方法論記事

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

DOI：

10.3791/59690

⸱

2019年7月11日

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

パーキンソン病(PD)は、腹部メセンスファロン(VM)における基数ニグラパースコンパクター(SNpc)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる。細胞置換療法はPDの治療に大きな期待を寄せており、最近、腫瘍形成のリスクが低下し、可塑性が生じるため、誘導神経幹細胞(iNSC)が細胞補充療法の候補として浮上している。領域特異的ニューロンとグリア。iNSCは、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMNC)および様々な他のタイプの細胞などの自家体細胞源から再プログラムすることができる。他のタイプの体細胞と比較して、PBMNCは培養中にアクセスし、拡大しやすいので魅力的なスターターセルタイプです。センダイウイルス(SeV)は、ヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子をコードするRNA非統合型ウイルスであり、ネグレーション、一本鎖、非セグメントゲノムを有し、 宿主ゲノムは、感染した細胞の細胞質でのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する。本研究では,PBMNCを再プログラミングしてiNSCを得るプロトコルを用いて,2段階の方法で特殊なVM DAニューロンに分化するプロトコルについて述べた.次に、DA前駆体を一方的に6-ヒロキシドパミン(6-OHDA)病変PDマウスモデルに移植し、PDの治療の安全性と有効性を評価する。この方法は、インビトロおよびインビボにおける患者特異的DA神経細胞の機能および治療効果を調べるためのプラットフォームを提供する。

概要

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パーキンソン病(PD)は、視室メゼンサロン(VM)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる一般的な神経変性疾患であり、60歳以上の人口で1%以上の有病率を有する。1,2.過去10年間にわたり、細胞療法は、変性または損傷した細胞を置き換えるか、または変性ニューロンの周りの微小環境に栄養を与えることを目的とし、PD3の治療における可能性を示している。一方、リプログラミング技術は、補充療法のための有望な細胞源を提供する4、大きな進歩を遂げました。ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)と胚性幹細胞(ESC)は、ラットおよび非ヒト霊長類PDモデルに移植すると、生き残り、母性、運動機能を改善することができるDA神経細胞に分化できることが証明されている5 ,6,7,8.iPSCは細胞リプログラミング技術のマイルストーンであり、細胞移植の大きな可能性を秘めています。しかし、不完全に分化した細胞からの腫瘍形成のリスクについては、依然として懸念がある。細胞移植のための代替細胞源は、不安定な中間体から導き出すことができる誘導神経幹細胞(iNSC)などの直接リプログラミングを通じて得られた系統コミット成人幹細胞であり、多能性をバイパスするステージ9,10,11.

iPSCとiNsCの両方は、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMcNC)および様々な他のタイプの細胞12、13、14などの自家細胞源から再プログラムすることができ、したがって、移植細胞の免疫原性を大いに高める。さらに、iPSCと比較して、iNSCは腫瘍形成および系統コミット可塑性のリスクが減少し、ニューロンおよびグリア11に区別することができるだけである。初期研究では、ヒトまたはマウスのiPSCおよびiNSCは、侵襲的処置14、15である皮膚生検から得られた線維芽細胞から生成された。これに関して、PBMNCは、侵襲性の低いサンプリングプロセスのため魅力的なスターター細胞源であり、拡張時間16の短い期間内に多数の細胞を得ることが容易である。初期のリプログラミング研究では、レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどの統合デリバリーシステムを採用し、多くのタイプの細胞で効率的かつ簡単に実装できます17;しかしながら、これらの送達システムは、残留トランスジーンの変異および再活性化を引き起こす可能性があり、これは臨床治療目的12の安全性問題を提示する。センダイウイルス(SeV)は、宿主ゲノムに統合されない負感のある一本鎖ゲノムを持つ非統合型RNAウイルスであるが、感染細胞の細胞質中にのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する18 、19.組換えSeVベクトルは、オープンリーディングフレームにヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子を含む利用可能です。 さらに、SeVウイルスベクターは、温度感受性変異を導入することによってさらに改善することができ、培養温度が39°C20に上昇したときに迅速に除去することができる。この記事では、SeV システムを使用して PBMC を iNsC に再プログラムするプロトコルについて説明します。

