方法論記事

げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

DOI：

10.3791/59695

⸱

2019年5月21日

 ,  , 
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、げっ歯類の脳の異なる細胞区画におけるユビキチンプロテアソーム系(UPS)活性を効率的に定量するように設計されている。ユーザーは、同じ動物の核、細胞質およびシナプス画のUPS機能を調べることができ、これらの複雑な分析を行うために必要な時間と動物の数を減らすことができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ユビキチンプロテアソーム系は、真核生物におけるタンパク質分解および他の様々な細胞プロセスの主要な調節剤である。脳では、ユビキチンプロテアソーム活性の増加は、シナプス可塑性および記憶形成のために重要であり、このシステムの異常な変化は、様々な神経学的、神経変性および精神疾患に関連している。脳内でユビキチンプロテアソームが機能する研究における問題の1つは、タンパク質標的、機能的役割および調節機構が大きく異なる可能性があるすべての細胞コンパートメントに存在することです。その結果、同じ動物内の異なる細胞内の異なる細胞内の脳ユビキチンタンパク質ターゲティングおよびプロテアソーム触媒活性を直接比較する能力は、UPSがシナプス可塑性にどのように寄与するかを完全に理解するために重要であり、記憶と病気。ここで説明する方法は、同じげっ歯類(ラット)脳からの核、細胞質および粗シナプス画分の収集を可能にし、続いてプロテアソーム触媒活性の同時定量化(間接的に、プロテアソームコアの活性を提供する)のみ)およびリンケージ特異的ユビキチンタンパク質タグ付け。したがって、この方法は、シナプス可塑性、記憶形成および異なる疾患状態の間に同じ動物における異なる脳領域におけるユビキチン-プロテアソーム活性の細胞内変化を直接比較するために使用することができる。この方法は、同じ動物内の他のタンパク質の細胞内分布および機能を評価するためにも使用することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ユビキチンプロテアソーム系(UPS)は、細胞1のほとんどの短命タンパク質の分解を制御する相互接続されたタンパク質構造およびリチウムの複雑なネットワークである。このシステムでは、タンパク質は、小さな修飾子ユビキチンによって分解または他の細胞プロセス/運命のためにマークされます。標的タンパク質は、7つのリジン(K)部位(K6、K11、K27、K29、K33、K48およびK63)またはN末端メチオニン(M1;線形として知られている)のいずれかで一緒にリンクすることができる1-7ユビキチン修飾を獲得することができる。これらのポリウビキチンタグのいくつかは、分解特異的(K48)3であり、他のものはタンパク質分解プロセス(M1)4、5、6とは大きく独立している。したがって、タンパク質ユビキチン化プロセスは非常に複雑であり、特定のポリウビキチンタグの変化を定量化する能力は、細胞機能における与えられた修飾の役割を最終的に理解するために重要である。さらにこのシステムの研究を複雑にし、UPS7の触媒構造であるプロテアソームは、いずれもタンパク質を分解するが、他の非タンパク質分解プロセス8、9にも関与しうる。当然のことながら、その最初の発見以来、正常かつ異常なユビキチンプロテアソーム活性は、長期記憶形成および多くの神経学的、神経変性および精神医学的な疾患状態に関与している。障害10,11.その結果、脳内のUPS活性を効果的かつ効率的に定量化できる方法は、このシステムが疾患状態でどのように調節されるか、およびユビキチンおよび/またはを標的とする治療オプションの最終的な開発を最終的に理解するために重要である。プロテアソーム機能。

