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方法論記事

インビトロバス発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内細菌叢との相互作用の解析

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DOI:

10.3791/59725

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2019年8月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

この記事について

サマリー

ここで説明する内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用をインビトロバッチ発酵システムを用いて調べるプロトコルである。

要約

近年、ヒトの腸内微生物は、人間の健康を促進し、病気を予防する研究の重要なターゲットとなっています。その結果、内生生物(例えば、薬物およびプレバイオティクス)と腸内微生物叢との相互作用の研究は重要な研究テーマとなっている。しかし、人間のボランティアとの生体内実験では、生命倫理と経済的制約のために、このような研究には理想的ではありません。その結果、動物モデルは、生体内でのこれらの相互作用を評価するために使用されている。それにもかかわらず、動物モデル研究は、動物とヒトの微生物叢の組成や多様性に加えて、生物倫理の考慮事項によって依然として制限されています。別の研究戦略は、インビトロで内生生物と腸内微生物叢の相互作用の評価を可能にするバッチ発酵実験の使用です。この戦略を評価するために、ビフィズス菌(Bif)外糖(EPS)を代表的な異生物性として使用した。次に、Bif EPSとヒト腸内微生物叢との相互作用を、薄層クロマトグラフィー(TLC)、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンシングによる細菌コミュニティ組成解析、ガスクロマトグラフィーなどのいくつかの方法を用いて検討した。短鎖脂肪酸(SCFA)の。ここでは、インビトロバッチ発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を調査するプロトコルを提示する。重要なことに、このプロトコルは、他の内生生物と腸内微生物叢間の一般的な相互作用を調査するために変更することもできます。

概要

腸内細菌叢は、人間の腸の機能と宿主の健康に重要な役割を果たしています。その結果、腸内微生物叢は最近、疾患予防と治療の重要な標的となっている1.さらに、腸内細菌は宿主腸細胞と相互作用し、代謝活動、栄養利用性、免疫系変調、さらには脳機能と意思決定を含む基本的な宿主プロセスを調節する2、3.内生生物は、腸内微生物叢の細菌組成と多様性に影響を与えるかなりの可能性を持っています。したがって、内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用は、研究の注目を集めている 4,5,6,7, 8,9.

生体倫理と経済的制約のために生体内の内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を評価することは困難である。例えば、内生生物とヒト腸内微生物叢の相互作用を調べた実験は、食品医薬品局の許可なしには行うことができず、ボランティアの募集は高価です。その結果、動物モデルは、多くの場合、このような調査のために使用されます。しかし、動物モデルの使用は、異なる微生物叢組成物と動物対ヒト関連のコミュニティにおける多様性のために制限される。内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を探索するインビトロ法は、バッチ培養実験を用いて行う。

外食糖(EPS)は、ヒトの健康の維持に著しく寄与するプレバイオティクスである10.異なる単糖組成物と構造からなる異なるEPSは、異なる機能を示すことができます。これまでの分析では、現在の研究11で標的とされる代表的な異種生物学であるBif EPSの組成を決定した。しかし、宿主関連代謝効果はEPS組成および多様性に関して考慮されていない。

ここで説明するプロトコルは、12人のボランティアからBif EPSを発酵させるfecal微生物叢を使用する。薄層クロマトグラフィー(TLC)、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンシング、およびガスクロマトグラフィー(GC)を組み合わせて、EPSとヒト腸内微生物叢との相互作用を調べます。生体内実験と比較して、このプロトコルの明確な利点は、ホストの代謝からの干渉効果の低コストおよび回避である。さらに、記載されたプロトコルは、内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用を調査する他の研究で使用することができる。

