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方法論記事

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

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DOI:

10.3791/59760

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2020年3月10日

 ,  ,  , 
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky

この記事について

サマリー

円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。

要約

線形mRNAに加えて、多くの真核生物遺伝子は円形RNAを生成する。ほとんどの円形RNAは、5'スプライスサイトをmRNA前mRNA内の上流3'スプライスサイトと結合することによって生成されます。この循環は、スプライス部位を近接するmRNA前の二次構造によって助けとなる可能性が高い。ヒト遺伝子では、Alu元素が豊富であり、mRNA前に反対方向に存在する場合に塩基相補性を示すため、Alu元素はこれらの二次RNA構造を促進すると考えられている。ここでは、円形RNAを形成するレポーター遺伝子を含む大きなAlu要素の生成と解析について述べる。クローニングプロトコルの最適化により、最大20kbの挿入長を持つレポーター遺伝子を生成できます。共同トランスフェクション実験での分析により、調節因子の同定が可能になります。これにより、この方法は、円形RNA形成に関与するRNA配列および細胞成分を同定することができる。

概要

円形のRNA
円形RNA(circRNA)は、ほとんどの生物で発現される共有閉鎖単一鎖RNAである。これらは、ダウンストリームの 5' スプライス サイトをアップストリーム 3' スプライス サイトに結合することによって生成されます。30-40 ntと短い相補的な塩基を示すプレmRNA中の配列は、circRNA形成2のための適切なアライメントにバックスプライス部位を持ち込む。ヒトにおいて、Alu要素1は、ゲノム3の約11%を表し、自己相補性4、5によるmRNA前に広範な二本鎖RNA構造を形成し、circRNA1の形成を促進する。

現在、circRNAの3つの主要な機能が説明されている。いくつかのcircRNAはマイクロRNA(miRNA)を結合し、隔離を通じてmiRNAスポンジ6のように作用する。CircRNAは、転写および転写後の調節に関与しており、線形スプライシング7または転写因子活性の変調との競合を通じて8.最後に、circRNAは短いオープンリーディングフレームを含み、原理研究の証明は、それらが9、10を翻訳できることを示しています。しかし、ほとんどのcircRNAの機能は謎のままです。循環RNAの大部分は、次世代シーケンシング方法11を使用して検出された。標的RT-PCR法を用いた個々の遺伝子の詳細な分析により、多数の円形RNAが未発見のまま12が発見される。

レポーター遺伝子を用い、mRNA前処理を解析
細胞にトランスフェクトされたDNAレポーター構築物由来のmRNAの分析は、円形RNAに適用できる代替プレmRNAスプライシングを研究するための確立された方法です。一般に、代替エキソン、その周囲のイントロン、および構成エキソンは、真核生物発現ベクターに増幅およびクローン化される。多くの場合、イントロンは短くされます。この構成体は真核細胞にトランスフェクトされ、通常RT-PCR13,14によって分析される。このアプローチは、共トランスフェクション実験13、15、16、17、18における規制スプライス部位とトランス作用因子をマッピングするために広く使用されています。また、タンパク質発現ミニ遺伝子の生成により、代替スプライシングを変化させる物質のスクリーニングが可能な19,20.

このメソッドは、円形のRNAに適用されています。現在、少なくとも12個のミニジーン・バックボーンが文献に記載されており、表1に要約されている。tRNAベースの発現系21,22を除き、それらはすべてポリメラーゼIIプロモーターに依存する。ここでは、円形RNAの生成に関与するシスおよびトランス作用因子を決定するヒトレポーターミニ遺伝子を生成する方法について述べる。公開されたレポーター遺伝子23の配列を用いた方法の概要を図1に示す。

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プロトコル

1. 構造の設計

  1. UCSCゲノムブラウザ24を用いて、円形RNA形成に必要な反復的な要素を同定し、それらを構築物に組み込む。重要なことに、増幅用のプライマーは反復要素の外側にある必要があります。
  2. 円形RNA配列(補足図1は検査配列)をhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=startに貼り付け、適切な生物を選択します。シーケンスを送信し、ブラウザビューに移動し、1.5xまたは適切なズームアウト(図2A)。.
    注: 検索シーケンスは、一番上の行に表示されます (図 2A, 1)。円形RNAのエキソンの順序に応じて、BLATはすべてのエキソンを接続しません。この例では、エキソン12(図2A、4)は11(図2A、2、3)に接続されていない(図2A、2、3)、エキソン12が円形RNA配列内のエキソン11の上流であるため(補足図1)。繰り返し要素は、ボックスで示される「リピートマスマ」トラックにあり、黒から灰色の色は進化的保全を示しています(図2A,5)。
  3. 繰り返し要素の上にマウスを移動して、フローティング ウィンドウ内のサブタイプを識別します。Alu要素は、SINE(短絡核元素)ラインにあります。図 2とは異なる画像が得られた場合は、ウィンドウの下にある [既定のトラック] ボタンを使用して、ブラウザをリセットします。
    注:遺伝子ディスプレイのエキソンをモジュームすると、コンピュータで生成されたエキソン番号を持つウィンドウが生成されます。これらの数値は、文献で確立されたエキソン番号付けに対応せず、アイソフォーム間の変化にも対応していません。