ラットやマウスから脳組織のユビキチン・プロテアソーム活性を定量化する上で多くの問題があり、これはUPS機能の研究に使用される最も一般的なモデルシステムであり、1)ユビキチン修飾の多様性、および2)分布および細胞外コンパートメント12、13、14を横切って機能するUPSの差分規制。例えば、記憶形成中の脳におけるユビキチン・プロテアソーム機能の初期のデモンストレーションの多くは、全細胞のライサーションを使用し、タンパク質ユビキチン化およびプロテアソーム活性の両方における時間依存性の増加を示した15、16歳,17歳,18歳,19歳,しかし、最近、ユビキチン・プロテアソーム活性は、学習に応じて細胞内の区画全体で大きく変化し、一部の地域では同時に増加し、他の地域では減少し、大きく異なるパターンであることがわかった。以前に報告されたものから全細胞は21をlysates.これは、異なる細胞内区画間でのUPS活性の変化の寄与を解離できないため、細胞全体のアプローチの制限と一致しています。より最近の研究は、学習22、23、24に応答してシナプスで特にUPSを研究するためにシナプス画分プロトコルを採用しているが、使用される方法は、測定する能力を閉塞する同じ動物における核および細胞質のユビキチン・プロテアソーム変化。その結果、実験を何度も繰り返す必要が不要で、それぞれに異なる細胞分画が収集されます。これは動物の生命の損失を大きくするだけでなく、特定の事象に応答するか、特定の疾患状態の間に異なる細胞内区間でUPS活動を直接比較する能力を排除します。ユビキチンおよびプロテアソームのタンパク質標的が細胞全体で大きく異なっていることを考慮すると、ユビキチン-プロテアソームシグナル伝達が異なる細胞内接画においてどのように異なるかを理解することは、記憶形成と神経学的、神経変性および精神疾患の間の脳。

このニーズに対処するために、我々は最近、同じ動物21から所定の脳領域に対して核、細胞質およびシナプス画分を収集することができる手順を開発した。さらに、同じサンプルから複数の細胞分画を収集して得ることができるタンパク質の限られた量を考慮して、我々はインビトロプロテアソーム活性およびリンケージ特異的なアッセイに以前に確立されたプロトコルを最適化したげっ歯類の脳組織から採取した細胞のタンパク質ユビキチン化。このプロトコルを使用して、ラットの横扁桃体における核および細胞質におけるプロテアソーム活性、K48、K63、M1および全体的なタンパク質ポリユービキチン化レベルにおける学習依存的変化を収集し、直接比較することができた。ここでは、UPSが長期記憶形成や様々な疾患状態にどのように関与しているのかについての理解を大幅に改善する可能性のある手順(図1)を詳細に説明します。しかしながら、我々のプロトコルで議論されるインビトロプロテアソーム活性は、広く使用されている一方で、完全な26Sプロテアソーム複合体の活性を直接測定しないことに留意すべきである。むしろ、このアッセイは20Sコアの活性を測定し、26Sプロテアソーム複合体全体とは対照的に、コア自体の活動を理解するプロキシとしてのみ役立つことができる。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア工科大学と州立大学機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

げっ歯類脳組織の採取と解剖

注:このプロトコルは、様々な脳領域に適用することができ、様々な組織採取手順で使用することができます。以下は、ラットの脳組織の細胞細胞に対して研究室で使用される手順で、8~9週齢の雄スプラーグ・ドーリーラットを用いたものです。同じ動物のすべての細胞コンパートメントを処理するために、セクション1.3。使用される組織採取手順にかかわらず従わなければならない。

  1. ラットの脳を抽出し、ドライアイスで事前に冷やした低温カップに入れます。ドライアイスで脳をフラッシュフリーズするか、液体窒素を使用して-80°C冷凍庫に移します。脳は、同じ日または後の時間に解剖することができます。
  2. 凍結した脳を低温カップから取り出し、ドライアイスで冷やしたラットの脳マトリックスに入れます。マトリックス上の各スロットは 0.5 mm に対応しており、対象領域 (ROI) のおおよその位置を決定するために使用できます。
    1. ラットブレインアトラスを使用して、ROIの予測開始の直前(前方)のマトリックスにカミソリブレードを挿入します。次に、ROIの予測末(後部)に直ちにカミソリブレードを挿入します。
    2. メスを使用してかみそり刃の間のスライスを取り除き、ドライアイスで冷やした顕微鏡スライドの上に置きます。通常、セクションの厚さは 2 ~ 3 mmですが、これは ROI によって異なります。
  3. メスを使用して、一度に1つの半球のROIを解剖します。各半球をドライアイスであらかじめ冷やした1.5mLのマイクロ遠心管に入れます。凍結組織は、すぐに細胞下分画に使用したり、-80°Cで保存された場合は後で処理することができます。

2. 核と細胞質抽出

注:このプロトコルは、0.1 M HEPES、1 M MgCl 2、1Mジチオスレイトール(DTT)、0.5 Mエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)、5M NaCl、10%NP-40(IGEPAL)および50%グリセロールを含む一般的なラボ化学物質の事前製ストックソリューションを使用しています。エンドポイントがプロテアソーム活性アッセイに使用される場合、グリセロールおよびATPは、溶解中にプロテアソーム複合体の分解を防ぐために、すべてのバッファーに添加することができる。

