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方法論記事

コーンプレート Viscometry を介したヒト血小板および細胞表面レセプターに対する均一なせん断アッセイ

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DOI:

10.3791/59704

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2019年6月5日

 ,  , 
1Aflac Cancer and Blood Disorders Center, Children's Healthcare of Atlanta, 2Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine

この記事について

サマリー

コーンプレート viscometry を用いて血小板表面受容体に均一な剪断力を加える溶液法について述べる.この方法は、他の細胞型および細胞断片に剪断を適用するためにより広範に使用されてもよく、特定のリガンド受容体対を標的とする必要はない。

要約

多くの生物学的細胞/組織は、mechanoreceptors を介してそれらの局所環境の機械的特性を感知し、圧力または機械的摂動のような力に応答することができるタンパク質。Mechanoreceptors は、彼らの刺激を検出し、メカニズムの偉大な多様性を介して信号を送信します。Mechanoreceptors の最も一般的な役割のいくつかは、接触や痛みのようなニューロン応答、またはバランスと聴覚で機能する有毛細胞です。Mechanosensation は、血管をラインにする内皮細胞、または正常な循環でせん断を経験する血球細胞などのせん断応力に定期的に曝露される細胞タイプにとっても重要です。粘度計は、流体の粘度を検出するデバイスです。回転粘度計はまた、流体に既知の剪断力を適用するために使用することができる。これらの器具が均一なせん断力を液体に導入する能力は、血液および血漿を含む多くの生物学的流体を研究するために利用されてきた。Viscometry は、溶液中の細胞に剪断を適用し、特定のリガンド-受容体対に対するせん断の効果を試験するためにも使用することができる。ここでは、コーンプレート viscometry を利用して、血小板 mechanosensory レセプター複合体 GPIb-IX に対する抗体で処理された血小板に対する内因性レベルのせん断応力の影響を試験します。

概要

Mechanoreceptors は、圧力や機械的な摂動/変形などの機械的刺激に反応するタンパク質です。いくつかの mechanoreceptors では、これらの機械的摂動を感知することは、それらが発現される細胞型の機能に明示的である。例えば、圧受容器ニューロンにおける伸張受容体をとる。これらの mechanosensitive イオンチャネルは、血管を感知することによって血圧を調節する "ストレッチ"1,2.内耳において、有毛細胞上のイオンチャネルは、音波3によって引き起こされる機械的変形を検出し、そして皮膚下限閾値 Mechanoreceptors (LTMRs) は、触覚情報4の伝達を促進する。他の場合には、mechanoreceptors は、接着または成長の確立のための細胞に重要な情報を提供します。細胞は、それらの局所環境の剛性を感知することができ、成長または広がりを指示するためにアクチン細胞骨格およびインテグリンを介して収縮力に頼ることができる5,6.

細胞または組織ベースのモデルで受容体-リガンド相互作用を研究する場合、温度、pH、リガンド濃度、張度、膜電位、および他の多くのパラメータの変化の影響を迅速かつ正確に報告することができる一般的なアッセイが存在するインビボで変化し得る。しかし、これらの同じアッセイは、受容体活性化に対する機械的な力の寄与を検出することになると、短くなる可能性があります。細胞がその微小環境を感知するか、音波を検出するか、または伸張に反応するかにかかわらず、前述の mechanoreceptors が共通して持っている1つのことは、リガンド、受容体、またはその両方が、a に固定されている相互作用に参加していることである。表面。受容体相互作用に対する機械的力の影響を試験するために開発されたアッセイは、しばしばこのパラダイムを反映する。マイクロ流体およびフローチャンバは、細胞およびレセプター7、8に対するせん断流の影響を研究するために使用される。これらのタイプの実験には、確立された流速によるせん断速度の微調整が可能であるという利点があります。他の技術は、リガンドが豊富な表面上の細胞によって適用される力を検出するために蛍光分子プローブを用いて、相互作用9,10に関与する力の大きさおよび向きの正確な読み出しをもたらす。

一方または両方のパートナーが表面に固定されている mechanosensation に加えて、せん断応力は溶液中のタンパク質および細胞に影響を与える可能性があります。これは、循環中に常にある血液細胞/タンパク質でしばしば観察され、通常表面固定された11の mechanoreceptors の活性化を介して、または下に閉塞する標的配列の暴露を介して現れることがある。静的条件12.しかし、溶液中での粒子に対する剪断力の影響を検定する技術は比較的少ない。いくつかのソリューション内アプローチでは、流体懸濁液中のボルテックスセルを介したせん断をさまざまな速度と持続時間で導入しますが、これらのアプローチでは生成されるせん断応力を非常に正確に決定することはできません。回転粘度計は、流体に特定のせん断力を加えることによって粘度を測定します。ここでは、溶液中の細胞または細胞断片に対する特定の層流せん断速度の効果を決定するための適用された方法について説明する。