多くの研究は、様々な方法を使用してヒトESCまたはiPSCからDAニューロンの誘導を報告しています 6,8,21.しかし、iNSCからのDAニューロンの分化を詳細に説明するプロトコルが不足しています。このプロトコルでは、2段階法を用いてiNSCからのDAニューロンの効率的な生成について述べた。DAニューロン前駆体は、安全性および有効性評価のためのPDマウスモデルの線条体に移植することができる。本稿では、仙台ウイルスによる誘導神経幹細胞の生成、DAニューロンへのiNSCの分化、マウスPDモデルの確立、DA前駆体の線条体への移植まで、様々な段階をカバーする詳細なプロトコルを紹介する。PDモデルの。このプロトコルを使用して、患者や健康なドナーからiNSCを生成し、細胞移植の目的のために安全、標準化、スケーラブルで均質なDAニューロンを導き出したり、皿の中でPDをモデル化したり、メカニズムの調査を行うことができます。根本的な病気の発症と発症。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての手続きは、制度的な人間研究倫理委員会のガイドラインに従わなければならない。インフォームド・コンセントは、採血前に患者または健康なボランティアから得る必要があります。このプロトコルは、機関の人間研究倫理委員会によって承認され、動物のケアと使用のための機関のガイドラインに従って行われました.

1. PBMNCの収集、隔離、拡張

  1. PBMNCのコレクション
    1. ヘパリン防腐剤バイアルで静脈穿刺することにより、ドナーの末梢静脈血の10-20 mLを収集します。
      注:血液サンプルは室温(RT)で保存または出荷する必要があります。24時間以内に血液サンプルを処理します。
  2. 培養培地の調製
    1. 以下の成分を組み合わせて血清フリー培地(SFM)を調製:イコーブの改変ダルベッコ培地(IMDM)の245mL、ハムのF-12の240mL、インスリン-トランスフェリンセレン-Xサプリメント(ITS-X)の5mL、100倍のグルタミンストック溶液の5mL(表材料は、化学的に定義された脂質濃縮物の5mL、胎児ウシ血清の2.5g、アスコルビン酸の0.025gおよび1-チオグリセロールの9μLである。培地をろ過し、4°Cに保存します。
      注意: アスコルビン酸と1-チオグリセロールは、皮膚接触と吸入によって有毒です.
    2. 単核細胞(MNC)培地を調製するには、SFM培地を10ng/mLヒトインターロイキン3(IL-3)、2 U/mLエリスロポエチン(EPO)、100ng/mLヒト幹細胞因子(SCF)、40ng/mLヒトインスリン様成長因子1(IGF-1)、100gμ/mLホロを補うμM デキサメタゾン培地をろ過し、4°Cに保存します。
      注: 使用する直前にメディアを準備します。
  3. PBMNC の分離
    1. 使用前にきれいなベンチを紫外線殺菌する。75%のアルコールですべての表面および装置を殺菌する。オートクレーブを使用してすべてのヒントを殺菌します。
    2. 末梢血(PB)を50mL円錐管に移し、無菌ダルベッコのリン酸緩衝生理食生(D-PBS)の等容積でPBを希釈する。