  1. Lysis バッファーを準備します。無菌の15 mL円錐管に8.63 mLの超純物(脱イオン化および蒸留)水を加えます。
    1. 円錐管に、0.1 M HEPESの1,000 μL、1M MgClの15 μL、1M DTTの100 μL、10%NP-40の50 μLを加えます。
    2. プロテアーゼ阻害剤カクテルの100 μLとホスファターゼ阻害剤カクテルの100 μLを追加します。簡単に混ぜて、冷やすために湿った氷の上に置くために溶液を渦。なお、溶液はホスファターゼ阻害剤から黄色い色調を持ちてもよい。
      注:プロテアーゼ阻害剤の使用は、タンパク質を保存し、インビトロプロテアソーム活性アッセイの特異性を確保するために不可欠です。しかしながら、これらの阻害剤はまた、プロテアソーム活性のわずかな減少をもたらし得る、すなわちインビトロアッセイで測定された活性は、実際の活性レベルの過小評価であり得る。
  2. 抽出バッファーを準備します。無菌の15 mL円錐管に5.925 mLの超純物(脱イオン化および蒸留)水を加えます。
    1. 円錐管に、0.1 M HEPESの2,000 μL、50%グリセロールの1250 μL、1M MgCl2の15 μL、1M DTTの5μL、0.5 M EDTAの5μLおよび5M NaClの600 μLを加える。
    2. プロテアーゼ阻害剤カクテルの100 μLとホスファターゼ阻害剤カクテルの100 μLを追加します。簡単に混ぜて、冷やすために湿った氷の上に置くために溶液を渦。なお、溶液はホスファターゼ阻害剤から黄色い色調を持ちてもよい。
  3. -80 °C 冷凍庫からROIの半球を含む1.5mL遠心マイクロチューブを取り外します。使用する半球が、各実験群の抽出条件間で相殺されていることを確認します。たとえば、2 つのグループ実験では、各グループの最初の 2 つの動物に左半球を使用し、次の 2 つのサンプルには右半球を使用します。
  4. メスを使用して、凍結した脳組織を2mLガラステフロンホモジナイザーに移します。テフロンチューブに500μLのリシスバッファーを追加します。
    1. 害虫Bを使用して、固体材料の目に見える量が存在しないまで、15ストロークを使用して同じ組織を均質化する。各ストローク中に回転モーション(時計回りまたは反時計回り)を使用します。
  5. 1,000 μLピペットを使用して、均質化されたサンプルを新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。チューブを湿った氷の上に置き、30分間インキュベートします。
  6. チューブをマイクロ遠心分離機に入れ、845 x gおよび4°Cで10分間スピンします。完了後、慎重にピペッティングによって上清を除去し、新しい1.5 mLマイクロ遠心管に配置します。これは、セクション2.9まで氷または4 °Cで保存することができる細胞質画分です。
  7. 得られたペレットに50 μLの抽出バッファーを追加し、ピペッティングによって再中断します。ペレットを渦に入れしないでください。再懸濁したペレットを含むチューブを氷の上に置き、30分間インキュベートします。
  8. チューブをマイクロ遠心分離機に入れ、21,456 x g、4 °Cで20分間スピンします。完了後、慎重にピペッティングによって上清を除去し、新しい1.5 mLマイクロ遠心管に配置します。これが核分数です。ペレットを破棄できるようになりました。
  9. Dcタンパク質アッセイ(メーカーの指示に従って)、または非イオン性洗剤を使用して収集されたサンプルの同等のアッセイを使用して、細胞質抽出および核抽出のタンパク質濃度を測定します。プロテアソーム活性アッセイ(セクション4)またはウェスタンブロッティング(セクション5)に直ちに進みます。あるいは、サンプルは必要になるまで-80°Cで貯えることができる。

3. シナプス画集

注:このプロトコルは、1 Mトリス(pH 7.5)、0.5 M EDTA、5 M NaClおよび10%SDSを含む一般的なラボ化学物質の事前に作られたストックソリューションを使用します。エンドポイントがプロテアソーム活性アッセイに使用される場合、グリセロールおよびATPは、溶解中にプロテアソーム複合体の分解を防ぐために、すべてのバッファーに添加することができます

