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方法論記事

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

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DOI:

10.3791/59731

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2019年5月24日

 , 
1Division of Immunology, Allergy, and Rheumatology, Department of Internal Medicine, College of Medicine, University of Cincinnati

この記事について

サマリー

ここでは、アポトーシス胸腺細胞および腹膜マクロファージを調製するためのプロトコールを提示し、efferocytosis の効率および特異的阻害剤媒介性貪食のアポトーシス胸腺細胞のブロッキングを分析する。このプロトコルは、人工ビーズおよび細菌を含む他の粒子の細胞媒介性クリアランスにおいて広範な適用を有する。

要約

細胞のアポトーシスは自然なプロセスであり、胚発育、恒常性調節、免疫寛容誘導、および炎症の解決において重要な役割を果たします。体内のアポトーシス破片の蓄積は、時間をかけて全身性自己免疫疾患につながる慢性炎症反応を引き起こす可能性があります。アポトーシス細胞の障害は、様々な自己免疫疾患に関与している。アポトーシスクリアランスは、生理的条件下で稀に検出される複雑なプロセスである。それは豊富な表面受容体とシグナル分子を含みます。アポトーシス細胞クリアランスの過程を研究することは、洞察力のある分子メカニズムとその後の生物学的反応をもたらし、新しい治療法の開発につながる可能性があります。ここでは、アポトーシス胸腺細胞の誘導に関するプロトコール、腹膜マクロファージの調製、およびフローサイトメトリーおよび顕微鏡法によるアポトーシス細胞クリアランスの解析について説明します。すべての細胞は特定の段階でアポトーシスを受け、多くの住宅および循環細胞はアポトーシスの破片を吸収することができます。したがって、ここで説明するプロトコルは、多くのアプリケーションで、アポトーシス細胞の結合および他の多くの細胞型による摂取を特徴付けるために使用することができる。

概要

私たちの体は、毎日1-10 のアポトーシス細胞を生成します。このような多数のアポトーシス細胞は、免疫応答が静止したままである方法でクリアされなければならない。アポトーシス細胞のクリアランスを適時に確保するために、多数の種類の組織の居住細胞および循環細胞がアポトーシス細胞1を巻き込むメカニズムを開発する。アポトーシスの機能不全調節は、様々な炎症性疾患および自己免疫2の発症および進行に関与している。アポトーシスはまた、癌の発症の病因および従来の治療法3,4に対するその後の耐性において重要な役割を果たす。アポトーシス細胞の除去は、一般に抗炎症反応を促進し、これは免疫学的許容寛容に結合し得る5。アポトーシス細胞クリアランスの障害は、自己免疫を促進し、ヒトおよびマウス6の両方における全身性自己免疫疾患の発症に寄与する。

細胞がアポトーシスを受けると、それらは内部リーフレットから膜の外側リーフレットにホスファチジルセリン (PtdSer) を暴露する。PtdSer は、その後、表面受容体を介して食細胞によって認識されるであろう。1ダース以上の受容体がアポトーシス細胞の貪食を認識および/または促進することが同定されている。一般に、アポトーシス細胞クリアランスには少なくとも3種類の表面受容体が関与する: テザリング受容体は、アポトーシス細胞を認識する。貪食のくすぐり, 開始します。chaperoning 受容体は、全体のプロセス7を促進する。TAM 受容体チロシンキナーゼ (TAM RTKs) は、 Tyro-3、 xl、およびMer から成り、主に免疫系8の骨髄細胞によって発現される。TAM RTKs の主な機能は、テザリング受容体としての役割を果たし、アポトーシス細胞や破片の貪食除去を促進することです。当社グループは、長年にわたり自己免疫の設定において、TAM 媒介性アポトーシス細胞クリアランスを研究してきました。ビタミン K 依存性タンパク質成長停止特異的タンパク質 6 (Gas6) およびプロテイン S (ProS) は、TAM 受容体9,10に結合し、活性化する。Gas6 は、心臓、腎臓、および肺で生成されます。長所は主に肝臓11で生産される。TAM は、Gas6/ProS の N 末端がアポトーシス細胞上の PtdSer に結合するような方法でアポトーシス細胞を認識し、Gas6/プロの C 末端は食細胞の表面に固定された TAM 受容体に結合します。他の受容体と共に、アポトーシス細胞の貪食が12に生じる。Mer はリガンドの長所と Gas6 の両方に結合することができますが、Gas6 は、抗 Mer 抗体13によってブロックすることができる、アポトーシス細胞の mer 媒介マクロファージ食のための唯一のリガンドであると思われることがわかりました。マクロファージはプロの食細胞です。マクロファージによるアポトーシス細胞の迅速なクリアランスは、細胞内抗原に対する炎症や自己免疫反応の阻害にとって重要である。Mer 受容体チロシンキナーゼは、マクロファージ貪食およびアポトーシス細胞14の効率的なクリアランスにとって重要である。マウス脾臓では、Mer は主にマージナルゾーンおよび有形の体マクロファージ13上に発現する。