    3. 殺菌密度勾配媒体(材料のテーブル)の15 mLを別の50 mL円錐形の管に準備する。
      注: PBMNC をより良く分離できるように、密度グラデーションメディアとPBをRTに保持します。
    4. 密度勾配媒体を含む円錐管を45°の角度で傾け、その後、ゆっくりと慎重に30 mLの希釈PBを密度勾配媒体に置きます。
      注:注意して、PBがゆっくりと密度勾配中層に円錐管の側面を実行できるようにします。赤血球は管の底に沈着するレイヤインターフェイスの中断を最小限に抑えるためにチューブを慎重に傾けます。
    5. 遠心ブレーキを「オフ」位置に設定したRTで800 x gのチューブを15分間遠心分離します。黄色、上部プラズマ層を吸引し、それを破棄します。次に、10 mLピペットでMNCを含む白い曇り薄膜層を新しい50 mL円錐管に移します。
      注:遠心ブレーキを切り替えるには、MNCの分離に重要です。
    6. MNCと遠心分離機でチューブに30 mLのD-PBSを加え、600 x gで4°Cで10分間使用します。上清を廃棄し、45 mLのD-PBSを加えて細胞を再懸濁させる。4°Cで10分のための400 x gの遠心分離機。
      注:遠心ブレーキは、これと次の遠心分離ステップのためにオンにする必要があります。細胞ペレットが密集しているので、D-PBSの1-2 mLを加えてペレットを穏やかに再中断し、次に45 mLにD-PBSを加えます。
    7. 上清を廃棄し、D-PBSの5 mLで細胞を再懸濁し、トリパンブルー排除法で生細胞をカウントします。
    8. 拡張に必要な MNC を脇に置いた後、残りのセルをフリーズして将来使用します。
      注:少なくとも5 x 106 MNCは凍結媒体の1 mL(材料のテーブル)の1つのバイアルで凍結することができる。プロトコルはここで一時停止できます。
  4. MNCの拡大
    1. 14日目に、予温められた(37°C)MNC培地の1.5 mLの6ウェルプレートの1つの井戸で1ミリリットル当たり2-3 x 106細胞の密度でMNCを種子。37°C、5%CO2で2日間インキュベートします。
    2. 11日目に、殺菌されたピペットで細胞と培地を収集し、新しい15 mL円錐形チューブに移します。RTで250 x gで細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、予め温められた(37°C)MNC培地の1 mLで細胞を再懸濁する。
    3. トリパンブルーで実行可能なセルをカウントします。予め温められたMNC培地で1ミリリットル当たり1x106細胞の密度でMNCを播種し、37°C、5%CO2で3日間インキュベートする。
      注:11日目には、細胞の総数が減少する可能性があります。
    4. 8日目にステップ1.4.2-1.4.3を繰り返し、細胞を3日間培養する。
    5. 4日目に、ステップ1.4.2-1.4.3を繰り返し、細胞を3日間培養する。
      注: 14 日間のカルチャの後、同等以上の数の MNC がカルチャに残る必要があります。