2. エクスプレッションベクターでクローン化するシーケンスを選択します。

  1. UCSCゲノムブラウザの一番上の行にある「表示→DNA」に移動し、ウィンドウに表示されるDNA配列をダウンロードします。[シーケンス形式オプション] で、[大文字/小文字の拡大/色のオプション]を選択します。
  2. デフォルトのケースを[低い]として選択し、[NCBI refseq]のトグル ケースを選択します。[繰り返しマスカー] で [下線]、太字、斜体を選択します。[送信 ]をクリックします。大文字としてのエキソンと小さな文字としてイントロンがあります。エキソン/イントロンの境界線を確認してください。
  3. この例では、'ccctttacCTTTTT'シーケンスがあり、ブラウザが逆の補数を示していることを示しています。この場合は、戻って正しいエキソンイントロン境界(agEXONgt)が表示されるまで、逆補数ボックスを選択します。
  4. 正しい向きでファイルをコピーします(内部エキソンはイントロニックag..gt) をワープロ ドキュメントに入力し、exons を強調表示します (補足図 2)。
    注:この例では、エキソン9-12を包含するゲノム断片は約24kbであり、したがってゲノムDNAから増幅するには大きすぎます。したがって、約1kbのイントロニック領域で囲まれた各エキソンは個別に増幅され、これらの4つの断片はクローニングベクターで組み立てられる。
  5. 増幅するフラグメント(エキソン±500 ntイントロン)を選択します。これらの領域のプライマーは特定の配列を増幅しないので、イントロンが繰り返し領域で始まったり終わりないようにしてください。選択した領域を図 2Bに示し、それらのシーケンスを補足図 3に示します。
    注: 一般に、コンストラクトが大きいほど、複製は難しくなります。フラグメントは、ステップワイズ(すなわち、エキソン9がベクターと組み合わされ、次のステップでエキソン10がクローニングを介してこのコンストラクトに導入され、すべてのエポンが所定の位置に存在するまで)、または代替的に、すべての断片が同時に組み立てられる。段階的なアプローチは常に機能しますが、より多くの時間が必要です。同時アセンブリは必ずしも機能するとは限らず、個々の断片をゲノムDNAからどれだけ増幅できるか、そして構築物の全体的な大きさに依存します。したがって、通常は両方のアプローチを同時に開始します。

3. クローニング用のプライマーを設計する

  1. Web ツール (https://nebuilder.neb.com/#!/) を使用して、クローニング用のプライマーを設計します。例えば、このツールにフラグメント 9、10、11、および 12 とベクトルシーケンス (補足図 3) を入力します。
  2. ベクター配列については、挿入部位を最後のヌクレオチドとして追加し、その後にフラグメントを追加する。ベクトルの番号付けは特定の挿入部位から始まらないため、ベクトル内の挿入部位が位置し、下流の部分が上流のシーケンスの前に配置されます。この例では、挿入は HindIII [AAGCTT] サイトの直後に開始し、pcDNA3.1 の PmeI [GTTTAAAC] サイトの直後に終了します。cccgctgatcagからのシーケンス.ccgtaaaaaggccgcは、pcDNA3.1配列の位置1の前に貼り付けます(gttgctggcgttttttcc..
  3. 融点が4°C以上離れている場合は、増幅に効かないようにプライマーを調整します。設計されたフラグメントとプライマーシーケンスの組み立てを補足図4に示します。クローニング用プライマーは手動で25を設計することもできる。

4. PCRおよびアンプリコン検出

  1. 標準PCR反応:反応ごとに50μLの総体積の反応ミックスを作ります。以下は、ポリメラーゼ1を使用した1つの反応のレシピです。
    5x反応バッファーの10 μL
    1 μL の 10 mM dNTPs
    2.5 μL の 10 μM フォワードプライマー
    2.5 μL の 10 μM リバースプライマー
    0.5 μL の ポリメラーゼ 1
    ヌクレアーゼフリーH 2 Oの32.5μL
    1. オプションで、製品の GC 含有量が高い場合は、5x GC エンハンサーを 10 μL 追加します。PCR反応をテストするためにGCエンハンサーを含む別のミックスを作ります。
  2. アリコート49 μLの混合をPCRチューブに反応サンプルあたり。
  3. PCRに1μLのDNAを加え、その量は10pgから1ngの範囲である。
  4. サンプルをスピンダウンして、残渣を側面から取り除き、PCRマシンに入れます。PCR条件を最適化する場合は、同じマシンと同じスポットをマシン内で使用してください。

