電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

サマリー

電圧感受性染料を用いた脳スライスの再現性と安定した光学記録法をご紹介します。この記事では、従来の海馬スライス製剤を用いた光信号の電圧感受性染料染色と記録について説明する。

要約

脳スライス製剤の広視野単一光子電圧感受性色素(VSD)イメージングは、神経回路における機能的接続性を評価するのに有用なツールである。光信号の小数変化により、この方法を定量的アッセイとして用いるのは困難であった。この資料では、この技術を安定して信頼性の高い方法で行う特殊な光学およびスライス処理システムについて説明します。本稿では、VSD染色海馬スライスのスライス処理、染色、および記録について詳しく説明する。システムは良好な染色と長い時間の生理学的条件を維持し、記録の間にスライスの機械的な動きを防ぐ。また、少量の染料でスライスの染色が可能です。光学系は低倍率で高い数値絞りを実現し、100ピクセル×100ピクセルの空間解像度で最大フレームレート10kHzでVSD信号を記録できます。高いフレームレートと空間分解能により、この技術は、神経回路の変化を評価するのに十分な信号対雑音比を提供するポストレコーディングフィルタの適用を可能にします。

概要

バルク染色された脳スライス製剤の広視野単一光子電圧感受性色素(VSD)イメージングは、神経回路1、2、3、4のダイナミクスを評価するのに有用な定量的ツールとなっています。.膜励起5、6、7、VSDイメージングによる光学特性の変化の分析の後、コーエンらによって1970年代初頭に最初に説明された6,8、 ⁹. ;染料が膜電位変化(すなわち、ニューロンの一次シグナル)を直接プローブするので、脳の機能をリアルタイムで監視するのに適した方法です。

最も初期のVSDは、神経膜電位事象の急速な運動性に従う速い時間定数、膜電位^の変化との直線性など、脳システムを理解するために望ましい特性を有していた9、^{10歳,11歳,12歳,13歳,14歳,15.}他のイメージング実験と同様に、この技術は、カメラ、光学、ソフトウェア、スライス生理学などの幅広い特定のチューニングを必要とし、所望の結果を達成する必要があります。これらの技術的な落とし穴のために、最初の努力の間に期待される利点は、必ずしもこの技術に特化していない研究室のほとんどのために実現しませんでした。

技術的な困難の主な原因は、スライス製剤のバルク染色に適用した場合の膜電位変化に対するVSDの低感度であった。光信号の大きさ(すなわち、蛍光の分画変化)は、通常、生理的条件下での対照(F0)信号の10-4-10-3である。ニューロンにおける膜電位変化の時間スケールは、約ミリ秒から数百ミリ秒です。ニューロンの膜電位の変化を測定するには、記録に使用されるカメラは、高速(10 kHz~100Hz)で画像を取得できる必要があります。VSDの低感度とニューラル信号に従うために必要な速度は、高い信号対雑音比(S/N)2、16で、高速でカメラに集める大量の光を必要とします。

記録システムの光学はまた十分な光のコレクションを保障し、S/Nを改善するために重要な要素である。光学系によって達成される倍率は、多くの場合、局所的な機能的な神経回路を可視化するために、1Xから10Xなど、過度に低いです。例えば、海馬回路のダイナミクスを可視化するためには、約5倍の倍率が適しているであろう。このような低倍率は、低蛍光効率を有する;したがって、高度な光学系は、このような記録のために有益であろう。

また、スライス生理学も不可欠です。イメージング解析ではスライスをそのままにする必要があるため、慎重なスライス処理が必要です¹⁷.さらに、スライスの生存率を長期間維持するための対策が重要^である18.

