口腔好中球評価のためのマウス歯肉炎の堅牢な合字誘発モデル

サマリー

この記事では、複数の上顎大臼歯を含む糸字誘発モデルを確立するためのプロトコルを提示し、その後の分析と動物の使用量の減少のために関与する歯肉組織および骨のより大きな領域をもたらす。ヒト被験者に類似した方法で経口好中球を評価する技術も記載されている。

要約

マウスモデルを利用して歯周病の病態生理学を研究する主な利点は、動物のコストの削減、遺伝子組み換え株の配列、収穫された柔らかい組織および硬質組織に対して行うことができる膨大な数の分析である。しかし、これらのシステムの多くは手続き上の批判の対象となります。代替として、生理周期疾患の合字誘発モデルは、生体生物的経口微生物叢の局所的な発達および保持によって駆動され、急速に誘導され、比較的信頼性が高い、採用することができる。残念ながら、合字誘発性マウス歯炎プロトコルの変異体は、歯素の焦点領域に単離され、インストールされた合字の早期発従の対象となる。これにより、後続の分析に使用できる組織の量が最小限に抑え、研究に必要な動物の数が増加します。このプロトコルは、前述を緩和する代替アプローチを用いてマウスの口腔好中球を回収する新しいリンス技術の保持と使用を改善した拡張モル合字を配置するために必要な正確な操作を記述します。技術的な課題。

概要

歯周病(PD)は、有意な宿主罹患率および経済的負担に関連する骨溶解状態であり、歯肉の炎症および軟部組織結合および患部の骨の支持の両方の喪失によって現れる^{1、2、3、4}である。このプロセスは、宿主の経口微生物叢と自然免疫系との相互作用によって支配される。また、糖尿病、心血管疾患、および癌^{5、6、7、8}を含む他の全身性炎症性疾患の悪化に関連する。歴史的に、PD病因はポルフィロモナス・ギンギバリス⁹のような特定の細菌に大量に依存していると仮定した。しかしながら、最近の証拠は、PDの微生物成分が歯科バイオフィルムによって媒介されることを示唆している。バイオフィルムは、健康な共生および破壊的な生生物状態^10、11に存在し得る多数の微生物の組織化された複雑....

プロトコル

すべてのマウス研究は、関連する倫理規定に準拠し、トロント大学動物ケア委員会と研究倫理委員会(プロトコル20011930)によって承認されました。

1. 合字のインストール

注:これは標準的な手術室で行うことができる非無菌の外科処置である。生殖不能動物の使用(ここではカバーされていない)は、生体安全キャビネット内での取り扱い、無菌器具の使用、歯周病原体を伴う口腔の接種を義務付け、歯周炎の臨床症状を引き起こす。

1. 8~12週齢の雄C57BL/6マウスに腹腔内麻酔を投与し、認可された制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)ガイドラインに従って、0.5"26 G滅菌皮下注射針と1 mL注射器を使用して、彼らの住宅施設に順応する必要があります。
   注:ケタミン(100 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)の組み合わせは、手順の期間中に麻酔の適切なレベルを迅速かつ確実に誘発します。
2. ペダル反射の損失によって証拠として、手順中に麻酔深度を15分ごとに評価します。
3. 加熱された手術用プラットフォームにマウスを置きます (図 1A)。弾性バンドを使用して開放位置で上顎と下顎を安定させ、首を綿ロールでプロップして、上顎をより水平方向に維持するのを助ける(

結果

ナイーブ(図3A)および炎症を起こした(図3B)マウス口腔から合字誘発歯炎に続く経口リンス試料からの代表的なフローサイトメトリーデータが提供される。インストール済み合字からの PMN の回復も示されています (図 3C)。フローサイトメータチャネル電圧を手動で校正し、単一染色補償ビーズで補償を行った。PMNは、輪郭ゲーティング戦略³⁸を使用してLy6G^+veF4/80^-veとして定義されました。各経口リンスおよび合字サンプルから最低500個のゲートPMNイベントが取得されました。PMN生存率はトリパンブルー染色により約37%と判定した。肺胞骨紋(ABC)から健康なセメントエナメル接合部(CEJ)に測定した肺胞骨レベルの代表的な画像(図4A)

ディスカッション

歯周炎のマウス合字誘発モデルの使用に関連する最も重要な要素は、犠牲または意図的な除去の時まで合字の保持を中心とする。設置されたバイオフィルム-リテンション合字は、わずか6日間で歯槽骨の高さの有意な損失を誘導することができ、11〜16日周期³⁹の間に高原化する。骨損失の最大期間の前に動物の被験者を犠牲にするという決定は、合字誘発歯炎のはるかに短いモデルをレンダリングし、動物の非診断を引き起こす犠牲の時間の前に合字の損失として定義される早期合字のアバルジョンの発生率をさらに減少させるために選択された。

このモデルの最も一般的に引用される欠点は、4.4mm(M1)から2.6mm(M3)40までの周囲の小さな大きさのマウスモル歯列寸法に起因する合字を設置することの技術的な難しさを強調している。この問題は、(最大で)10分/動物を必要とし、麻酔の送達を含む合字のインストールのための外科スタッフ/研修生の関与を通じて軽減することができます。さらに、合字の配置は繰り返しによって習得されたスキルであり、.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗マウスF4/80	BioLegend		123131 BV421、クローンBM8
抗マウスLy6G抗体	BD	560602	PerCP-Cy5.5、クローン1A8
C57BL/6 雄マウス	チャールズリバー		8〜12週齢
円錐形遠心チューブ	FroggaBio	TB15-500	15 mL
円錐形遠心チューブ	FroggaBio	TB50-500	50ミリリットル
FACSバッファー	マルチプル		%BSA(BioShop)、2mM EDTA(メルク)、1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		モデル180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
療法ポンプHallowell			HTP-1500
ホットガラスビーズ滅菌器	電子顕微鏡科学	66118-10	Germinator 500
Iris はさみ	Almedic	7602-A8-684	ストレート
ケタミン	ベトキノール		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
マウス血清	Sigma	M5905-5ML
ナイロンメッシュフィルター	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-547	40 &マイクロ;m
パラホルムアルデヒド	フィッシャー サイエンティフィ	28908	16% (w/v)、メタノール フリー
リン酸緩衝生理食塩水	Σ	D1408-500ML	CaCl2 および MgCl2、10x
プラスチック使い捨てシリンジ	BD	309659	1 mL
ラット血清	Σ	Σ R9759-5ML
シルク縫合糸	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
スプリンター鉗子	Almedic	7726-A10-700	#1
スプリンター鉗子	Almedic	7727-A10-704	#5
立体解剖顕微鏡	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
滅菌低デミック針	BD	305111	26G X 1/2"
シリンジ	BD	309659	1 mL
キシラジン	ロンプン		20mg / mL

抗体1熱ック