本報告では、免疫組織化学(IHC)のための凍結マウス網膜切片を準備するための包括的な方法について説明する。 記載された方法は、眼後カップの解剖、パラホルムアルデヒド固定、最適切断温度(OCT)培媒体および組織配向への埋め込み、断断および免疫染色を含む。
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この記事について
サマリー
要約
免疫組織化学(IHC)のための高品質のマウス眼科の準備は、再生体の構造と機能を評価し、および再生疾患の根底にあるメカニズムを決定するために重要です。組織の調製全体を通じて構造的完全性を維持することは、再現可能な再生可能な再生IHCデータを得るために不可欠ですが、再生細胞構造の脆弱性と複雑さのために困難な場合があります。10%ホルマリンまたはBouinの溶液のような強力な固定剤は、尾膜構造を最適に保存し、それらはしばしば背景蛍光および/または減少する抗体エピトープ相互作用を増強することによってIHC分析を妨げる、エピトープマスキングとして知られているプロセスである。一方、穏やかな固定剤は、4%パラホルムアルデヒドのように、背景蛍光およびエピトープマスキングを減少させ、細心の注意を払って解剖技術を利用して、尾膜構造を維持しなければならない。本稿では、網膜構造完全性を損なうことなく、ほとんどの抗体エピトープ相互作用を維持するのに十分なIHC用マウス眼後カップを調製する包括的な方法を提示する。我々は、最適かつ最適でない条件下で組織の保存と向きを示すために、様々な再生細胞型マーカーに対する抗体を有する代表的なIHCを含む。私たちの目標は、眼後カップ解剖からIHCへの完全なプロトコルを提供することにより、網膜のIHC研究を最適化することです。
概要
免疫組織化学(IHC)は、その中の組織における特定のタンパク質および細胞構造を局所化するための強力な技術である1,2,3.複雑な組織の不適切な固定方法と最適でない断面は、組織構造を破壊し、高いバックグラウンド染色を生成したり、抗体エピトープ相互作用を減少させたり、染色アーティファクトおよび結果的に誤解を招く可能性があります。IHC データ4.脊椎動物網膜は、相互接続された光受容体、インターニューロンおよび神経節細胞の層から構成される複雑で高度に組織化された神経器官であり、非常に壊れやすく、解剖および切断中に容易に破壊されうる。マウスの眼の解剖とオリエンテーションから免疫染色までの詳細で標準化された検証済みのプロトコルは、IHCアーティファクトを大幅に削減し、結果の信頼性を高め、より正確な比較データを可能にします。分析。
IHCの組織調製のための多くのプロトコルがありますが、すべてがリニア組織に適しているわけではありません。10%ホルマリンやBouinの溶液のような強力な固定剤は、解剖および断面5の間に尾膜構造を保持する。残念ながら、強力な固定剤は、多くの場合、エピトープ6の化学修飾による強化された....
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プロトコル
ここに記載されているすべての方法は、実験動物資源研究所が提供する実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所の勧告に従って厳格に実施され、ペンシルバニア大学の施設動物ケア・使用委員会
この方法のすべてのツールと機器を図 1に示し、材料の表に示します。
1 .マウスの目のエニュレーション、アイカップの解剖、および埋め込み
- 二酸化炭素(CO2)でマウスを安楽死させ、その後に切断(出生後マウスP0-P11)または子宮頸部脱臼(成人>P11マウス)のいずれかが続く。P0-P14マウスの場合、目は皮膚で覆われています。後続の手順の前に、皮膚を取り除くようにしてください。
- テール焼灼器を使用して角膜をわずかに燃やして、眼の時間的な部分(図2A)をマークします。角膜に非常に軽く触れ、焼灼器で1秒以下で角膜に穴を開けないようにしてください。
- 湾曲したデュモン#5/45鉗子を使用して、マウスの目を直ちに取り込みます。1.5 mLのクライオチューブチューブで15分間インキュベートし、1mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を氷上のリン酸緩衝生理食液(PBS)でインキュベートします。
- 4%P....
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結果
これらのプロトコルを説明するために、IHCに最適な網膜保存を確保するために、我々はロドプシン(光受容体マーカー)8、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(Gad65、アマクリン細胞)に対する抗体を用いてP28 WTマウス(C57BL/6N)から網膜切除を調べた。マーカー)9、グルタミン合成酵素(GS、ミュラー細胞マーカー)10、及びカルビンジン(水平細胞マーカー)11(図4)。IHCは、当社のプロトコルが一貫して高品質で保存された樹脂セクションを生み出していることを示しています。特に、ロドプシンが豊富な内側および外側のセグメントは垂直であり、網膜色素上皮(RPE)の上に横たわってからほとんどまたは全く分離しないままである(図4A)。さらに、ミュラー細胞は、神経節細胞層.......