本稿では、スライスの調製、VSD染色、および測定のためのプロトコルについて説明する。また、VSD、イメージングデバイス、光学系の改善、および実験システムに対するその他の改良点の概要を説明し、この方法を視覚化するための簡単で強力で定量的なアッセイとして使用することを可能にしました。脳機能の修飾^{19,20,21,22,23,24,25}.この技術はまた、海馬^{スライス1}のCA1領域における長期増強のために広く使用することができる。さらに、この技術は、単一の神経^細胞26における膜電位の光学的記録にも有用である。

プロトコル

全ての動物実験は、徳島文理大学動物管理利用委員会の承認を受けた議定書に従って行われました。スライス調製のための以下のプロトコルは、ほぼ標準的な^手順27であるが、変更はVSDによる染色および記録のプロトコルであった。

1. 実験日の前の準備

1. ストックA(表1)、ストックB(表2)、ストックC(表3)溶液を用意し、冷蔵庫に保管します。
2. 人工脳脊髄液(ACSF)の1Lを調圧し(表4、ステップ3を参照)を冷蔵庫に保管します。
3. 1Lの改変ACSF(表5)を準備し、冷蔵庫に保管してください。
4. 2 mLバイアルに500 μLのウシ血清(FBS)を分配し、冷凍庫に保管します。
5. ACSF(約120mL)の寒天粉末の4%を電子レンジで溶かし、90mm使い捨てペトリ皿に注ぎます。寒天プレートは、さらに使用する前に冷蔵する必要があります。
6. 実験の前日に、外科用トレイ、スライサー容器、アルミニウム冷却ブロック(120 x 120 x 20 mm 3)を冷凍庫に入れます。
7. スライス処理システム17、28用の膜フィルター付きプレキシガラスリングが十分にあることを確認してください(ステップ6.12を参照)。
8. 寒天粉末の2%を電子レンジで3M KClの50mLに溶解する。接地電極のマイクロピペットを使用して、200 μL チップで温寒天-KCl 溶解剤の約 85 μL を取ります。まだ暖かい寒天3M KClゲルに先端を取り外します。2%寒天で約20〜40のヒントを埋めるためにステップを繰り返します。

2. VSD(di-4-ANEPPS)ストックソリューションの準備

1. 超純水で10%ポリエトキシ化ヒマチ油溶液の1 mLを調製します。
2. di-4-ANEPPS(5mgバイアル)、渦および超音波処理のバイアルに1mLのエタノールを10分間加加えます。溶液は、di-4-ANEPPS結晶の可能な小さな残留物と深い赤色に変わります。
   注:このステップで使用されるエタノールは、新たに開く必要があります。
3. 溶液をOリングで2mLマイクロチューブに移します。溶液をスピンダウンし、10%ポリエトキシ化ヒマサ油溶液の500 μLを追加します。
   注:染料は親油性が高い。DMSOおよびポロクサマーは、di-4-ANEPPSを溶解するためにも使用できますが、膜電位の変化に際して光信号の観点から、エタノール-ポリエトキシン化ヒマシ油の使用はノイズ比に対するより良い信号を与えることがわかりました。これは、細胞膜への溶媒の伝達速度に関連する可能性があります。
4. 色素が完全に溶解するまで渦と超音波。
5. 光への露出を避け、冷蔵庫に保管してください。冷凍庫には保管しないでください。在庫は数ヶ月間持続することができます。
   注:実験当日は、手順3~9に従ってください。

3. ACSFの毎日の調製(1L) (表4)

1. NaCl、NaHCO_3、およびフラスコ内のブドウ糖の重量を量る。
2. フラスコに蒸留水の950 mLを追加し、95% O₂/5% CO₂ガスで泡立て始めます。
3. フラスコに2.5mLのストックA溶液を加え、室温で約10分間インキュベートします。
4. フラスコに2.5mLのストックC溶液を追加します。
5. 蒸留水を加えて溶液を1Lにします。

4. 染色VSD溶解の毎日の準備

1. 超音波装置でFBSおよびVSDストック溶液(ステップ2)の500 μLバイアルを5分間超音波処理器で超音波処理します。
2. FBSのバイアルに500 μLの新たに調製されたACSFを追加します。
3. バイアルにVSDストック溶液の20(マウスの場合)または40(ラットの場合)μLを添加する。
4. 超音波と溶液が淡いオレンジになるまでバイアルを渦。