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プロトコル

このプロトコルは、湖南理工学大学(中国湖南省)と浙江省権江大学(浙江省)の倫理委員会のガイドラインに従っています。

1. 細菌の調製

  1. ビフィズス菌培地ブロスの調製
    1. 蒸留水の950 mLで以下の成分を組み合わせる:肉エキス、5グラム/L。酵母エキス, 5グラム/L;カゼインペプトン, 10 g/L;大豆色, 5グラム/L;ブドウ糖, 10 グラム/L;K2HPO4,2.04 g/L;MgSO4·7H2O, 0.22 グラム/L;MnSO4.H20, 0.05 g/L;ナクル、5グラム/L;トウェン 80, 1 mL;塩溶液, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0.25 g/L;KH2PO4,1 g/L;NaHCO3, 10 g/L;NaCl,2グラム/L);レサズリン, 0.4 mL (2.5 mg/L).pHを2 M NaOHで6.8に調整します。
    2. 121 °Cで15分間オートクレーブを行い、嫌気性条件下でスープを室温(RT)まで冷却することができます(10%H2、10%CO2、80%N2)。フィルター殺菌システイン-HCl(0.5g/L)とムピロシン(5mg/L)を培地に添加します。
  2. 凍結ビフィズス菌ロングムのアリコート(50μL)を嫌気条件下で5mLのビフィズス菌培地ブロスを培養チューブに加え、次いで37°Cで24時間の嫌気性インキュベーターで培養する。

2. ビフィズス菌エプスの調製

  1. PYG寒天培地の調製
    1. 以下を組み合わせる: ペプトン, 20 グラム/L;酵母エキス, 10 g/L;ブドウ糖, 5 g/L;NaCl, 0.08 g/L;CaCl2, 0.008 g/L;MgSO4·7H2O, 0.008 グラム/L;K2HPO4, 0.04 g/L;KH2PO4,0.04 g/L;NaHCO3, 0.4 g/L;10 M NaOH を使用して pH を 7.2 に調整します。
    2. 121 °Cで15分間メディアをオートクレーブし、~50°Cまで冷却します。次いで、培地1L当たり、フィルター殺菌ビタミンK1溶液の0.5mL(99%エタノールの99mLに溶解したビタミンK1の1g)、5mLのヘミン溶液(1モル/L NaOHの1mLに溶解したヘミンの0.5g)を添加する。 その後、蒸留水で100mLまで持ち込み、システイン-HClを0.5gにした。
    3. PYGプレートを注ぐ前に、フィルター殺菌5-ブロモ-4-クロロ-3-アドリルβ-D-ガラクトピラノシド(X-Gal、0.06 g/L)、LiCl·3H2O(5.7 g/L)およびムピロシン(5mg/L)を培地に加えます。
      注:X-GalおよびLiCl.3H2Oは着色変化によって版のB.ロングラムコロニーの同定を可能にする。
  2. 20 μLのB.ロングラム株(ステップ1.2)をPYGプレートに接種し、嫌気性インキュベーターを37°Cで72時間置きます。
  3. 計量スクープを使用してPYGプレートから粘膜細菌コロニーを収集し、その後、渦発振器を使用してリン酸緩衝生理食生(PBS)の10 mLで完全に再中断します。
    注:細菌およびEPS混合物は、繊維がPBSに完全に溶解するまで、渦巻きまたはピペッティングを繰り返し繰り返すことによって完全に再懸濁する必要があります。
  4. サスペンションを6,000 x gで5分間遠心分離します。
  5. 慎重に新しい遠心管に上清を転送し、繰り返し反転とブレンドすることにより、冷たい99%エタノールの3つのボリュームと完全に混合します。
  6. 5分間6,000 x gで混合物を遠心分離し、上清を完全に除去する。
  7. 速度真空を使用してEPS抽出物を一晩削り乾燥させ、遠心管から沈殿物を取り除きます。

3. 発酵培地の調製

  1. 基礎培養培地VIの調製
    1. 以下を組み合わせる:ペプトン、3グラム/L。トリプトン, 3 g/L;酵母エキス, 4.5 g/L;ムチン, 0.5 グラム/L;胆汁酸塩 第3号, 0.4 g/L;ナクル、4.5グラム/L;KCl、2.5グラム/L;MgCl2·6H2O, 4.5 グラム/L;1 mL トウェン 80;CaCl2.6H2O, 0.2 g/L;KH2PO4, 0.4 g/L;MgSO4·7H2O, 3.0 グラム/L;MnCl2·4H2O, 0.32 グラム/L;フェソ4·7H2O, 0.1 グラム/L;CoSO4·7H2O, 0.18 グラム/L;CaCl2·2H2O, 0.1 グラム/L;ZnSO4·7H2O, 0.18 グラム/L;CuSO4·5H2O, 0.01 g/L;NiCl2·6H2O, 0.092 g/L. pHを1 M HClで6.5に調整します。
    2. セクション2.1で行われたようにヘミンとシステインを準備し、オートクレーブと冷却後に追加します。
  2. VIベースメディアを使用して、異なる炭素源を含む培養メディアを準備します。オートクレーブする前に、Bif EPS繊維の8g/Lを培地VIに加え、グループVI_Bifを含む。さらに、グループVI_Starchを表すために中VIに8g/Lデンプンを追加します。最後に、炭素源を添加せずに培地VIを対照(群VI)として用いられる。
    注:Bif EPSおよびデンプンは、まず磁気攪拌機を使用してお湯に溶解し、次いで調製VI培地と混合する。
  3. 121 °Cで15分間すべてのメディアをオートクレーブし、RTに冷却することができます。
  4. 各培地のサブサンプル(5mL)を嫌気性インキュベーターで培養管に移し、残りの培地を4°Cに保存する。