2. SeV感染によるiNsCへのPBNCの再プログラミング

  1. 溶液・培養培地の調製
    1. 1mg/mLの濃度にH2 Oの100 mLでPDLの100mgを溶解することにより、ポリD-リジン(PDL)ストック溶液を調製する。-20 °Cを1mLのアリコートで保存します。
    2. 0.01 N HClの20mLに100mgのインスリンを5mg/mLの濃度に溶解することによりインスリンストック溶液を調作する。-20 °Cを1mLのアリコートで保存します。
    3. iNSC基底培地の200mLを調製するには、DMEM-F12の96mLと96mLの塩基性培地(材料表)と100倍グルタミンストック溶液の2mL、非必須アミノ酸(NEAA)の2mL、N2サプリメント2mL、B27サプリメント2mLを組み合わせます。10 ng/mL組換えヒト白血病阻害因子、3 μM CHIR99021および2 μM SB431542を使用前に追加します。培地をろ過し、4°Cに保存します。
      注:2週間以内に媒体を使用してください。組換えヒト白血病阻害因子、CHIR99021およびSB431542を使用直前に添加する。
  2. SeV感染によるINSCへのPBMCのリプログラミング
    1. 使用前にきれいなベンチを紫外線殺菌する。75%のアルコールですべての表面および装置を殺菌する。オートクレーブを使用してすべての先端を殺菌します。
    2. 0日目に、MNC培地で細胞を集め、15 mL円錐管に移す。細胞を200 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引し、予め温められたMNC培地の1 mLで細胞を再中断する。
    3. トリパンブルーで実行可能なセルをカウントします。予温められた(37°C)MNC培地で細胞を24ウェルプレートでウェル当たり2 x 105細胞の濃度に再び中断する。
    4. -80 °Cの貯蔵からSeV管を取り除き、37°Cの水浴でSeVを含むチューブを5〜10sで解凍し、RTで解凍できるようにします。解凍したら、すぐに氷の上に置きます。
    5. ヒトKlf4、10月3/4、SOX2およびc-MyCをウェルに10の多重感染(MOI)でエンコードするSeVを追加する。細胞の付着を容易にするために1,000 x gの1,000 x gのプレートを持つ遠心分離機の細胞。細胞と上清をプレートに残します。プレートをインキュベーターに37°C、5%CO2に置きます。
      注意:SeVに関するすべての手順は安全キャビネットで行う必要があり、すべての先端およびチューブは処分前にエタノールまたは漂白剤で処理する必要があります。
    6. 1日目に、培地と細胞を15mL遠心管に移します。MNC培地の1mLで井戸をすすいで下します。200 x gでセル懸濁液を5分間遠心分離し、上清を吸引し、24ウェルプレートで500μLの新鮮な予温められたMNC培地で細胞を再懸濁します。
      注:PDL/ラミニンにめっきする前に、任意の細胞の付着を防ぐために、低アタッチメント24ウェルプレートを使用してください。
    7. 2日目に、D-PBSの19 mLで1mg/mL PDLの1mLを50μg/mLの濃度に希釈する。RTで少なくとも2時間の50 μg/mL PDLで6ウェルプレートをコーティングします。
    8. D-PBSの20 mLで0.5mg/mLラミニンの200 μLを5μg/mLの濃度に希釈します。6ウェルプレートにPDLを吸引し、垂直クリーンベンチで乾燥させます。
    9. 5 μg/mLラミニンで6ウェルプレートをコーティングし、37°Cで4-6 hのインキュベートします。使用前にD-PBSで洗い流してください。
    10. 3日目に、PDL/ラミニンコーティングされた6ウェルプレート上のiNSC培地でステップ2.2.6で得られたトランスメ下細胞をプレート化する。
      注:細胞がPDL/ラミニンコーティングされたプレート上に置かれた後、細胞の付着を妨げないように、必要に応じてプレートを穏やかに動かします。
    11. 5日目には、6ウェルプレートに各ウェルに予め温めた(37°C)iNSC培地を1mL加えます。
      注:細胞は劇的な死(>60%)を受けることが予想されます。
    12. 7日目には、6ウェルプレートに各ウェルに予め温めた(37°C)iNSC培地を1mL加えます。
    13. 9日目から28日目まで、使用済み培地を毎日新鮮な予温め(37°C)iNSC培地に置き換えます。iNSC コロニーの出現を監視します。約2〜3週間で拡張のためのiNSCクローンをピックして転送します。焼かれたガラスピペットを使用して適切な形態を持つコロニーをピックアップし、汚染細胞を除き、200 μLの先端でコロニーを吸引します。
      注:特徴付けられたiNsCは1つのバイアルの2-5コロニーとの将来の使用のために凍結することができる。凍結培地には、血清フリー基底培地(材料表)とジメチルスルホキシドを9:1の比率で混合し、使用直前に調製する必要があります。プロトコルはここで一時停止できます。

3. ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化

  1. 溶液・培養培地の調製
    1. DMEM-F12の192mLを100倍グルタミンストック溶液の2mL、NEAAの2mL、N2サプリメントの2mL、B27サプリメントの2mLを組み合わせて200mLのiNSC分化基底媒体を調製する。
      注:2週間以内に媒体を使用してください。
    2. iNSC分化段階I培地を1μM SAG1及び100ng /mL FGF8bでiNSC分化基底媒体を補記して調記する。
      注:2週間以内に媒体を使用してください。
    3. iNSC分化段階II培地を0.5mM環状アデノシン一リン酸(cAMP)、0.2mMアスコルビン酸、10μM DAPT、10 ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)、10ng/mLグリアル由来で補うiNSC分化期II培地を調べニュートフロン症因子(GDNF)および1 ng/mL形質転換増殖因子βIII(TGF-βIII)。
      注:2週間以内に媒体を使用してください。
  2. 文化料理のコーティング
    1. 使用前にきれいなベンチを紫外線殺菌する。75%のアルコールですべての表面および装置を殺菌する。オートクレーブを使用してすべての先端を殺菌します。
    2. PDLコーティングの場合、細胞を再めっきする少なくとも1日前に、D-PBSの19 mLで1mg/mL PDLの1mLを50μg/mLの濃度に希釈する。コート12ミリメートルガラスカバーリップは、少なくとも2時間RTで50 μg/mL PDLと24ウェルプレートで75%アルコールで殺菌されたスリップ。
    3. ラミニンコーティングの場合は、0.5mg/mLのラミニンを20mLのD-PBSで5μg/mLの濃度に希釈します。PDLを吸引し、きれいなベンチで井戸を乾燥させます。12 mm カバースリップを 5 μg/mL ラミニンでコーティングし、37 °C で 4-6 h のインキュベートします。使用前にD-PBSで洗い流してください。
  3. 分化のための通過細胞。
    1. 培養iNSCの合流が70〜90%に達すると、培養プレートから培地を吸引し、1mLのD-PBSを加えて細胞を洗浄する。予め温めた(37°C)細胞解離試薬(材料の表)をウェルごとに1mL加え、37°Cで3分間インキュベートして細胞を解離します。
    2. 3分間のインキュベーションの後、細胞は半浮遊している。予め温められた(37°C)DMEM-F12培地をウェル当たり3mL加え、ピペット細胞を上下に加えて細胞ペレットを単一細胞に解離させる。
    3. 細胞を15mL円錐管に移し、250 x gで3分間遠心分離機を上清を吸引し、細胞数に応じて予め温めた(37°C)iNSC培地の適切な体積で細胞を再中断する。
    4. トリパンブルーの除外方法を使用してセルをカウントします。24ウェルプレートで12mmガラスカバーあたりプレート5 x 103セルを滑り、37°C、5%CO2でインキュベートします。
  4. ドーパミン作動性ニューロンに iNSC を区別します。.
    1. 細胞をPDL/ラミニンコーティングされたカバーリップに再めっきした後、24時間分化を開始します。吸引培地培地を、D-PBSで細胞を1回洗浄し、次いで24ウェルプレートに1回の温め前分化段階I培地を加え、37°C、5%CO2でインキュベートする。
    2. 分化の最初の段階で、1日目から10日目まで毎日媒体を変更します。
    3. 10日目に培養培地を吸引し、D-PBSで細胞を1回洗浄する。24ウェルプレートに600μLの予温め(37°C)分化段階II培地をウェル当たり追加し、37°C、5%CO2でインキュベートします。
    4. 分化の第2段階では、11日目から25日目まで1日おきに媒体を変更します。分化した細胞は、分析のために異なる時点でパラホルムアルデヒドによって固定することができる。
    5. 免疫蛍光染色の場合は、分化11~25日目内に選択した時点でD-PBSで細胞を3回穏やかに洗浄する。
    6. ピペット300μLのニオニオン界面活性剤(材料表)をPBSの100mLにして、PBSで0.3%のニオニオン界面活性剤を作ります。
      注意:ニオニオニック界面活性剤は、皮膚接触および吸入によって有毒である。
    7. RTで10分間4%のパラホルムアルデヒドで細胞を固定します。その後、PBSで0.3%で3回洗浄します。
      注意:パラホルムアルデヒドは、皮膚の接触と吸入によって有毒です。
    8. RTで2時間3%ロバ血清で細胞をブロックします。
    9. 一次抗体を適切な濃度で1%ロバ血清で希釈し、穏やかに混合する。24ウェルプレートの各ウェルに一次抗体溶液の300μLを添加する。細胞を一晩4°Cでインキュベートする。PBSで0.3%のニオニオン界面活性剤で細胞を3回洗浄する。
    10. 適切な濃度で1%ロバ血清で二次抗体を希釈し、穏やかに混合するトリチュレート。24ウェルプレートの各ウェルに300μLの二次抗体溶液を添加する。光から保護された2時間RTで細胞をインキュベートする。
    11. PBSで0.3%のニオニオン界面活性剤で細胞を3回洗浄する。希釈 4',6-ジアミド-2-フェニリンドール (DAPI) 1:500 希釈を伴う PBS を使用します。光から保護されたRTで15分間希釈DAPIの300 μLで24ウェルプレートの各ウェル内の細胞をインキュベートします。PBSで0.3%のニオニオン界面活性剤で細胞を3回洗浄する。
    12. 鉗子でプレートの井戸からカバーリップをそっと取り出します。RT.蛍光顕微鏡下で一晩暗く乾燥します。