5. 手術の準備

1. 300mLのステンレス容器、300mLビーカー、プラスチック容器に100mLの冷蔵ACSFを別々に取り、冷凍庫に入れます。冷やしたACSF(表2)を150mLの別のビーカーに注ぎ、冷凍庫に入します。解決策が冷えるまで待ちます。要時間は事前に測定し、決定する必要があります。
2. かみそり刃(炭素鋼、工業用グレード0.13mm、両側のブレード)をスライサーの半分に折ります。
   注:残りの半分は、適切なブレードホルダーで解剖に使用することができます。
3. ACSF 4%寒天プレートから調整治具でブロックを準備します(図1)。
4. 湿ったインキュベーションチャンバー(インターフェイスタイプのチャンバー、シリコーンパッキング付きの修正された1.2 Lタイトな密封ボックス)を準備し、脳のスライスを生理的に生き生きと保ちます(図2)。小さな容器にACSFを入れ、95%O2/5%CO2ガスで炭酸塩を加え、90mm x 20mmのペトリ皿を上部にACSFで充填します。
   注:より小さいペトリ皿(60ミリメートルx 20ミリメートル)は、皿上のフィルターペーパーをサポートするために、90ミリメートルの皿の中央に配置する必要があります。
5. 加熱装置に箱を置き、20分間待って28°Cまで温めます。
6. 砕いた氷をスライサーの容器に入れます。メス、ブレードホルダー、リングピンセット、寒天ブロック、スライサーのステージ:氷の上にステンレススチール製のバット(小)に次の楽器を置きます。凍結ACSFを凍結し、95%O 2/5%CO2ガス(別名炭水化物)で氷と泡の上にACSFを改変してください。
7. 次の器具をバット(大)に入れます:はさみ(大、小)、ピンセット、へら、スプーン、斜めのペンチ。

6. 手術(マウス)

1. ヒュームフードにイソファランを使用してマウスを麻酔する。つま先のピンチに動物のペダル反射をチェックすることにより、麻酔のレベルを評価します。
2. マウスを切断し、ステンレス鋼の外科皿で氷冷ACSFに頭部を浸す。
3. 1分以内に脳を抽出し、5分間冷やしたACSFを含むビーカーに入します。
4. ビーカーから脳を取り出し、メスを使用して、脳ブロックをトリミングします(図3A)。
5. 脳ブロックを4%寒天ブロックの上に置きます(ステップ5.3、図3B)。両方の半球は寒天のブロックに取付けることができる。余分なACSFをフィルターペーパーでブロックから拭きます。
6. スライサーテーブルに薄い接着剤(スーパー接着剤)を塗布します。寒天ブロックをその上に置き、フィルターペーパーを使用して余分な接着剤を拭きます。
7. 脳寒天ブロックの上部からピペットを使用して、少量の氷冷ACSF(約5mL)を静かに塗布します。これは、余分なスーパー接着剤を固め、接着剤が脳を覆い、スライスを妨げるのを防ぐのに役立ちます。
8. スライサーテーブルをスライサートレイ(図3C)に固定し、変更したACSFを注ぎます。
9. スライサーを遅い速度に設定し、ブレードの周波数を最大に設定します。
10. スライスの厚さを 350 ~ 400 μm に設定し、スライスを開始します (図 3C)。スライストレイの隅にスライスを順番に配置して、スライスの深さを簡単に区別できるようにします。通常、1つの半球から3~5枚のスライスを得ることができます。
11. 30G針(図3D)を用いて脳幹部分を切り取る。
    注:CA3-CA1境界間の切断などの脳スライス上の微小手術は、必要に応じて双眼鏡の下でこの段階で行われるべきである。
12. 小さな先端のペイントブラシを使用して、プレキシガラス^リング17(外径15mm、内径11mm、厚さ1mm、図3E)で保持した膜フィルター(0.45μmの細孔、PTFE膜、13mm径)の中央にスライスを置きます。しっとりした回復室(図2)にリングを置き、カバーを固定して内圧を高く保ちます。
    注:スライスは30分以内に膜に付く、記録室の後続のステップのリングと扱うことができる。スライスを所定の位置に保つために、ウェイトやその他の手段を使用する必要はありません。
13. リング内のスライスの方向と位置を調整して、スライスが中央にしっかりと配置され、一貫した方向を持っていることを確認します(ステップ 9.3 を参照)。
14. 28 °Cで30分間試料を残し、その後、スライスの回収のために少なくとも10〜30分間室温で残します。
    注:スライスは今、少なくとも15時間のために良好な生理学的状態を保持することができます。