ここで提示されるプロトコルは、細胞のアポトーシスを誘導し、プロセスと efferocytosis の効率を測定する方法を示すための基本的な方法を説明しています。これらのプロトコールは、異なる起源のアポトーシス細胞の貪食における他の細胞型による efferocytosis の研究に容易に適応することができる。

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プロトコル

実験マウスを、我々のマウスコロニーにおいて飼育および維持した。すべての動物の仕事は、シンシナティ大学の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) のガイドラインに従って行われました。

1. CFSE 標識されたアポトーシス胸腺細胞の調製

  1. Euthanize を10分間吸入して 2つのナイーブ C57/B6 マウスを解剖し、胸腔を開いて、湾曲した微細先端鉗子を有する胸腺を rpmi1640 培地培地 10 mL を含む組織培養ペトリ皿に取り出し (引き抜く)。
  2. 顕微鏡のスライドの2つの曇りの端に対して全体の胸腺を粉砕し、100μ m の細胞ストレーナーを介して懸濁液を濾過することにより、単一細胞懸濁液を得る。
  3. 10 mL の胸腺懸濁液を 50 mL チューブに集め、300 x gで5分間遠心分離します。
  4. 上清を除去し、1x PBS の 40 mL で再懸濁し、血球計数器で細胞数をカウントする。
  5. 300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。
  6. 再懸濁は、1つの細胞懸濁液として 50 mL チューブ中に 20 mL の 1x PBS (2 x 10 8 細胞以上の場合は、残りの細胞を別の 50 ml チューブ中の 1 x PBS で再懸濁) にしました。
  7. 5μ m の CFSE を、CFSE ストック溶液 (2.5 mM) の40μ l を 1x PBS の 20 mL にピペットで50し、チューブ 2-3 回を反転させることによってよく混ぜることによって、別の 1 mL (20 mL) の 1x PBS を1つの容積 (20ml) で作ります。
  8. ステップ1.7 から CFSE の20ml をステップ1.6 からの細胞懸濁液の20ml に加える (CFSE の最終濃度は現在2.5 μ m である)。
    注:20 mL の細胞懸濁液ごとに、20 mL の CFSE チューブが必要です。
  9. 細胞と CFSE 混合チューブを 2-3 回反転させ、室温で2分間の暗所で混合物をインキュベートしてから、10 mL の熱不活性化ウマ血清を加えて反応を停止する。
  10. 室温で5分間 300 x gで 50 mL チューブ混合物を遠心分離します。
    注: CFSE ラベリングが成功すると、セルペレットは淡黄色になります。
  11. 上清を取り除き、40 mL の細胞ペレットを 1x PBS で再懸濁し、血球計数器で細胞数をカウントする。
  12. 細胞懸濁液を 300 x gで5分間遠心し、上清を廃棄する。
  13. 40 mL の RPMI1640 培地培地で再び細胞ペレットを洗浄する。
  14. 上清および再懸濁細胞を RPMI1640 培地組織培養培地 (RPMI1640 培地、20 mM HEPES、10% FBS (熱不活性化)、20 mM グルタミン、および1x ペン/喉頭炎) で除去し、100 mM組織培養皿にて 7 x 106 細胞/ml の濃度で行う。
    注: より多くの細胞が得られる場合、別の 100 mm のティッシュの培養皿は必要である。
  15. 5% の CO2 で供給される組織培養インキュベーター内で、最終濃度1μ m の細胞懸濁培養にスタウロスポリンを加え、37° cで4時間培養する。