4. 一方的な6-ヒロキシドパミン(6-OHDA)病変PDマウスモデルの確立

  1. 細胞移植のためのPDマウスモデルを生成するには、6-OHDA注射のために20〜25gの重さの成人男性SCIDベージュマウスを使用する。
  2. 手術用薬剤の調製
    1. 殺菌生理食塩水の0.2gを100mLの殺菌生理食塩水(0.9%)に溶解することにより、0.2%のアスコルビン酸溶液を調出す使用するまで-80°Cで保管してください。手術当日、0.2%のアスコルビン酸溶液を10倍希釈し、0.02%のアスコルビン酸溶液を得た。
      注:アスコルビン酸は、不活性形態に6-OHDAの酸化を防ぐために添加されます。
    2. 6-OHDA溶液を調製するには、6-OHDAの適量を殺菌した1 mLチューブに加え、0.02%のアスコルビン酸を加えて5μg/μL 6-OHDA溶液を作ります。溶解するまで混合物を渦。使用するまで氷の上に6-OHDAを置く。
      注:6-OHDAは温度および光に敏感である。溶液を光から保護し、使用前に氷の上に保管するように注意してください。
  3. 手術前にオートクレーブによって殺菌された外科装置を準備する。ステレオタックスフレームを設定する際は、エタノールですべての機器と表面領域を清掃してください。暖房ランプの下にマウス回復ケージを設定します。
  4. 一方的な6-OHDA病変マウスモデルを確立するための手術を行う。
    1. 各マウスの重量を量り、体重を記録し、投与する必要がある薬物の量を計算します。各マウスは、手術の20分前に0.5 mg/kgのアトロピンを受け取ります。80 mg/kg ケタミンと 10 mg/kg キシラジンでマウスを麻酔する.
    2. 精米注射による 0.5 mg/kg アトロピンを投与します。.
    3. アトロピンの投与後20分で80mg/kgケタミンと10mg/kgキシラジンでマウスを麻酔する。
    4. マウスを閉じた部屋に入れてください。3-5分後、マウスは後ろ足のピンチに応答することなく深く麻酔されます。
      注:麻酔を受けたマウスは興奮期間を経験することが予想されます。
    5. マウスの頭部を剃り、角膜潰瘍の発症から保護するためにマウスの目にエリスロマイシン目のチントを適用します。
    6. マウスを立体装置の上に置きます。最初に切り傷バーでマウスを固定します。イヤーカップを正しく挿入して、マウスヘッドを平らで安全な位置にします。
    7. ポビドネヨウ素とイソプロピルアルコールでマウスの頭部を殺菌します。頭の皮に矢状切開(約1.5cm)をメスブレードで切り取り、頭蓋骨を露出させる。切開部バーとイヤーバーを調整して、ブレグマとラムダの高さの差を0.1mm未満に減らします。
      注:マウスブレグマは、冠状動脈縫合糸と矢状縫合糸の交点に位置し、ラムダはラムドイドと矢状縫合糸の交点にあります。
    8. ゆっくりとブレグマに向かって針の先端を動かして下げ、ブレグマをゼロ点として扱います。先端を A/P +0.5 mm、M/L -2.1 mm の座標を持つ位置に移動します。先端を引き込み、ポイントをマークします。頭蓋骨に小さな穴を開けて
    9. 5 μg/μL 6-OHDA溶液の2 μLをマイクロシリンジ(材料の表)に抽出します。針をマークした点に戻し、針をD/V -3.2 mmに挿入します。
    10. 5 μg/μL 6-OHDA 溶液の 2 μL を 1 μL/分の速度で注入します。6-OHDAの注入が完了した後、別の5分間所定の位置に針を残します。その後、注射針をゆっくりと引き込みます。
    11. 縫合糸で切開を閉じ、マウスの目にエリスロマイシン目の斑点を適用します。脱水を防ぐために皮下に0.5mLの生理食水を提供し、縫合された皮膚に直接抗生物質の防血を適用する。
    12. 立体装置からマウスを取り出し、回収ケージに入れます。マウスを戻し、意識を取り戻すまで食べ物と水へのアクセスを許可します。2-3日間の飲料水の毎日の手術後に鎮痛薬でマウスを治療し、イブプロフェンの推奨投与量は1日あたり0.03mg/gの体重です。
    13. 手術後の毎日のマウスを検査します。