  1. 320 mM スクロースを使用して TEVP バッファを準備します。60 mLの超純物(脱イオン化・蒸留)水をクリーンな100mLビーカーに加えます。
    1. ビーカーには、1 Mトリスの1,300 μL(pH 7.5)、0.5M EDTAの260 μL、プロテアーゼ阻害剤カクテルの100μL、ホスファスターの100μL、スクロースの10.944gを加えます。ショ糖が完全に溶解するまで、攪拌バーと混ぜます。
    2. ピペットを使用して溶液に塩酸(HCl)を滴下してpHを~7.4にします。
    3. 溶液を100 mLの容積フラスコに移します。超純水を加えて100mLにボリュームを取り入れます。必要になるまで氷の上で最終的な溶液を冷やします。
  2. 均質化バッファーを準備します。60 mLの超純物(脱イオン化・蒸留)水をクリーンな100mLビーカーに加えます。
    1. ビーカーには、1 Mトリスの5,000 μL(pH 7.5)、5M NaClの3,000 μL、プロテアーゼ阻害剤カクテルの100μL、ホスファターゼ阻害剤カクテルの100μL、10%SDSの2,000μLを加えます。かき混ぜる。
      注:イオン性洗剤は、プロテアソーム複合体の脱線をもたらすことによってプロテアソーム活性アッセイを妨げる可能性がある。必要に応じてプロテアソーム機能を維持するために、SDSの体積を下げることができます。
    2. ピペットを使用して溶液にHClをドロップワイズで追加して、pHを~7.4にします。
    3. 溶液を100 mLの容積フラスコに移します。超純水を加えて100mLにボリュームを取り入れます。最終溶液を室温で保存します。SDSが溶液の外に沈殿するように冷やさらない。
  3. -80 °C 冷凍庫からROIの半球を含む1.5mL遠心分離機を取り外します。使用する半球が、各実験群の抽出条件間で相殺されていることを確認します。たとえば、2 つのグループ実験では、各グループの最初の 2 つの動物に左半球を使用し、次の 2 つのサンプルには右半球を使用します。
  4. メスを使用して、凍結した脳組織を2mLガラステフロンホモジナイザーに移します。テフロンチューブに500 μLのTEVPバッファを追加します。
    1. 害虫Bを使用して、固体材料の目に見える転移が存在しないまで、15ストロークを使用して同じ組織を均質化する。各ストローク中に回転モーション(時計回りまたは反時計回り)を使用します。
  5. 1,000 μLピペットを使用して、均質化されたサンプルを新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。10分間、4°Cで1,000 x gでサンプルを遠心分離します。
  6. 上清を収集し、1,000 μLピペットを使用して新しい1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。10分間、4°Cで10,000 x gでサンプルを遠心分離します。元のペレット(P1)は核および大きい破片を含み、捨てることができる。
  7. 上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。これは細胞細分画です。ペレット(P2)に50μLの均質化バッファーを追加し、固体材料が見えなくなるまでピペッティングで再中断します。
  8. 10分間、4°Cで20,000 x gでサンプルを遠心分離します。新しい1.5 mLマイクロ遠心管に上清を移す;これは粗シナプトソーム膜(シナプス)画分です。ペレットは廃棄することができる。
  9. Dcタンパク質アッセイ(メーカーの指示に従って)、またはイオン洗剤を使用して収集されたサンプルの同等のアッセイを使用して、シナプス画分のタンパク質濃度を測定します。プロテアソーム活性アッセイ(セクション4)またはウェスタンブロッティング(セクション5)に直ちに進みます。あるいは、サンプルは必要になるまで-80°Cで貯えることができる。

4. プロテアソーム活性アッセイ

注:プロテアソーム活性は、20Sプロテアソーム活性キットのわずかに改変されたバージョンを使用して均質化された脳組織で測定することができる。このアッセイは、完全な26Sプロテアソーム複合体の活性を直接測定するものではありません。むしろ、20Sコアの活性を測定し、26Sプロテアソーム複合体全体とは対照的に、コア自体の活動を理解するプロキシとしてのみ機能することを意味します。このアッセイの成功は、繰り返し凍結解凍サイクルおよび/または洗剤、特にイオンのレベルを増加させることで減少し、360/460(励起/発光)フィルタセットと37°Cまでの加熱能力を備えたプレートリーダーの使用を必要とします。