血小板表面で最も発現の高いタンパク質の1つは、糖タンパク質 (GP) Ib-IX 複合体です。GPIb-IX は、血漿タンパク質フォンビルブラント因子 (VWF) の一次受容体です。一緒に、この受容体−リガンド対は、せん断応力13に対する血小板応答の基礎として長く認識されてきた。血管損傷の場合、VWF は、サブ内皮マトリックス14内の露出したコラーゲンに結合し、したがって、Vwf − GPIB − IX 相互作用を介して損傷部位に血小板をリクルートする。、生理的せん断応力下での GPIb-IX が膜近位 mechanosensory ドメイン (MSD) の展開を誘導し、GPIb-IX15を活性化する場合、おいサブユニットの結合部位への VWF の関与。最近の研究では、多くの免疫性血小板減少症 (ITP) 患者で発生したもののようなおいに対する抗体が、せん断ストレス11の下で展開される MSD を介して血小板シグナリングを誘導することもできることを示しました。しかし、この複合体を正常な循環で固定化することでせん断誘起の GPIb-IX 活性化を促進する VWF とは異なり、二価抗体は GPIb-IX を介して血小板を架橋し、MSD を循環させることができます。このようにして、せん断下での表面固定化によって通常活性化される mechanoreceptor を溶液中で活性化させることができる。本報告では、粘度計ベースの均一せん断アッセイがどのように活用され、溶液中での受容体活性化に対するせん断応力の特定のレベルの影響を検出する方法を示す。

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プロトコル

本明細書に記載されたドナー由来のヒト血小板を使用するすべての方法は、エモリー大学/アトランタの子供のヘルスケアの施設レビュー委員会によって承認を受けました。

1. 血の引くことおよび血小板の分離

  1. 実験当日に静脈穿刺を介して健康な成人ドナーに同意することからヒトの血液をリン、クエン酸塩の 3.8% に導きます。血液の1つの 4.5 mL チューブは、血小板数が 250 x 103に近いドナーの20-25 の条件のために十分な量の血小板リッチ血漿 (PRP) を得るのに十分です。
    注: 細いゲージの針 (21 G より小さい) によって血を引くことを避けなさい。
  2. PRP は22° c で、140 x gでは長いブレーキで12分間の遠心分離を行います。これは、下部に赤い血液細胞と上部の光色の PRP と、2つの異なる層になります。
  3. 45°の角度で切断されたピペットチップを通して慎重にピペット操作して、PRP の上部、曇り、黄色の層を分離し、完全な血球数 (CBC) を介して血小板数を取得します。
  4. 必要であれば、プロスタグランジン E1 (PGE1) と Tyrode のバッファー内の再懸濁 (134 mM NaCl、0.34 mM Na2HPO4、2.9 mM KCl、1 mM MgCl2、5 mm グルコース、12 mm NAHCO の存在下で、パイプ緩衝生理食塩水 (150 mm NaCl、20mm パイプ) で血小板を洗浄してください。3, 20 mm HEPES, pH 7.35) を5mm グルコースで、さもなければ、ステップ1.5 に進む。以下の手順では、洗浄について簡単に説明します。
    1. PRP の容積を 10 mL に調整し、パイプ緩衝生理食塩水で0.6 μ m PGE1 を加えます。
    2. 1900 x gで8分間遠心分離し、その後、上清を廃棄し、血小板ペレットを Tyrode の400μ l およびグルコース溶液に5分間座らせます。
    3. そっと血小板ペレットを再懸濁し、30分間それを乱しないようにします。
  5. プールされた人間の血小板乏しい血漿 (PPP) との〜 250 x 103の血小板への血小板数を調整し、22° c の懸濁液を穏やかな回転の下で維持します。

2. リガンドと均一剪断処理

注: ピペット操作が必要なセクション2のすべてのステップは、せん断を導入しないように、ゆっくり行う必要があります。

  1. 必要な抗体またはリガンドを PRP または洗浄した血小板に添加し、ピペットで上下にピペットで混ぜるか、またはピペッティングチップで撹拌します。5-10 分間室温でそのままにしておきます。等価な量の PPP または Tyrode のバッファーをネガティブ・コントロールに追加します。
  2. コーンプレート粘度計をオンにして、プレート温度を22° c に設定し、プレートがこの温度に達するまでの時間を確保してください。
  3. 処理した PRP または洗浄された血小板を、温度制御された円錐形プレート粘度計にプレートの中央に直接ピペットで移します。すべてのサンプルが円錐の縁の外側ではなく、接触点でコーンとプレートの間に堆積されていることを確認します。
  4. 適切な速度と持続時間でせん断します。
    1. 粘度計のマニュアルに示されているようにせん断を計算するか、前に示した15,16のようにします。
    2. 粘性のニュートンの法則を介して粘度と所望のせん断応力からせん断速度を決定します。figure-protocol-1;プラズマ粘度は 1.5-1.6 センチポイズ (cP)17です。たとえば、人間の循環のための通常のせん断範囲は 5-30 dyn /cm2 であり、せん断は1桁の分の時間スケールで適用されるべきです。
  5. サンプルがプレートとコーンの両方に接触したままになるように、プレート slighlty (~ 2mm) のコーンを外し、ゲルローディングまたは他の長いピペットチップを使用してサンプル容量の中心から5-10 μ l を収集します。
  6. 室温で20分間、せん断されたサンプルを目的のマーカーでインキュベートします。ホスファチジルセリンのマーカーについては、β-ガラクトース、および P −セレクチン曝露を使用して、Lactadherin C2 ドメイン (LactC2) を0.08 μ m18、エリスリーナ cristagalli レクチン (ECL) で6.25 μ g/ml、および抗 P-セレクチンリガンド (20 μ g/ml) とする。
  7. 希釈または低温保存の前に RT で20分間 2% パラホルムアルデヒドでサンプルを修正し、ステップ3.1 に進むか、または12時間を超えないように4° c でサンプルを保存します。