5. 一方的な6-OHDA病変後の行動評価

  1. 手術後2~3週間、PD症状を推定する行動評価を行う。各マウスの重量を量り、体重を記録し、投与すべき薬物の量を計算する(評価前に0.5 mg/kgアポモルフィン)。
  2. 評価の前に皮下注射で0.5mg/kgのアポモルヒネを投与し、マウスをガラスシリンダーに入れます。
  3. 5分間の居住期間の後、1分あたりの病変側に対する反対側およびipsial回転の数をカウントし、ビデオカメラでその活動を記録する。
  4. 反対のマイナスipsial回転>7 rpm/minを有するマウスは、正常に病変化され、細胞移植実験の候補として選択される。30分の休息後にマウスをハウジングケージに戻します。
    注:マウスが正常に病変された場合、6-OHDA注入マウスは、DAアゴニストが主に病変側の超敏感転逸線を活性化するので、反対側に向かってより大きなバイアスを示す。
  5. 細胞移植後1週間前および2、4、6、8、12、16週前に行動評価を行う。

6. DA前駆体の細胞移植

  1. 移植のための細胞懸濁液を準備します。細胞生着の場合、D10とD13 DA前駆体を混合した2 x 105 DA前駆体を、移植バッファーのバランス塩溶液(材料表)における5gL-1グルコースの4μLの1:7の割合で中断する。
  2. セクション4.4に記載の手順に従って細胞移植手術を行い、6-OHDAがDA前駆体細胞懸濁液またはバッファーに置き換えられることを除く。
  3. 第5項に記載の手順に従ってDA前駆体の細胞移植後16週後に行動評価2、4、6、8、12、16週を行う。1 分あたりの病変側に対するアポモルフィン誘発逆側回転の数をカウントし、ビデオ カメラでその活動を記録します。
    注:移植後、反対の回転の減少率は、改善された運動機能を示唆しています。
  4. 細胞移植後4,8,12,16週後に,マウスの体が硬くなり,マウスの肝臓が青くなるまで4%のパラホルムアルデヒドで深い麻酔下でマウスを透過する。
  5. マウスの脳を穏やかに分離し、一晩4°Cで4%パラホルムアルデヒドに脳を入れます。
  6. 2日目に、脳が底に沈むまで脱水のために30%のスクロースに脳を入れます。
  7. 凍結マイクロトームを使用して、40 μmの厚さで脳をスライスします。
  8. 前述の手順 3.4.5-3.4.12 で説明したように免疫染色を実行します。

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結果

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ここでは、PDモデルを治療するためのiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを報告する。まず、PBMNCを単離して拡張し、SeV感染によりiNsCに再プログラムした。PBMNC 拡張および iNSC 誘導を使用した手順の概略図を図1に示します。14日目、PBMNCは密度勾配媒体(材料の表)を用いて単離した。遠心分離の前に、PBSと密度勾配媒体で希釈した血液を2層に分離した。遠心分離の後、4つの勾配層が現れた(下から上へ):下層には顆粒球と赤血球が含まれていた。2番目の層には密度勾配媒体が含まれていました。3 番目の含まれている PBMNC (赤い矢印);最上層には血小板が豊富な血漿が含まれていた(図2A)。拡大の14日後、PBMNCは0日目としてSeVに感染した。1日目に、SeVを含む培地を除去した(図2B)。

