の後部表面に気泡を発生させないようにする。
    3. 長期的なイメージングの生存を確保するために、イメージング皿の内側の端に小さな湿った巻き上げティッシュペーパーを追加し、イメージングおよびインキュベーション中の蒸発を最小限に抑えるためにパラフィンフィルムを使用して皿を密封する。
    4. この皿を共焦点顕微鏡の予め温められた段階に素早く移動し、注入された領域および電気起電領域を識別する明視野チャネル(PMTレーザー20%)を使用して胚の着色された色素を見つける。
  3. イメージングソフトウェアを目的の目的(10または20x)、ダイクロイックミラー(GFP nmの場合は488nm、RFPの場合は561nm)、発光スペクトル(GFPの場合は499~562nm、RFPの場合は570~695nm)に設定し、適切なレーザー(GFPの場合は488nm、RFPの場合は561nm)をオンにします。
    注:    電気電化されたmRNAは、20分以内に見られたタンパク質に翻訳された(図3参照)。このホワイト ペーパーのほとんどの画像で使用されるイメージング メタデータは、20 倍の目的を持つ反転共焦点顕微鏡でした (材料の表を参照)。ピクセルのドウェル時間、~1.5 μs;4行スキャンの平均。
    1. イメージングソフトウェアの[ライブ]をクリックし、各顕微鏡レーザーパワーに応じて蛍光強度に適した設定にレーザーパワーを調整します。まず、1%のレーザーパワー、800ゲインを使用して胚をイメージングし、飽和ピクセルが見られるまでレーザーパワーをゆっくりと1%増加させます。
    2. 飽和ピクセルが見えなくなるまで、レーザーパワーをわずかに減らして、これに従ってください。
      注:胚のイメージングセッションの開始時に選択されたレーザーパワーは、以前の時点に適しているかもしれませんが、細胞の蛍光が時間の経過とともに明るくなったり暗くなったりすると、後の時点では理想的ではありません。これに対処するために、電気ポレーションされた細胞は一般的にエレクトロポレーション後6時間にわたって明るくなるので、最初はわずかに低い電力設定で胚を画像化します(信号増加の定量化については図3A-Eを参照)。後の画像が飽和状態の場合は、元のイメージング設定で画像を続行しますが、イメージ設定が弱い(ピンホールまたはレーザーパワーが小さい)直後に追加の画像を撮影します。
    3. 異なる時間ポイント間の個々の細胞の移動を追跡するために、3〜5分ごとに胚を画像化します。この研究では、画像は電化領域全体のZスタック(約50μmの厚さ)に加え、イメージングセッション全体を通して胚がアガロースベッドに沈んだ場合に備えて、Zスタックの底部に向かって余分な余地を与えました。
    4. 最初のムービーの最初の数ポイントを確認して、セルの移動速度を確認します。セルが高速で移動している場合 (つまり、イメージ領域の領域を 2 つ以上の時間ポイント内で終了する場合)、イメージ領域のズームを拡大するか(1x à 0.8x)、または別の領域をイメージングすることを検討してください。
      注:地域の胚領域は、地域のオパカのそれらよりもはるかに速く移動します。さらに、若い胚(HH3、HH5)には、古い胚(>HH7)に比べてより速い運動を受けている細胞が含まれていることが多い。
    5. 胚の電気起電領域を画像化した後、同じ胚の非電解領域を画像化して自己蛍光レベルを決定する(低レーザーパワー<10%を使用して胚を画像化する場合は最小限にすべきである)。

6. 光漂白後の蛍光回収(FRAP)からアッセイmRNAインテグリティ

注:光漂白(FRAP)アッセイ後の生体内蛍光回収は、トランスフェクトされたmRNAをMSPに変換できる期間を決定するために使用することができる。次のプロトコルは、H2Bの半減期を検出するFRAP実験の概要を示す。エレクトロポレート胚中のシトリンmRNA。

  1. 20x 0.8 NAの目的と完全に開いたピンホールを使用して、反転共焦点顕微鏡でFRAP実験を行います。
    1. 立体顕微鏡上のH2B-シトリンのエレクトロポレーションを確認し、反転共焦点顕微鏡上の予熱段階で胚を設定した後(ステップ5.2.4参照)、H2B-Citrineからの細胞蛍光のほとんどを様々な時間に光漂白するポイント(45分、2h、および5時間後エレクトロポレーション)は、70%のレーザーパワー、100回の反復、スキャン速度4を用いて405nmレーザーを使用することにより、蛍光の5%しか残らない。
      注:このプロセスには数分かかります。
    2. 光漂白後36°Cでステージ上の胚をインキュベートし続ける。
  2. 光漂白領域内の細胞を積極的に分割することに注意してください。
  3. 共焦点顕微鏡を使用して、一定の時間間隔(3または5分)で最大30分間、漂白後画像(電極領域のZスタック)を取得します。
    注:可能な場合は、光漂白領域での細胞生存を確保するための正のコントロールとしてトランスジェニックH2B-XFPラインを使用してください。電光mRNAによってコードされるFPの蛍光回収率は減少するはずですが、トランスジーンを介してコードされるFPについては、ムービー全体を通して一貫性を保つべきです。
  4. 画像化条件が胚の生存に有害に影響を及ぼさないことを確実にするために、同時に光漂白されていない電化胚をインキュベートし、イメージングの制御として役立つ可能性がある。
  5. mRNA崩壊後の光漂白結果を定量化するには、ImageJを使用して各細胞の中心(7.5μm円)の蛍光強度を測定することにより、時間の経過とともに細胞蛍光を追跡します(3または5分)。これを、人芽細胞症を受けておらず、完全に光漂白されている光漂白領域内のすべての細胞に対して測定します。
    注:有光核はクロマチン凝縮による相間核よりも蛍光が強いため、定量から有化細胞を省略することを検討してください。
  6. 様々な時間ポイント(45分、2h、5時間)で、時間の経過に渡る蛍光強度をプロットします。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNAエレクトロポレーションはDNAエレクトロポレーションよりも効率的