  1. プレートリーダーの設定:37°Cに事前に暖め、実行を通して保持します。
    1. 励起を 360 に設定し、放出を 460 に設定します。使用する96ウェルプレートが明確な場合は、光学系の位置をボトムに設定します。ダーク/ブラック 96 ウェルプレートを使用する場合は、光学系の位置を[トップへ" に設定します。
    2. 蛍光読み取りオプションの下で、古いプレートリーダーモデルを自動ゲインに設定します。新しいモデルはこのためにプリセットされています。2時間の時間でキネティックランをプログラムし、30分ごとにスキャン(読み取り)します。
  2. 13.5 mLの超純水でキットに設けられている10倍のアッセイバッファーを再構成します。100 mM ATP の 14 μL を現在の 1x バッファーに追加します。これはサンプルのプロテアソーム活動を有意に高め、アッセイの信頼性を向上させる。最終的な20Sアッセイバッファーは、必要になるまで氷上または4°Cで保存することができ、数ヶ月間安定しています。
  3. DMSOの100 μLのキットで提供されるAMC標準を再構成します。標準は光に敏感であるので、暗闇の中または低照度条件下でこのステップを実行します。
  4. 暗い状態または低照時間条件下で、再構成された標準を使用して AMC のスタンド カーブを作成します。
    1. 別々の0.5 mLマイクロ遠心分離管では、20、10、8、4、2、1、0μMの濃度に対応するAMC規格の1.6、0.8、0.4および0 μLを16、8、6.4、3.2を追加します。
    2. これらのチューブには、同じ順序で、20Sアッセイバッファーの84、92、93.6、96.8、98.4、99.2、99.6および100 μLを追加します。これは、均質化されたサンプルにおけるプロテアソーム活性のプレートリーダーの較正および分析に使用される一連の高から低AMC濃度を作成します。
    3. 必要になるまで、すべての希釈された基準を暗闇の中で氷の上に保管してください。
  5. DMSOの65 μLのキットで提供されるプロテアソーム基板(Suc-LLVY-AMC)を再構成します。基板は光に敏感なため、暗い環境や低照度条件下でこの手順を実行します。20Sアッセイバッファを使用して、新しい1.5 mLマイクロ遠心管でプロテアソーム基板の1:20希釈を作成します。希釈した基板を必要になるまで暗闇の氷の上に保管します。
    注:たとえば、プレートに 10 サンプルと 1 ブランクがある場合、ウェルあたり 10 μL で 22 ウェル (重複) に十分な希釈基板が必要になります。これは、ピペッティングエラーに対する220 μLの必要性+30 μLに相当し、基板の12.5 μLと20Sアッセイバッファの237.5 μLを必要とします。
  6. 所望のサンプルを解凍(凍結した場合)、96ウェルプレートに正規化された量を追加します。各サンプルを重複して実行します。必要なサンプルの量は、組織の調製に基づいて異なります。一般に、10~20 μgは、任意の細胞分画に対して十分です。
  7. サンプルウェル容積を超純水で80μLにします。追加される量は、追加されたサンプルの量によって異なります。例えば、サンプル1がタンパク質の4.5 μLで、サンプル2が8.7 μLの場合、必要な水量はそれぞれ75.5 μLと71.3 μLになります。2つの別々の井戸で、水の単独で80 μLを追加します。これらはアッセイブランクになります。
    注:ピペッティングエラーによるタンパク質体積の変化を制限するために、タンパク質濃度は最も濃縮されていないサンプルに正規化することができます。これにより、すべての条件で同じサンプルボリュームを使用できます。
  8. アッセイブランクを含む各ウェルに20Sアッセイバッファの10 μLを追加します。リピータ/自動ピペットは、ウェル間で一貫したアッセイボリュームを確保するために、ここでお勧めします。
  9. オプション:この段階では、必要に応じてインビトロ操作を導入します。これは、各サンプルが車両を含む治療ごとに追加の2ウェルを持っていることを必要とします。その場合は、対象の薬物/化合物の5-10 μLをサンプルウェルの2と同等の量の制御/車両を別の2ウェルに追加します。プレートを予め温めたプレートリーダーの上に置くか、37°Cのインキュベーターに30分間入れます。
  10. 明かりを消すか、暗い部屋に入ります。希釈されたAMC規格の100 μLをすべて新しいウェルに追加します。各標準は、単一の井戸を持つことになります。
  11. 暗闇では、希釈プロテアソーム基板の10 μLをサンプルおよびアッセイブランクを含むウェルに追加しますが、AMC規格には加えられません。リピータ/自動ピペットは、ウェル間で一貫したアッセイボリュームを確保するために、ここでお勧めします。
  12. プレートリーダーにプレートを入れ、運動走行を開始します。
    注:プレートは運動実行中に一定の撹拌を受ける必要はないが、ユーザーは必要に応じて選択できる
  13. 運動実行の最後に、生の 360/460 蛍光値を Microsoft Excel にエクスポートします。
    1. 各標準、各サンプル、アッセイブランクの5つのスキャンの重複井戸を平均します。生の蛍光値は、サンプルのスキャン全体で増加する必要がありますが、標準およびアッセイブランクでは安定した(またはわずかに減少)。
    2. 最高のAMC標準ウェル平均を取り、既知の濃度(20 μM)で除算します。この値をアッセイで使用するサンプル濃度で除算して、標準化されたAMC値を得ることができます。各サンプルとアッセイブランク平均について、標準化されたAMC値で除算します。
    3. この最終値をアッセイで除算し、各サンプルとアッセイブランクの正規化値を取得します。5 つのスキャンすべてに対してこれを行います。
    4. 5 つのスキャンすべてについて、正規化された各サンプル値から正規化されたアッセイブランク値を減算します。