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ディスカッション

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ここでは、PDモデルに対するiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを紹介した。このプロトコルの重要な側面は、(1)PBMNCの単離と拡大、SeV感染によるiNSCへのPBNCのリプログラミング、(2)INSCとDAニューロンの分化、(3)一方的な6-OHDA病変PDマウスモデルと行動の確立DA前駆体の細胞移植および行動評価

このプロトコルでは、最初の部分は、優先的にエリスロブラストを拡張し、リンパ球増殖をサポートしない血清フリー培地(MNC培地)でPBNCを収集し、拡大することを含む。以前の研究では、いくつかの体細胞タイプは、iPSCまたはiNSC12、13、14に再プログラムされています。他のタイプの体細胞と比較して、PBMNCにはいくつかの利点があります。最も重要な利点は、彼らの有利な遺伝子発現パターンおよびエピジェネティックプロファイルである。PBMNCは生体内で短命であり...

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

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この研究は、幹細胞と翻訳国家キープロジェクト(2016YFA0101403)、中国国立自然科学財団(81661130160、81422014、81561138004)、北京市自然科学財団(5142005)の助成金によって支援されました。北京タレント財団(201700021223TD03)、第13次5カ年計画(CIT&TCD20180333)、北京医療システムハイレベル人材賞(2015-3-063)の北京市立大学の高レベル教師支援プロジェクト市保健委員会基金(PXM 2018_026283_000002)、北京100、千、1万人の人材基金(2018A03)、北京市病院行政特別資金支援(ZYLX201706)、ロイヤル・ソサエティ・ニュートン・アドバンスト・フェローシップ(NA150482)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mlコニカルチューブコーニング430052
1-チオグリセロールSigma-AldrichM6145吸入および皮膚接触に有毒
24ウェルプレートコーニング3337
50 mlコニカルチューブ Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6-well plateCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01細胞解離試薬
アポモルヒネSigma-AldrichA4393
アスコルビン酸Sigma-AldrichA92902皮膚に接触すると毒性 
B27サプリメント Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02脳由来神経栄養因子
ヘパリンナトリウムを含む採血管BD367871
BSAyisheng36106es60ウシ胎児血清
cAMPSigma-AldrichD0627ジブチリラデノシン環状一リン酸
CellBanker 2ZENOAQ100mlPBMNCの凍結培地として使用
既知組成の脂質濃縮物Invitrogen11905031
CHIR99021遺伝子操作04-0004
カバースリップフィッシャー25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
デキサメタゾンSigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
ドンキー血清Jackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGヒトエリスロポエチン
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P = 1.077、密度勾配中
GDNFPeprotech450-10ア由来神経栄養因子
GlutaMAXInvitrogen21051024100 ×グルタミン原液
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079平衡食塩水
ヒト白血病抑制因子ミルポアLIF1010
ヒト組換え SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1 Peprotech100-11-100UGヒトインスリン様成長ファクター 
IL-3Peprotech200-03-10UGヒトインターロイキン 3
IMDMGibco215056-023イスコーブの修正ダルベッコの培地
インスリンロシュ 
ITS-XInvitrogen51500-056Insulin-transferrin-selenium-X supplement
ノックアウト血清交換Gibco10828028無血清基礎培地
LamininRoche 
マイクロシリンジハミルトン7653-01
N2 サプリメント Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050非必須アミノ酸
ニューロベースGibco10888塩基性培地
PDLSigma-AldrichP7280Poly-D-リジン
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542遺伝子操作04-0010-10mg光から -20?
仙台ウイルスライフテクノロジーズ MAN0009378
ショ糖baiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36Eトランスフォーミング グロース ファクター  &β;?
トランスフェリンR&Dシステムズ2914-HT-100G
トリトンX100baiaoshengke非イオン性界面活性剤
トリパンブルーGibcoT10282
キシラジンSigma-AldrichX1126
グリ1258501411243217001

参考文献

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