2. 腹膜マクロファージの作製

  1. 2つの C57B6 マウス (または実験室にある任意の遺伝子操作マウス) を、0日目に 3% 熟成したチオグリコール酸の1ml と共に腹腔内に注入する。
  2. Euthanize はステップ1.1 のように5日目にマウスを切断し、腹部の皮膚を切り取って皮を開け、腹膜をそのまま残す。10 ml の洗浄緩衝液 (RPMI1640 培地、2% FBS、0.04% EDTA) を 18 G 針で取り付けた10ml シリンジを使用して腹腔内にすばやく押し込むことによって腹膜腔を洗い流す。
  3. 同じ針/シリンジで洗浄緩衝液をゆっくりと回収し、洗浄緩衝液を 50 mL チューブに集めます (詳細はヤンセンラボの第15条を参照してください)。
  4. 腹膜 gavage を 1x PBS で2回洗浄し、RPMI1640 培地の組織培養培地中の腹膜マクロファージを、再懸濁プレートの各ウェルに 2 x 106 細胞/ml およびアリコート500μ l の密度で注入する。プレートを2時間組織培養インキュベーター内に残します。
  5. 500μ l のフレッシュカルチャー培地を2回吸引し、交換することにより、浮遊細胞を取り除きます。
  6. 必要に応じて、マクロファージ培養の各ウェルに図の凡例に示されている濃度で TAM 受容体チロシン阻害剤、RXDX-106 を追加し、別の2時間インキュベートします。

3. アポトーシス性胸腺細胞による腹膜マクロファージの共培養

  1. ステップ1からアポトーシス胸腺細胞を収集し、RPMI1640 培地培地で3回洗浄する。アポトーシス誘導の効率は、アネキシン V/7-AAD キットを使用してこの段階で測定することができます。
  2. プロトコル #2 からマクロファージ培養物の各ウェルに 0-12 x 106 個の細胞 (500 μ l 培地) を分配し、実験的な配置に従って (例えば、図 1を参照)。これにより、24ウェルプレートの各ウェルにおける 1 mL の全培養体積が可能になる。アポトーシス胸腺細胞の添加直前にブロッキング抗体を培養に加える。
  3. 培養液を 5% CO2 で供給した組織培養インキュベーター中で4時間37° cで混合する。
  4. 自由浮遊アポトーシス細胞を除去するために 1x PBS (500 μ m EDTA を含む) で培養の各ウェルを洗浄します。
  5. この段階で、CD11b でプレート結合マクロファージを染色する。
    1. 染色バッファー (1x PBS, 1% BSA) を用いてプレート結合マクロファージを1回洗浄する。
    2. 各ウェルに2μ l の CD11b を含む200μ l の染色緩衝液を加えます。
    3. プレートを4° c で20分間インキュベートします。
    4. 染色緩衝液でプレートの各ウェルを3回洗浄する。
    5. 200μ l の染色緩衝液を加え、蛍光顕微鏡下での画像分析のためにプレートを進行させる。
  6. あるいは、PBS に 1% リドカインの1ml を加え、37° c で10分間インキュベートすることによって、プレート結合性マクロファージを切り離します。
  7. 繰り返しピペッティングを使用して、プレート結合マクロファージをデタッチします。
  8. マクロファージ懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルからの個々の5ml の丸底 FACS チューブに移す。
  9. 300 x gで5分間遠心します。
  10. 上清を除去し、2μ l の CD11b (染色バッファー中の1:200 希釈) を含む200μ l の染色緩衝液を加えた。
  11. 染色バッファー内の細胞懸濁液を4° c で20分間インキュベートします。
  12. 細胞懸濁液を染色緩衝液で2回洗浄する。
  13. 200μ l の染色バッファーを加え、フローサイトメーターを用いて FACS 分析を行い、CFSE 陽性マクロファージの割合を分析します。