5. リンケージ特異的タンパク質ユビキチン化の定量化

  1. げっ歯類の脳組織から収集された異なる細胞分画における多様なポリウビキチンタグの定量化は、ユニークなリンケージ特異的ポリウビキチン抗体と組み合わせて様々な標準的な西洋ブロッティングプロトコルを使用して行われるべきである。
    1. 脱電の場合は、正規化されたサンプルを、製造元の指示に従って、β-メルカプトエタノールを補充した同量のLaemmliサンプルバッファーと混合し、体積によって5%の割合にします。
    2. リンケージに関係なく、すべてのモノユビキチン化およびポリウビキチン化修飾の定量化のために、パンユビキチン抗体を使用する。
    3. すべてのポリユビキチン化タンパク質を認識するには、単一ユビキチン化と交差反応しないユビキチン抗体を使用します。
    4. リンケージ特異的ポリウビキチン化には、リジン-27、リジン-48、リジン-63および線形(M1)ポリユービキチン化を検出できる抗体を使用してください。
  2. 開発間のクロスコンタミネーションを防ぐために、偽陽性または異なるユビキチン修飾のイメージングを妨害する可能性があり、0.1 M NaOHを10分間使用して開発間の膜を剥切り取る。
    1. TBSで膜を0.1%の10分間2回洗浄し、再ブロックします(使用するウェスタンブロットプロトコルで好ましいブロッキング剤を使用)。
    2. 二次抗体で膜をインキュベートし、膜が一次および二次抗体を適切に取り除かれたことを確認するために再開発する。
    3. 推奨:汚染のない異なるユビキチン抗体の開発を成功させるには、蛍光または近赤外イメージングシステムを使用してください。これはしばしば抗体間の持ち越しを防ぐことができる。
  3. ユビキチンウエスタンブロット画像の中には、異なるバンド(M1など)の列を提供するものもあれば、明確な線がほとんどないか全く無いスミアのようなパターンを生成するものもあります(K48と共通)。画像化されたユビキチンウエスタンブロットの定量化のために、分子標準のはしご全体を拡張する柱の周りにボックスを描きます。
    1. ユビキチン染色がはしご全体に広がる場合は、ボックスを上下に調整します。これはLysine-48の修飾のために一般的であり、細胞外のコンパートメント間で広く変化する。
    2. すべての側面の柱を囲む背景の平均光学密度として計算される背景を減算します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明する手順を用いて、ラット脳の横扁桃体から核、細胞質およびシナプス画画を採取した(図1)。個々の分画の純度は、ウェスタンブロッティングを介して確認され、リサート中で濃縮または枯渇させるべきタンパク質に対する抗体を調べた。粗シナプス画分が収集された最初の半球では、シナプス密度タンパク質95(PSD95)はシナプス中に存在していたが、核、画分、細胞質の低いレベルで存在した(図2A)。これは、シナプス分画調製がシナプス前成分およびポストシナプス成分25の両方を分離することを実証する以前の研究と一致している。逆に、核タンパク質ヒストンH3は核中に存在していたが、細胞質のレベルが低いシナプス分率は存在しなかった(図2B)。細胞質におけるPSD95およびH3の存在は、細胞質翻訳と一致する。細胞質タンパク質β-チューブリンは、我々の細胞質画画に存在してい...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、同じ動物の異なる細胞内区画間のユビキチン-プロテアソーム活性の変化を定量化するための効率的な方法を示す。現在、ユビキチン・プロテアソーム系の活性における細胞内変化の測定のほとんどの試みは、サンプル当たり1つのコンパートメントに限定されており、実験を繰り返す必要がある。これは、多大なコストと動物の生命の損失につながります。私たちのプロトコルは、半球を分割することによって、この問題を緩和し、同じ動物の各半球から異なる細胞画分を収集できるようにします。このプロトコルを用いて、我々は、同じ動物のユビキチン-プロテアソーム活性において、学習21に応答して核、細胞質およびシナプス画の分画が差異的に変化することを初めて示すことができた。