4. ヒトの大便サンプル調製

  1. 健康な成人の人間のボランティアから新鮮な排便の直後に、便器容器を使用して新鮮な排便を採取し、その後、スラリー製剤に使用します。
    注:サンプル収集の前に、すべてのボランティアは、サンプルを寄付する前に少なくとも3ヶ月間、抗生物質、プロバイオティクス、またはプレバイオティクス治療を受けないようにスクリーニングする必要があります。さらに、すべての寄付者は、情報に基づいた書面による同意を提供する必要があります。
  2. 新鮮な大さじサンプル(1g)を0.1M嫌気性PBS(pH 7.0)の10mLにガラスビーカーに移し、ガラス棒を使用して10%(w/v)スラリーを調製します。
  3. 0.4 mMふるいを使用して、fecal スラリーをろ過します。次いで、濾過されたスラリーのサブサンプルを使用してバッチ培養発酵実験を接種し、残りを-80°Cで保存してさらなる分析を行う。
    注:ステップ4.2-4.3は嫌気性室で行われます。

5. インビトロバッチ発酵

  1. 濾過された大腿骨スラリー(500μL)を嫌気室内のステップ3.2で調製した発酵培地に加え、37°Cでインキュベートする。
  2. 嫌気性チャンバーで24時間と48時間で発酵サンプルの2 mLを収集し、3分間6,000 x gでチャンバーの外に遠心分離機を集めます。
  3. 上清を、多糖類分解分析および短鎖脂肪酸(SCFA)測定に使用する新しい遠心チューブに慎重に移します。
  4. 遠心分離ペレットを-80°Cで保存し、その後細菌ゲノムDNA抽出に使用します。

6. ヒトの大腿骨微生物叢によるEPS分解

  1. 発酵した上清を0.2μLの発酵槽をあらかじめコーティングしたシリカゲル-60 TLCアルミニウム板に積み込み、毛ドライヤーを使用して乾燥させます。
  2. ギ酸/n-ブタノール/水(6:4:1、v:v:v)溶液の20 mLでプレートを開発し、毛ドライヤーを使用して乾燥させます。
  3. 染色するためにオルシノール試薬にプレートを浸し、その後、ヘアドライヤーを使用して乾燥させます。
    1. 蒸留水の25 mLに900mgのリシェノールを溶解し、375mLのエタノールを添加してオルシノール試薬を調剤する。その後、濃縮硫酸をゆっくりと添加し、溶液を十分に混合する必要があります。
  4. ベーキングオーブンで3分間120°Cでプレートを加熱し、TLCバンドを測定してEPSの劣化を評価します。