私たちはpCS2+を使用しました。H2B-シトリンは、mRNAをインビトロで調製する。DNAエレクトロポレーションは通常1-2 μg/μLで行われるため、mRNAエレクトロポレーションにはmRNAの等化濃度(H2B-シトリンの場合は約0.25-0.5 μg/μL)を用いました。まず、pCS2+のエレクトロポレーション効率をテストしました。H2B-シトリンmRNAと比較したH2B-シトリンDNA(pCS2+のSP6プロモーターから転写したインビトロ。H2B-シトリン)は、DNAまたはmRNAをHH5ウズラ胚に別々に電気ポレートし、12時間後のエレクトロポレーションでエレクトロポレーション効率を調べることによって。DNAエレクトロポレーションは一部のエレクトロポレーション細胞において明るい蛍光を引き起こしますが、DNAエレクトロポレーションの効率は、...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、ウズラ胚をガストレーションする細胞にmRNAを正確にマイクロインジェクトして電気ポレートする方法について段階的に説明しました。インビトロ合成mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証した(図2および3)。電気起電mRNAから翻訳されたH2B-シトリンタンパク質からの蛍光は、約20分以内に共焦点顕微鏡検査によって検出され、FP蛍光で1時間増加した(図3、補足ムービー1)。これは驚くほど速く、シトリン32、33の推定成熟時間に近い。DNAベクターから発現した胎児は、2〜3時間後に検出された(図3、補足。ムービー 1) は、以前

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品に役立つ洞察をデビッド・ハスに感謝します。この研究は、ローズヒルズ財団サマーリサーチフェローシップ(2016-2018)とUSCプロボストのM.T.、サバン研究所内壁画研修前博士賞、および大学の一部で支援されました。南カリフォルニア学部研究員プログラム賞

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFニューイングランドバイオラボR3136L
BglIIニューイングランドバイオラボR0144S
BsrG1-HFニューイングランドバイオラボR3575S
NotI-HFニューイングランドバイオラボR3189L
SalI-HFニューイングランドバイオラボR3138L
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールサーモフィッシャー
SP6 mMessage Machine in vitro転写キットサーモフィッシャーAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, ポリエチレングリコール tert-octylphenyl ether
DAPIシグマアルドリッチD95422-(4-アミジノフェニル)-6-インドールカルバミジン二塩酸塩、4′、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩、DAPI二塩酸塩
ワットマンNo.1濾紙シグマアルドリッチWHA1001125
グリセロールシグマアルドリッチG9012
素シグマアルドリッチ51457
pmTurquoise2-ゴルジAddgene36205pmTurquoise2-ゴルジは、ドルスガデラ(Addgeneプラスミド#36205;http://n2t.net/addgene:36205 ;RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methods 2008;5:605-7.PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneこの論文
pCS.H2B-citrineAddgene53752pCS-H2B-citrine は、Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ;RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherryはSean Megasonからの贈り物でした(Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ;RRID:Addgene_53750)
ツァイス LSM-780 倒立顕微鏡カール・ツァイス顕微鏡GmbHLSM-780は、バイタルイメージング作業に必要な感度を提供する共焦点・多光子顕微鏡です。電動ステージ、オートフォーカスデバイス、フルステージトップブラックアウトインキュベーターを装備した780は、ハイエンドの生細胞/胚イメージングに最適な顕微鏡です。高感度の32チャンネルクエーサー検出器により、スペクトルイメージング、リニアアンミキシング、高色数(>4)の画像取得が可能です。励起は、6ラインの単一光子レーザー(405、458、488、514、564、633 nm)、カメレオン(コヒーレント)2光子レーザー(690nm〜1000nmの範囲)で実行でき、ZEN 2011 SP7(Black)システムソフトウェアで実行できます。
CUY-21 EDIT in vivoエレクトロポレーターベックス(株)
白金平角電極 一辺長5mmベックス(株)
オリンパス MVX10 FL 実体顕微鏡オリンパス ライフサイエンス
XM10 モノクロカメラオリンパス ライフサイエンス
<ストロング>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) HCR (10倍、pH 7.4) L を調製するには、NaCl 80 g (Sigma-Aldrich S3014)、KCl 2 g (Sigma-Aldrich P9541)、Na2HPO4 (無水;Sigma-Aldrich S3264)、および 2.7 g の KH2PO4 (無水;Sigma-Aldrich P9791)。HClでpHを7.4に調整し、超高純度H2Oで最終容量を1Lにします。HCRのPBSでCaCl2およびMgCl2を使用することは避けてください。HCR用のPBSは、RNaseフリー溶液として調製することが重要です(例:ジエチルピロカーボネート[DEPC]処理)。
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton1mL 1 mL の Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) と 100 mL の 10× を加えます。PBSを890mLの超高純度蒸留H2O.溶液を0.2μでろ過します。mフィルターをかけて4 ?使用までC。
1倍;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(DEPC処理;pH 7.4)
0.1% Triton X-100
15593031尿LF701P5E1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894(2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674(2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918(2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

mRNA ElectroporationAvian EmbryosFluorescent ProteinsProtein ExpressionConfocal MicroscopyPhotobleaching AssayTransfection EfficiencyEmbryo ImagingQuail EmbryosDynamic Imaging

Related Articles