方法論記事

ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

DOI：

10.3791/59759

⸱

2019年7月22日

 , 
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

この記事について

サマリー

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細菌は、細菌間の競争に従事するための多様なメカニズムをコードします。ここでは、細菌単離物間の競合相互作用を特徴付け、それらが混合集団の空間構造にどのように影響するかを特徴付ける培養ベースのプロトコルを提示する。

要約

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この原稿は、2つの細菌集団間の競合相互作用を検出し特徴付けるための培養ベースのコインcubationアッセイについて説明する。この方法は、各集団の選択と視覚的判別のための明確な抗生物質耐性能力と蛍光タンパク質をそれぞれ差別化してタグ付けすることを可能にする安定したプラスミドを採用しています。ここでは、競合するビブリオ・フィシェリ株の調製とコインキュベーション、蛍光顕微鏡イメージング、および定量データ解析について説明する。このアプローチは簡単で、迅速な結果をもたらし、ある集団が別の集団の増殖を殺すか阻害するか、また、競合が拡散性分子を介して媒介されるか、または直接細胞間接触を必要とするかを決定するために使用することができます。各細菌集団は異なる蛍光タンパク質を発現するので、アッセイは混合コロニー内の競合する集団の空間的な判別を可能にする。記載された方法は、この種に最適化された条件を用いて共生細菌V.fischeriで行われるが、プロトコルは、ほとんどの培養可能な細菌単離物に適応することができる。

概要

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この原稿は、2つの細菌単離物が競合相互作用が可能であるかどうかを決定する培養ベースの方法を概説する。混合集団を研究する場合、細菌単離物がどの程度相互作用するか、特に分離分離が干渉メカニズムを介して直接競合しているかどうかを評価することが重要です。干渉競争とは、1 つの集団が直接成長を阻害したり、競合する集団1を殺したりする相互作用を指します。これらの相互作用は、微生物コミュニティの構造と機能2、3に大きな影響を及ぼす可能性があるため、識別することが重要です。

微生物競争のメカニズムは、宿主関連細菌と自由生殖細菌4、5、6、7、および両方を含む多様な環境からの細菌のゲノムで広く発見されている。 8,9.殺菌化学物質1、12、分泌抗菌ペプチド13などの拡散性メカニズムを含む様々な....

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プロトコル

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1. コインキューベーション用の菌株を準備する

  1. コインベキュートアッセイ中に細菌競争の標的となる適切な基準株を選択します。参照ひずみの選択時のベスト プラクティスと、参照ひずみが結果に与える影響については、「ディスカッション」を参照してください。このプロトコルでは、V.fischeri株ES114が基準株として機能する。
  2. コインの中の分離物を区別するために使用される選択およびスクリーニング方法を決定する
    1. 典型的には、異なる抗生物質耐性遺伝子(例えばカナマイシンまたはクロラムフェニコール)を含む安定したプラスミドを有する株を変換し、各株に対して選択するだけでなく、異なる蛍光タンパク質(例えばGFPまたはRFP)をコードする遺伝子を視覚的に変換する。共培養における歪みの種類を区別する。
      注:安定したプラスミドの使用は、株が選択の不在でプラスミドを失う場合、この株の数は定量時に過小評価され、蛍光顕微鏡を使用して視覚的に検出できないため必要です。
    2. タグコインキバテッドV.フィシェリ株は、緑色蛍光タンパク質(GFP)および抗生物質カナマイシン(Kan R)に対する耐性を発現するプラスミドpVSV102を含むような差別的に、第2株が含まれています。プラスミドpVSV208は、赤色蛍光タンパク質(d....

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結果

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細菌集団間の競合相互作用を評価するために、V.fischeri用に最適化されたコインcubationアッセイプロトコルが開発され、最適化された。この方法は、抗生物質耐性遺伝子および蛍光タンパク質をコードする安定したプラスミドを利用し、各株の差異選択および視覚的判別を可能にする。コインベーションアッセイから収集したデータを分析することで、相互作用の競合結果と相互作用のメカニズムを特定することができます。一例として、以下の実験は、V.フィシェリ単離物を用いて行った。コインキューバ行き株は、カナマイシン耐性およびGFP+を発現するpVSV102、またはクロラムフェニコール耐性およびDsRed+を発現するpVSV208の2つの安定なプラスミドのうちの1つを保有した。試料データでは、株を1:1比で混合し、LBS寒天プレート上で5時間インキュベートした。対照処理として、参照株の分化タグ付きバージョンを互いにコインキューバックスした。実験処置は、基準株(ハーピングpVSV102)および競合株1または競合株2(ハーピングpVSV208)のいずれかで行っ.......

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ディスカッション

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上記のコインcubationアッセイは、細菌間の競合を発見するための強力な方法を提供する。このアプローチは、V.fischeri分離と競争メカニズム19の特性特性間の特異的競争の同定を可能にした。記載された方法は海洋細菌V.フィシェリ用に最適化されたが、臨床および環境分離を含む他の細菌種に対応するように容易に改変することができる。競争メカニズムは、多くの場合、条件付きで規制されていることに注意することが重要です 5,6,23,24,25,26,27,

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、彼らの有用なフィードバックのためのレビュー担当者に感謝したいと思います。A.N.S.は、ライフサイエンス研究財団への助成金GBMF 255.03を通じてゴードンとベティムーア財団によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL 微量遠心チューブFisher05-408-129
10 μLマルチチャンネルピペット
100 μLマルチチャンネルピペット
300 μL マルチチャンネルピペット
10 μL シングルチャンネルピペット
20 μL シングルチャンネルピペット
200 μL シングルチャンネルピペット
1,000 μL シングルチャンネルピペット
24 ウェルプレートFisher07-200-84滅菌済み 蓋付き
96 ウェルプレートVWR10062-900滅菌済み 蓋付き
計算機
ChloramphenicolSigmaC0378ストック (20 mg/mL エタノール中); 培地中の最終濃度 (2 μ
カメラおよびイメージングソフトウェア
ForcepsFisher08-880
Kanamycin SulfateFisherBP906-5ストック (水中 100 mg/mL、フィルター滅菌); 培地中の最終濃度 (1 μg/mL LBS)
ニトロセルロースメンブレン (FS MCE, 25MM, NS)FisherSA1J788H50.22 μmニトロセルロース膜(100のpk)
ペトリプレートフィッシャーFB0875713蓋付き無菌
分光光度計
マイクロキュベットVWR97000-586
TipOne 0.1-10 μLスターターシステムUSAサイエンティフィック1111-350010ラックTipOne
200 μLスターターシステムUSA Scientific1111-50010ラック
TipOne 1000 μL スターター システムUSA Scientific1111-252010 ラック
Vortex
名前会社名カタログ番号コメント
LBS 培地
1 M トリス バッファー (pH ~7.5)50 mL 1 M ストックバッファー (62 mL HCl、938 mL DI 水、121 g Trizma Base)
寒天 TechnicalFisherDF0812-17-915 g (プレートのみ追加)
DI 水950 mL
塩化ナトリウムFisherS640-320 g
トリプトンフィッシャーBP9726510 g
酵母抽出物FisherBP9727-25 g
を備えた蛍光解剖顕微鏡半

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbi....

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