タンパク質結合マイクロアレイ(PBM)実験は、生化学的アッセイと組み合わせることで、テンプレートDNA上でRNAプライマーを合成する酵素であるDNAプリマーゼの結合および触媒特性を連結します。この方法は、ハイスループットプリマゼプロファイリング(HTPP)として指定され、様々な酵素のDNA結合パターンを明らかにするために使用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
DNAプリマーゼは、DNA複製中にDNAポリメラーゼによって遅れ鎖上の岡崎断片のDNA合成を開始する短いRNAプライマーを合成します。DNAへの原核生物DnaG様プリマの結合は、特定のトリヌクレオチド認識配列で起こる。岡崎断片の形成において極めて重要な一歩です。DNAプリマゼのDNA認識配列を決定するために使用される従来の生化学的ツールは、限られた情報のみを提供します。ハイスループットマイクロアレイベースの結合アッセイと連続した生化学的分析を用いて、1)特定の結合コンテキスト(認識部位のフランク配列)がDNAプリマゼの結合強度に影響を及ぼすことが示された。DNA、および2)DNAへのプリマゼのより強い結合は、より長いRNAプライマーをもたらし、酵素のより高い処理性を示す。この方法は、PBMとプリマーゼ活性アッセイを組み合わせ、ハイスループットプリマーゼプロファイリング(HTPP)として指定されており、前例のない時間とスケーラビリティでDNAプリマーゼによる特異的配列認識の特性評価を可能にします。
概要
HTPPは、生化学的解析(図1)と組み合わせたDNA結合マイクロアレイ技術を利用して、DNAプリマゼの酵素活性に影響を与えるDNAテンプレートの特定の特徴を統計的に同定します。したがって、HTPPは、分野における知識の飛躍を促進する技術プラットフォームを提供します。霊長認識部位を決定するために使用される古典的なツールは、大量のデータを生成する機能を持っていませんが、HTPPはそうします。
PBMは、DNA1、2への転写因子の結合の好みを決定するために日常的に使用される技術である。しかし、DNAへのタンパク質の弱い/一過性結合の検出には適していません。8つの塩基対からなるすべての可能な配列に平均タンパク質結合特異性に関する情報を提供するユニバーサルPBMとは異なり、HTPPは、ユニークな配列要素を含む一本鎖DNAテンプレートのライブラリに基づいています。このようなDNA配列要素は、数万の短い(数十bp)ゲノム配列を含むだけでなく、異なる平均GC含有量を有するゲノム中に存在する特定のDNA反復配列要素に富む計算的に設計されたDNA配列を含む。.このようなハイスループットアプローチは、系統的、定量的、および仮説駆動的な方法で、プリマゼ結合およびその酵素活性3に....
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プロトコル
1. マイクロアレイの設計
注:DNAプローブは、2つの可変横面領域の間に位置するT7 DNAプリマーゼ(GTC)の認識部位からなるカスタム36ヌクレオチド配列を表し、続いてガラススライド3につながれた一定の24ヌクレオチド配列を示す。4 x 180,000 マイクロアレイ形式を使用し、スライド上でランダムに分散した 6 回の複製で各 DNA 配列をスポッティングすることを可能にしました。
-
既知の認識配列を持つプリマのDNAライブラリーの設計
- 各配列が60ヌクレオチドで構成されていることを確認します。最初の24ヌクレオチドを一定に保ちます(ガラススライドに取り付けられます)。可変領域は、次の一般的な形式を持つ必要があります: (N)16GTC(N)17;ここで、Nは任意の所望のヌクレオチドを表す。
- 特定の科学的な質問に対処するために側面領域を設計します (設計の例は、次のテキストで示されています)。側面領域は、繰り返し要素や特定の対称などの特定のフィーチャを含むように設計できます。
注:我々は、2つまたは3つの特定のヌクレオチドからなる異なる側面配列の8つのカテゴリを作成しました:TとG(グループ1)。T と C (グループ 2);C と A (グループ 3);A と G (グループ....
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結果
プリマゼ結合部位をマッピングするためのこの技術進歩により、古典的なツールを使用して観察することは不可能ではないにしても困難なDNA結合特性の取得を可能にします。さらに重要なことは、HTPPは、プリマゼ結合部位の伝統的な理解の再検討を可能にする。具体的には、HTPPは既知の5'-GTC-3'認識配列に加えて結合特異性を明らかにし、T7 DNAプリマゼの機能活性の変化につながる。すなわち、配列の2つのグループが同定された:側面にT/Gを含む強結合DNA配列と側面にA/Gを含む弱結合配列(強結合テンプレート内のすべてのチミンはアデニンに置き換えられた)。その配列内に5'-GTC-3'が欠けていたDNAテンプレートへのプリマゼ結合は検出されなかった。
T/Gリッチな側面などの特定の特徴を含むプリマゼDNA認識部位は、プリマセDNA結合を最大10倍まで増加させ、驚くべきことに新たに形成されたRNAの長さも増加しました(図.......
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ディスカッション
このPBM法は転写因子の結合特性を調べるために広く用いられており、親和性の低いDNAに結合するDNAプリマーゼなどのDNA処理酵素にも適用できます。ただし、実験手順の特定の変更が必要です。マイクロアレイ実験には、DNAライブラリーの設計、チップの調製、タンパク質標的の結合、蛍光標識、およびスキャンといういくつかのステップが含まれます。洗剤を含む溶液を含む溶液を使用した長い洗浄は、結合の弱い/一時的なモードのためにDNAテンプレートからタンパク質の解離を引き起こすので、軽度の洗浄ステップが重要です。その他の重要なステップには、結合条件(例えば、緩衝組成物、共因子)および特定酵素ごとに最適化する必要があるインキュベーション時間が含まれる。
マイクロアレイから得られた結果は、生化学的アッセイで検証する必要があります。生化学アッセイはまた、DNA結合親和性と酵素活性/プロセス性との相関関係などのDNA処理酵素の興味深い特徴に関する洞察を提供します。HTPPにより、T7 DNAプリマゼの機能特性に対するDNA結合の効果を観察することができた。例えば、プリマーゼがDNAテンプレートに対して高い.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しない。
謝辞
本研究はイスラエル科学財団(助成第1023/18号)の支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 40% アクリルアミド-ビスアクリルアミド (19:1) 溶液 | メルク | 1006401000 | |
| 95% ホルムアミド | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-標識抗His 抗体 | Qiagen | 35310 | |
| 過硫酸アンモニウム (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | ||
| ホウ酸、顆粒 | グレンサムライフサイエンス | GE4425 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | ロシュ | 10735094001 | |
| モフェノールブルー | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNAマイクロアレイ | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com | |
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | Acros Organics AC118430010 | ||
| 富士フイルム FLA-5100 リン光像 | 富士フイルム ライフサイエンス | ||
| ガラススライド染色ラック | サーモサイエンティフィック | 12869995 | 複数のスライドを使用する場合 |
| ラボローテーター | Thermo Scientific | 88880025 | |
| 塩化マグネシウム | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| マイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバー | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| マイクロアレイスキャナー (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| グルタミン酸カリウム | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| 染色皿 | Thermo Scientific | ||
| テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) | バイオ・ラッド | 1610800 | |
| トリスベース (2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール) | シグマ・アルドリッチ | 93362-500G | |
| トリトン X-100 | グマ・アルドリッチ | X100-500ML | |
| トゥイーン-20 | シグマ・アルドリッチ | P9416-50ML | |
| 尿素 | シグマ・アルドリッチ | U6504-1KG | |
| キシレンシアノール | Alfa Aesar | B21530 |
参考文献
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L.
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再版と許可