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結果

腹膜マクロファージを媒介とするアポトーシス胸腺細胞の貪食の解析腹膜マクロファージおよびアポトーシス細胞を調製し、プロトコールで説明したように共培養した。マクロファージを、氷上で20分間にわたって PE 共役抗 CD11b 抗体で剥離および染色した。その後、マクロファージをフローサイトメーターで洗浄・処理した。見られるように、アポトーシス細胞が培養物に加えられなかったとき、右下の象限に CFSE 陽性マクロファージは存在しない (図 1Aおよび図 2、最初のパネル)。チオグリコール酸を刺激した腹腔マクロファージは、アポトーシス細胞を巻き込む可変容量を有する。マクロファージの最大 30% が CFSE チャネルで陽性を示し、この実験で CFSE 標識されたアポトーシス細胞を摂取したことを示した (図 1)。CFSE 陽性マクロファージが異なる強度のために右下の象限に広がることに注意する価値があり、...

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ディスカッション

アポトーシスは、多くのシグナルカスケードを含み、タンパク質の発現、分泌、および輸送を誘導する高度に保存された細胞死プロセスです。アポトーシスは、しばしば細胞形態変化17に関連する。アポトーシス細胞は、食細胞を誘引するサイトカインおよびケモカインを積極的に放出し、貪食のプロセスを開始し、タイトコントロール18の下で非常に複雑な経路である。一方、壊死細胞死は、炎症反応を引き起こす危険信号を放出する1.アポトーシス細胞の欠損または長期のクリアランスは、これらの細胞19の二次壊死につながる。したがって、アポトーシス誘導におけるタイミングは、実験において非常に重要である。細胞アポトーシス20を誘導するための多数の方法がある。しかしながら、誘導の持続時間および強度は、細胞型に依存する。最大の最適条件を決定するために滴定実験を設定することをお勧めします (90-95%)アポトーシスの生産。アネキシン-V/7-AAD...

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開示事項

作者は何も開示することはありません。

謝辞

シャオ・ラボの研究は、医学部からの革新的な賞と、シンシナティ大学の内部医学部門からの若手教員パイロット賞と NIDDK/NIH からのグラント DK K01_095067 によって支えられています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Ack溶解バッファーGIBCOA10492
Annexin V/7-AADBD Pharmingen559763
Anti-Mer antibodyR&D SystemsBAF591
CD11b-PE (clone M1/70)BD Pharmingen553311
CFSEInvitrogenC1157
DMSOSigma-AldrichD-2650
EDTA (0.5 mM)GIBCO15575-020
FACS tubesBD Biosciences352017
Frosted slidesフィッシャーサイエンティフィック12-552-343
馬用血清(熱不活化)Invitrogen26050088
LidocaineSigma-AldrichL-56471x PBS
PBS、1xCorning21040CV
RPMI-1640Corning10040CV
RXDX-106Selleck ChemicalsCEP-40783
に 1% バッファーを調製スタウロスプリン(100mg)フィッシャーサイエンティフィックBP2541-100DMSOの214.3 mlを100mgに加えて、1mMのストッキング溶液を作ります
チオグリコール酸ミディアムブリューワー 修正BDバイオサイエンス2430101´で3%チオグリコール酸緩衝液を準備します。PBSをオートクレーブ滅菌し、3ヶ月間暗所で保存します。

参考文献

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