ここで説明するプロトコルの主な制限は、得られる脳組織(サンプル)の量に依存している。例えば、上記で説明したように、このプロトコルは、所定の脳領域の半球を分割する必要があります。ただし、1 つの半球にのみ存在する特定の領域の場合など、これは常に可能であるとは限りません。これらの場合、このバッファーはすべての...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、農業生命科学部とバージニア工科大学の理学部のスタートアップファンドによって支援され、バージニア工科大学のジョージ・ワシントン・カーバー・プログラムによって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTAフィッシャー15575020他のさまざまなベンダー
20S プロテアソーム アクティビティキットミリポアシグマAPT280他のベンダーは異なるバージョンを扱っています
ATPフィッシャーFERR1441さまざまな他のベンダー
ベータアクチン抗体細胞シグナル伝達4967Sさまざまな他のベンダー
ベータチューブリン抗体細胞シグナリング2128T他のさまざまなベンダー
BioTek Synergy H1 プレートリーダーBioTekVATECHH1MT3他のベンダーは異なるバージョンを運びます
B-メルカプトエタノールフィッシャーICN19024280さまざまな他のベンダー
クラストラクタシスチン b-ラクトンミリポア シグマL7035さまざまな他のベンダー
極低温カップフィッシャー033377Bその他各種ベンダー
DMSODMSO D8418その他各種ベンダー
DTTミリポアシグマD0632その他各種ベンダー
グリセロールミリポアシグマG5516各種ベンダー
H3抗体アブカム ab1791その他各種ベンダー
HEPESミリポアシグマH3375その他各種ベンダー
塩酸フィッシャーSA48その他各種ベンダー
IGEPAL (NP-40)ミリポアシグマI3021その他各種ベンダー
K48 ユビキチン抗体アブカムab140601その他各種ベンダー
K63 ユビキチン抗体アブカムab179434その他各種ベンダー
KClミリポアシグマP9541各種その他
KONTES(コンテス) ティッシュグラインダーVWRKT885300-0002その他各種ベンダー
Laemmli sample bufferBio-rad161-0737その他各種ベンダー
リニアユビキチン抗体生命センサーAB-0130-0100M1抗体のみ
MgClミリポアシグマ442611他各種ベンダー
マイクロ遠心分離機エッペンドルフ2231000213他のさまざまなメーカー/モデル
myr-AIPエンツォライフサイエンスBML-P212-0500ミリポアシグマ
NaClミリポアシグマS3014他のさまざまなベンダー
オデッセイ FC イメージングシステムLiCor2800-02他のベンダーは、異なるバージョンを運びます
ホスファターゼ阻害剤ミリポアシグマ524625他のさまざまなベンダー
Precision Plus Protein StandardBio-rad161-0373他のさまざまなベンダー
Protease InhibitorMillipore SigmaP8340他のさまざまなベンダー
PSD95抗体細胞シグナル伝達3450T他のさまざまなベンダー
SDSMillipore SigmaL3771他のさまざまなベンダー
酸化ナトリウムフィッシャーSS255その他各種ベンダー
ショ糖ミリポアシグマS0389その他各種ベンダー
TBSアルファ アエサルJ62938その他各種ベンダー
トリスミリポアシグマT1503各種ベンダー
Tween-20フィッシャーBP337-100各種ベンダー
ユビキチン抗体エンツォライフサイエンスBML-PW8810他のさまざまなベンダー
その他 水 その他 その他

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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