7. ヒト腸内微生物叢に及ぼすEPSの影響

  1. ステップ4.3で調製した元の大腿骨サンプルと、ステップ5.4で調製した発酵サンプルを凍結解凍します。
  2. 製造元の指示に従って便細菌ゲノムDNA抽出キットを使用して、すべてのサンプルから細菌ゲノムDNA(gDNA)を抽出します。
  3. マイクロ分光光度計と寒天ゲル電気泳動を使用して、DNA濃度、整数、およびサイズ分布を決定します。
  4. 前述の前方および逆プライマー12を用いて抽出されたgDNAから細菌16S rRNA遺伝子のPCRを行う:
    -フォワードプライマー(バーコードプライマー338F):アクトッカグガグガッカ
    -リバースプライマー(806R): GGACTACHVGGGTWTTTAAT
    次のサーマル サイクラー条件を使用します。
    1. 94 °C 5分
    2. 30sのための94 °C。
    3. 30sのための55 °C。
    4. 72 °C 1分
    5. 35 サイクルで 2 ~ 4 を繰り返す
    6. 72 °C 5分
    7. 4 °Cは、サーマルサイクラーから取り外すまで保持します。
  5. 超高スループット微生物コミュニティ解析を用いたDNAシーケンシング企業で、PCR製品のハイスループットシーケンシングを行います。
  6. 微生物生態学(QIIME)配列分析パイプライン13に対する定量的洞察を使用して、クリーンで高品質なシーケンスを取得します。
  7. Mothurソフトウェアスイート14などのバイオインフォマティクスツールを使用して、97%を超えるヌクレオチド類似性を持つ16S rRNA遺伝子配列に対する操作用分類単位(OTUs)を定義する。
  8. 各 OTU から代表的なシーケンスを選択し、RDP 分類器と SILVA 分類データベースを使用して、代表的なシーケンス15を分類します。
  9. バイオインフォマティクスツール16を使用して、グッドのカバレッジ、アルファダイバーシティメトリック(シンプソンとシャノン指数を含む)、および豊かさ(観測されたOTUsの数)を計算します。

8. ヒト腸内微生物叢によるSCFA産生に及ぼすEPSの影響

  1. ステップ5.3~2mL遠心管で調製した発酵上清(1mL)を加えます。
  2. 各サンプルに25%(w/v)のメタリン酸の0.2 mLを加え、ボルテキシングで溶液を十分に混合します。
  3. 13,000 x gで20分間混合物を遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移します。
  4. 併用して、120 mM酢酸、プロピオン酸、ブチリック、アイソブチリック、バレリックおよびイソバレル酸の溶液を調調します。次に、各調製酸の1mLを25%(w/v)の1.2mLに加え、標準カクテルとして使用する。
  5. 0.22 μM膜を使用してサンプルを濾過します。
  6. 前述のプロトコル11、17に従って高性能ガスクロマトグラフィーを使用してSCFA濃度を検出する。
    注: InertCap FFAP カラム(0.25 mM x 30 m x 0.25 μM)は、ガスクロマトグラフィー(GC)に使用されます。SCFA濃度は、GCソリューションソフトウェアパッケージのシングルポイント内部標準法を使用してピーク領域に基づいて定量されます。

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結果

粘膜EPSの産生は、72時間の嫌気性インキュベーション後のPYGプレート上のB.ロング培養において観察された(図1A)。培養スクローの遠心分離は、続いてエタノール沈殿および乾燥、セルロース様EPSの採取をもたらした(図1B)。乾燥EPSおよび可溶性デンプンは、次いで発酵培養のための炭素源として使用された。TLCは、その低コストおよび迅速な結果ターンアラウンド18によるオリゴ糖分離および純度分析に使用された。ヒトの大腿骨微生物叢によるデンプンの分解率はBif EPS(図2)よりも速かったが、一部のEPS接種サンプルではBif EPSの分解が明らかに認められた。

その後、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンシングと主座標解析(PCoA)を用いたコミュニティ組成解析を行い、Bif EPSがヒト腸内微生物叢に及ぼす影響を調べた。VI_Bi...

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ディスカッション

過去10年間にわたり、ヒト腸内微生物叢の組成と活動の理解に向けて大きな進歩が見られました。これらの研究の結果として、ホロビオエント概念が出現し、ヒトと腸内微生物叢19、20との間のような宿主および関連する微生物群相との相互作用を表す。さらに、ヒトは現在でも超生物21とみなされ、腸内微生物叢はヒト22、23における機能器官の一つとして認識されている。人体は、約10個の13個の微生物細胞24からなる複雑な微生物生態系をホストしている。さらに、腸内微生物叢のゲノムは、宿主の代謝能力を拡張する多数の代謝関連遺伝子をコードするヒトからの補助ゲノムと考えられている4。しかしながら、治療薬および食事由来の生理活性化合物を含むゼノバイオティクスは、腸内微生物...

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開示事項

著者らは、利益相反がないと宣言している。数字はYinらで引用された。11.