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ディスカッション
マウス網膜解剖は、マウスの目の小さなサイズと形状と網膜組織の脆弱性による繊細なプロセスです。高品質の解剖を行うことは実践の問題ですが、詳細なプロトコルを持って、効率的な方法とヒントを提供することは、再生部とIHCを得るために必要です。ここで説明するプロトコルに加えて、再現可能な IHC に適した一貫した高品質の整膜セクションを可能にするいくつかのヒントがあります。
解剖を始める前に、マウスの目の微細解剖の間に最適な視力のための部屋の照明を快適に、リラックスして設定することが重要です。目を解剖しながらマウスアイカップの形状を維持するために、我々はカスタムメイドのワックスコーティング解剖皿でPBSに目を沈めておくことをお勧めします。薄いピンク色の歯科用ワックスで35mm解剖皿を塗布することをお勧めします(図1C)。確かに、歯科ワックスの明るいピンク色は、解剖範囲の下で容易に目の構造を見るのに十分なコントラストを提供し、ワックスの目の大きさの印象は、ワックスにマイクロフュージチューブのベースを押すことによって作られ、アイカップを.......
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謝辞
本研究は、NIH(RO1-GMO97327)と大学研究財団(UPenn)の資金で支援されました。特にスヴェトラーナ・サヴィーナが免疫組織化学プロトコル、ゴードン・ルセル(ペンシルバニア大学)、ペン・ヴェット・イメージング・コアの顕微鏡検査とレスリー・キング博士の助けを借りて、この原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。.
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 6クォート ステンレス製ビーカー (185 x 218mm) | ギルソン | #MA-48 | 液体窒素用(図1E) |
| アルミ箔 | |||
| 焼灼器 | Bovie | #AA01 | 目の向きを示すために(図1A) |
| 湾曲した鉗子、Dumont #5/45ピンセット、45度曲げ | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | マウスの眼球摘出術とメンテナンス用(図1A) |
| 湾曲ハサミ、バンナススプリングハサミ-2.5mmカッティングエッジ | ファインサイエンスツール | #15002-08 | 角膜を円周方向に切断するには (図 1B) |
| 歯科用ワックスコーティング 35mm 解剖皿 | アイカップ解剖用 (図 1C) | ||
| 解剖顕微鏡 | ライカ、ヒューストン、米国 | MZ12.5 高性能実体顕微鏡 | |
| マイクロナイフ プラスチックハンドル | ファインサイエンスツール | #10315-12 | 焼け跡を小さく切開するには (図 1A) |
| ピンクの歯科用ワックス | 電子顕微鏡科学 | #72660 | コーティング解剖皿 |
| 用スライドラックとカバープレート | テッド・ペラ | #36107 | 網膜IHC用(図1G) |
| ステンレス製ビーカー(89×114mm) | ギルソン | #MA-40 | イソペンタン浴用(図1E) |
| 発泡スチロールボックス | 断熱クーラー用 | ||
| 薄型鉗子デュモン #5 | ファインサイエンスツール | #11254-20 | 膜を取り外してレンズを抽出するには (図 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | 電子顕微鏡科学 | #62534-10 | OCT埋埋込 |
| 用金型バッファーおよび試薬 | Company | カタログ番号 | コメント |
| ブロッキング溶液 | 2%正常馬血清、1.5%冷魚皮ゼラチン(H2O中40-50%、猫 #G7765)、5%ウシ血清アルブミン(猫 #AK1391-0100)の透過化緩衝液中。 | ||
| ゲルバトール(退色防止封入剤) | ヒュームフードの下に、0.337gのDABCO(シグマキャット #D2522-25G)を10mLのフルオロマウントG(フィッシャーキャット #OB100-01)に溶かします。12N HCl(~5滴)でpH 8-8.5に調整します。 琥珀色のドロップボトルに4°Cで保管してください。C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x).アリコートして暗闇で4°Cで保管します。Cは最長1年間または-20°C。Cは長期保存用。新鮮なものを準備する 1 ug/mL (1x)で |
| イソペンタン、99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| 液体窒素 | |||
| パラホルムアルデヒド(PFA) | #15710 | 16% PFA ストックから新鮮な 4% PFA を調製しました。残りの16%PFAを4°Cで保存します。暗闇の中のC. | |
| 透過処理液 | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. 新鮮なものを準備します。 | ||
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. 10倍の在庫から調製 |
| ショ糖溶液 | フィッシャーサイエンティフィック | #S-5-500 | 適量のスクロースを 37°に溶解します。C PBS(溶解するのに~15分かかります)。4°Cで数日間保管できます。 |
| Tissue-Tek OCTコンパウンド | 桜 | #4583 | |
| Antibodies | 会社 | カタログ番号 | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | ホリンゾタール細胞を標識する |
| 抗GAD65 | Chemicon | AB5082 | GABA作動性アマクリン細胞の標識 |
| 抗GS | BD形質導入 | 610517 | Müの標識;ller細胞 |
| 抗ロドプシン | ミリポア | MAB5316 | ラベルロッドに |
参考文献
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H.
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再版と許可