3. フローサイトメトリーによる表面マーカーの検出と架橋

  1. フローサイトメトリーを介してサンプルを分析し、各条件に対して少なくとも2万のイベントを収集します。
  2. 各蛍光色素の強度に対する高さ値、または幾何平均蛍光強度 (MFI) を使用していても、これらのマーカーに対するシグナル強度を定量化する。
  3. 剪断処理後の血小板架橋の検出を目指す場合は、撮像可能なフローサイトメーターでサンプルを分析し、面積・縦横比のパラメータによる架橋を定量します。
    1. 面積または縦横比のヒストグラムをプロットします。
    2. ウシ血清アルブミン (BSA) またはビヒクルを含む負のコントロールを使用して、ほとんど完全に円形のイベントを除くゲートを描画します (このゲートは通常、アスペクト比 ~ 0.819,20で描画されます)、このゲート内のイベントの割合を定量化します。アスペクト比が低いイベントは、架橋される可能性が高くなります。

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結果

図 1は GPIB − IX 活性化のトリガモデルが、血管壁に固定されたときにせん断依存性受容体活性化を説明するために最初に導入された方法を概説し、多価リガンドによる血小板架橋の活性化もサポートし得る。図 2は、GPIB-IX (6B4 および 11A8) の N 末端ドメインを標的とする2つの抗体によって処理されたヒト血小板活性化と、剪断および静的条件下での1つの対照抗体 (正常 IgG) の読み出しを示す。図 3では、6B4 によって血小板が処理され、バインド解除力が低すぎる抗体が GPIB-IX の活性化、AK2 を引き起こす原因となりました。図 4はタイムコースを示しています。血小板活性化のマーカーは、11A8 または AK2 を用いた剪断処理中の進行性の時点でプローブおよび検出された。図 5aにおい...

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ディスカッション

この原稿に記載されているプロトコールは、血小板および細胞表面受容体に対する層間せん断の効果を迅速かつ多目的に評価することを可能にする。ここに示す具体的な代表結果は、多量体または二価リガンドの効果がせん断流によってどのように影響を受けるかを強調しています。この適用に加えて、均一せん断の試金はせん断依存の効果を観察することの広い適用を有する。既知のリガンド受容体のペアが存在しない場合、均一なせん断アッセイは、特に流動サイトメトリー解析と組み合わせることにより、細胞の形状やシグナル伝達などの因子に対するせん断の影響を検出することもできます。部分的に図 5bによって言及されて、均一剪断アッセイは、画像化、生化学、および細胞ベースを含むこのプロトコルで概説された標準フローサイトメトリー分析以外の、またはそれを補完することにそれ自身を貸すアッセイ。

図 2は、アッセイの基本的な用途、特にせん断依存性リガンド受容体相互作用と陰性対照とを区別する...

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開示事項

作者は何も開示することはありません。

謝辞

この研究に関連する作業は、国立衛生研究所 (NIH) 国立心臓、肺、および血液研究所助成 HL082808、HL123984 (R.L.)、および F31HL134241 (M.E.Q.) の一部によってサポートされていました。また、NIH 国立医学総合研究所助成 T32GM008367 (M.E.Q.) によって提供された資金。そして、アトランタとエモリー大学小児科フローサイトメトリーコアの子供のヘルスケアからのパイロット助成金。著者は、6B4 抗体を共有するためのハンス・ Deckmyn 博士、およびエモリー小児研究センターのテクニカルサポートのフローサイトメトリーコアに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
APC 抗ヒト CD62P (P-セレクチン)BioLegend304910
Brookfield Cap 2000+ 粘度計
Erythrina cristagalli lectin (ECL)Vector LabsFL-1141
Pooled Normal Human PlasmaPrecision BiologicCCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)BD369714
Vacutainer 採血セット、21G x ¾「ニードルBD367287
Brookfield-FITC-conjugated

参考文献

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