謝辞

本研究は、中国国家自然科学財団(No.31741109)、湖南自然科学財団(No.2018JJ3200)、湖南理工学大学応用特性規律の構築プログラムによって資金提供されました。私たちは、この原稿の準備中にその言語的援助のためにLetPub(www.letpub.com)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上mの膜フィルターMilliporeSLGP033RBサンプルをろ過するために使用
0.4mmのふるサーモフィッシャー308080-99-1人間の糞便サンプルを準備するために使用
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル β-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)SolarbioX1010カラープレートを準備するために使用
酢酸Sigma-Aldrich71251SCFA
寒天SolarbioYZ-1012214中
型嫌気性チャンバーElectrotek のコンポーネント AW 400SG細菌の培養および発酵
のオートクレーブSANYOMLS-3750オートクレーブの
バクトsoytoneSigma-Aldrich70178媒体の
部品 ベーキングオーブン上海Yiheng科学器械Co.、株式会社DHG-9240A熱し、焼くために使用
媒体の部品
ビフィドバクテリウム・ロンガム ロイターATCCATCC® 51870™細菌
胆汁酸塩SolarbioYZ-1071304中
型酪丘の成分 Sigma-Aldrich19215SCFA
CaCl2SolarbioC7250中型
キャピラリーカラムSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)SCFA検出に使用
カゼインペプトンSigma-Aldrich39396中型遠心分離機の成分
Thermo ScientificSorvall ST 8遠心分離に使用
CoSO4.7H2OSolarbioC7490中型
CuSO4.5H2OSolarbio203165中型
Cysteine-HClSolarbioL1550成分 中
型エタノールSigma-AldrichE7023ビタミンK1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614
ギ酸Sigma-Aldrich399388TLCに使用
ガスクロマトグラフィー津製作GC-2010 PlusSCFA検出に使用
ガラスビーカーフィッシャーサイエンティフィックFB10050スラリー調製に使用
グルコースSolarbioG8760中体成分
ヘミンSolarbioH8130中体
HClの成分Sigma-Aldrich30721緩衝液のpHを調整するために使用される基本溶液
イソ酪酸Sigma-Aldrich46935-USCFA用標準サンプル
イソ吉草酸Sigma-Aldrich129542SCFA用標準サンプル
K2HPO4SolarbioD9880中程度の塩溶液
KClSolarbioP9921中型
KH2PO4SolarbioP7392中型
LiCl.3H2OSolarbioC8380カラープレートの調製に使用
肉抽出物Sigma-Aldrich-Aldrich70164中型
メタリン酸Sigma-Aldrichの成分B7350SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160の標準サンプル 中型
MgSO4.7H2OSolarbioM8300中型
MISEQIlluminaMiSeq 300PE システムDNA シーケンシング
MnSO4.H20Sigma-AldrichM8179中質の塩溶液
ムピロシンSolarbio YZ-1448901抗生物質
NaClSolarbioYZ-100376中質
の塩溶液 NaHCO3Sigma-Aldrich792519中程度の塩溶液
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000DNA濃度を決定する
NaOHSigma-Aldrich30620緩衝液のpHを調整するために使用される塩基性溶液
n-ブタノールChemSpider71-36-3NiCl
2Solarbio746460中程度の
成分 オルシノールSigma-Aldrich447420オルシノール試薬
の調製に使用プロピオン酸シグマ-アルドリッチ94425SCFA
QIAamp DNAスツールミニキットQIAGEN51504抽出細菌ゲノムDNA
すぐに使用できるPBS粉末Sangon Biotech(Shanghai)Co.、Ltd。A610100-0001脂質懸濁液の調製に使用
レサズリンSolarbioR8150嫌気性装置
速度真空濃縮器LABCONCOCentriVapEPSsの調製に使用
デンプンSolarbioYZ-140602炭素源に使用
硫酸シグマ・アルドリッチ150692オルシノール試薬
T100 PCRBIO-RADPCR 増幅
TLC アルミニウム シートMerckMillipore116835TLC
トリプチカーゼ ペプトンSigma-AldrichZ699209中トリ
プトンΣ-AldrichT7293中速の成分
Tween 80SolarbioT8360中程度の塩溶液
ValericSigma-Aldrich75054SCFA
の標準的なサンプル ビタミンK1Sigma-AldrichV3501中
型の渦の発振器科学産業Vortex.Genie2渦巻くために使用
酵母のエキスSigma-AldrichY1625中型の
ZnSO4.7Hの部品2OSigma-AldrichZ0251中程度の成分
のい のための標準サンプル 牛肉のエキスSolarbio G8270をの塩溶液 のの成分 の成分 中型の成分 島所 用標準サンプル の調製に使用 1861096 の部品

参考文献

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