7. スライスの染色とすすり(マウス)

1. マイクロピペットを使用して、リング上の各スライスに100-110 μLの染色液(ステップ4)を静かに塗布します。8~9枚のスライスをステップ4で調製した1つの染色溶液で染色することができる。スライスは20分間染色したままにしておきます。
2. 容器にACSFの50-100 mLを準備し、その中にスライスされた標本でリングを入れて染色液をすすいでください。
3. すすり切ったスライスを別のインキュベーションチャンバーに保管します。実験の前に回復のために1時間以上待ちます。
   注:インキュベーションチャンバはガスから取り外し、密閉された状態で記録の場所に移動することができます。スライスはガス供給なしで少なくとも20分間生き続けることができる。これは、記録のためにスライスを別の場所に移動する必要がある場合に便利です。

8. 実験装置の日々の準備

1. アンプ、コンピュータ、カメラシステムの電源を入れ、ソフトウェアが実行中であることを確認します。
2. ACSFを50mLチューブに入れ、炭水化物を入れた泡を入れます。
3. 蠕動ポンプを使用してACSFを循環させる。流量を約1mL/分に調整します。
4. 実験室内の液体レベルが常に一定になるように、吸引ピペットの高さを調整します。
   注:溶液のレベルは、安定した記録を得るために重要であるため、調整はマイクロマニピュレータを使用して行われるべきです。
5. 3 M KCl 寒天で満たされた黄色のチップで構成された地上電極をインストールします (2%)(ステップ1.8)を、少量の3M KCl溶液を含むAg-AgClワイヤを有するホルダーに入れる。
6. 少量のACSF(体積の約3分の2)をガラス電極(外径1mm、マイクロピペットプーラーで引っ張った内径0.78mm)をテーパード細いチューブ状の黄色の先端を使用して、電極ホルダーに入れます。
7. マニピュレータに取り付けられているロッドにホルダーを取り付けます。電極抵抗が約1MΩであるアンプを使用してください。
   注:長シャンクワイド開口部(4-8 μm開口部)パッチタイプの電極は、フィールド記録および刺激電極として良好である必要があります。

9. レコーディングセッションの開始

1. 鉗子で湿った部屋からスライスの準備を取る。
2. 顕微鏡下の実験室にスライスを素早く置きます(図4)。
3. リングの端をシリコーンOリングにしっかりと押し込みます。実験室の膜や底を壊さないように注意してください。
   注:スライスの方向は、視野における刺激および記録電極の方向に関して考慮されるべきである。健康なスライスは、重みやナイロンメシなどのスライスを固定するために他のデバイスを使用する必要はありませんので、膜フィルタに固執する必要があります。
4. 刺激電極の先端と電界電位の先端を透過光で顕微鏡下のスライスに置きます。
5. 電気生理学的記録システムを使用して応答を確認します。所定の構成で通常の(非染色された)電気生理学的記録を確認する。
   注:記録電極は省略できますが、スライスの生理学をチェックするのに役立ちます。
6. 5倍の水浸し対物レンズと1x PLAN APOチューブレンズで10kHzでサンプリングする場合は、試料で13-15 mW/cm2に対応するカメラの最大容量の約70-80%に励起光強度を調整します。励起光波長は530nmで、発光フィルタは> 590 nmでなければなりません。
   注:シャッターを使用して励起光の量を最小限に抑します。連続的な光暴露は、スライス生理学を悪化させる可能性があります。光の有害な影響は、光の強度と持続時間に依存します。電気生理学的記録を使用して、光の影響を判断します。13-15 mW/cm²の強度の場合、約1sの露光は、公差の上限でなければなりません。
7. 蛍光光源を用いて集録システムでフォーカスを調整します。
8. 画像取得ソフトウェアのデータを調べます。
   注:数値解析ソフトウェアの独自のマイクロプログラミングパッケージを用い、詳細な分析を行いました。

結果

図5は、マウス海馬スライスの領域CA1におけるシャッファー担保の電気刺激時の代表的な光信号を示す。図 5Aの連続した画像は、空間フィルタと時間フィルタが適用される前の光信号を示し、図 5Bは 5 x 5 x 5 立方フィルタ (ガウスカーネル畳み込み、5 x 5 空間- および 5 に対して 5 を適用した後の同じデータを示しています。時系列次元)を2回)高いフレームレート(0.1ミリ秒/フレーム)と高い空間解像度(100ピクセルx100ピクセル)のため、フィルタの適用は信号を変更しませんでしたが、ノイズをフィルタリングし、単一のトライアルでピクセル単位で記録されたタイムコースでも観察することができます(図5C、フィルタなし。図 5D,フィルター付き;

ディスカッション

スライス生理学は、正しい信号を収集するために不可欠です。このプロトコルでリング膜フィルタシステムを使用すると、手順2、16、17を通じてスライスが健全で歪まないままであることを保証します。他のシステムは、記録中にスライス生理学を保持するために使用することができますが、イメージングは、スライスのすべての部分が健康である必要とするために、スライスはいつでも変形してはなりません。リング膜フィルターシステムは、必要な染色液の体積を最小限に抑えるのに役立ちますので、染色にも優れています。時間分数に対して低くすべきであるので、励起光の強度を制御することも重要です。連続的な照明は標本を損傷させることができる;そのため、シャッターの適切な使用が必要です。

VSDの毒性^{は、しばしば29}について議論されてきたが、それは色素濃度、励起光強度、および光への暴露の持続時間の非...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高速画像取り込みシステム	株式会社ブレインビジョン	MiCAM - Ultima	イメージングシステム
高速画像取得システム	株式会社ブレインビジョン	MiCAM 02
広視野イメージング用イメージングシステム Macroscepe	ブレインビジョン	THTマクロスコープ	マクロスコープ
フォトジオドーススタブリライザー付きハイパワーLED照明システム	Brainvision co., Ltd.	LEX-2G	LED照明
画像取得ソフトウェア	株式会社ブレインビジョン	取得ソフトウェア	BV-ana
電気刺激装置	株式会社ブレインビジョン	ESTM-8	刺激アイソレーター+AD/DAコンバーター
スライサー	ライカ	VT-1200S	スライサー
	ライカ	VT-1000	スライサー
スライサー用刃	フェザーセーフティーカミソ	#99027	炭素鋼カミソリブレード
メンブレン フィルター スライス サポート	Merk Millipore Ltd., MA, USA	Omnipore, JHWP01300, 0.45 & マイクロ;m pores,membrane	filter/0.45 13
数値解析ソフト	Wavemetrics Inc., OR, USA	IgorPro	解析ソフト
Stimulation sollator	WPI Inc.	A395	刺激アイソレーター
AD/DA コンバーター	Instrutech	ITC-18	AD/DA コンバーター
電圧感受性色素 Di-4-ANEPPS	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	カタログ番号: D-1199	VSD: Di-4-ANEPPS
Poloxamer	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Pluronic F-127 P30000MP	Poloxamer/Pluronic F-127 (DMSO 中の 20% 溶液)
ポリエトキシル化ヒマシ油	Sigma-Aldrich	Cremophor EL C5135	ポリエトキシル化ヒマシ油