異なるポリメラーゼを用いるより長いDNA断片のための5つの最適化

  1. 温度
    1. 長距離ポリメラーゼ2を最適化します。
      1. 低い変性温度を使用してください(ポリメラーゼ1:98°C、ポリメラーゼ2:94°C)。
      2. より長い変性時間(ポリメラーゼ1:10 s、ポリメラーゼ2:30s)を使用してください。
      3. より長いアニーリング時間(ポリメラーゼ1:30s、ポリメラーゼ2:60s)を使用してください。
      4. 延長時間を長くする(ポリメラーゼ1:30 s/kb、ポリメラーゼ2:50 s/kb)。
      5. より低い延長温度を使用してください(ポリメラーゼ1:72°C、ポリメラーゼ2:65°C)。
      6. プライマーのTmより5°C以下のアニーリング温度を使用してください。
    2. プライマー濃度を最適化します(元のプライマー濃度より5倍から5倍多い)。10 pgから50 pg、100 pg、1 ng、5 ng、10 ngのDNA濃度を最適化します。
    3. ポリメラーゼ2を用いて15kbの製品サイズを増幅するPCRプログラムの例として、94°Cで30秒の初期変性を行い、94°Cで30秒で58°Cでアニールし、65°CでDNA拡張を12分30秒で行います。最終延長は65°Cで10分間、最終4°Cホールドで行います。
      注: 各ポリメラーゼに固有のウェブベースの温度計算によって決定されるプライマーに固有のアニーリング温度(Ta)。.フラグメントが 10 kb を超える場合は、拡張時間が異なり、最適化する必要があります。
  2. 延長時間とDNA濃度
    1. 6 kb 以上の DNA フラグメントの延長時間を長くする: 1 kb あたり 1 分。長い断片は、より少ないDNAを使用する必要があります。
    2. DNAの希釈を行い、増幅に最適なDNA濃度を求め、通常はプラスミドの場合は1pg〜1 ng、ゲノムDNAの場合は1 ng〜1 μgを求めます。
      注:ほとんどのクローニング使用ポリメラーゼ1では、Sso7d DNA結合ドメインを独自の耐熱性DNAポリメラーゼ26に融合させることにより設計された。ポリメラーゼはエラー率が低く、Sso7dドメインに高い加工性があるため、大きな(10〜15kb)のゲノム断片を増幅する必要があります。この大きなフラグメントサイズのため、この方法は制限酵素を必要としないため、DNA分子27の酵素集合体がベクターへの挿入に使用される。15 kb より長いフラグメントの増幅は、ポリメラーゼ 1 でますます困難になります。大きな断片増幅のためには、ピロコッカスから作られたポリメラーゼ2を使用する - Sso7dに融合したプルーフリーディングポリメラーゼや、より高い誤差率を与える長距離PCRキットのように。

6. クローニング用 PCR 製品の精製

  1. インターカレート核酸染色を含む1%アガロースゲル(例えば、1x GelGreen)上でPCR産物の半分を実行します。暗いリーダーのトランスイルミエーターで染色されたゲルを視覚化します。この染色されたDNAは、サイズに忠実ではありません。
    注:GelGreenは臭化エチジウムと同様にDNAにインターカレートしますが、DNAに損傷を与えない波長である500nm(シアン)前後の光によって励起され、クローニングが大幅に向上します。
  2. 並行して、PCR産物の半分を、臭化エチジウムで実行後に染色された1%ゲルで実行します(図3A,B)。
  3. 染色ゲルから適切なサイズの物品切れバンド(ステップ6.1)を、ゲルおよびPCRクリーンアップキットを用いてDNAを単離した。標準プロトコルからの偏差では、通常DNA濃度が低いため、二重蒸留水のわずか20μLでDNAを溶出します。
  4. クローニングする前に、アガロースゲル上の単離されたDNAの濃度と完全性を確認してください(図3B)。ベクトル比に対する 2:1 モル挿入を目指します。複数の挿入を使用する場合、比率は 2:2:2:1 です。

7. DNAアセンブリとクローン検出

注: クローン作成は、酵素的 DNA アセンブリ キットを使用して行われ、小さな変更が行われます。組み立ては50°Cで60分間行われ、一般にDNAの低い範囲はアセンブリ(20-100 fmol/20 μL反応)に使用されます。全体の反応ミックスは、化学能力のある細胞に追加され、全体の細胞は、6 cm寒天プレートにメッキアウト。

  1. ベクトルを組み合わせ、10 μLの水に1:2モル比(それぞれ20~500 fmol)を挿入します。
  2. 10 μLのDNAアセンブリマスターミックスを追加します。
  3. 50°Cでサンプルを60分間インキュベートする。
  4. 次に、総組立反応で有能な細胞を変換します。ここで、より短い構成体のために大腸菌株1細胞を使用するか、または大腸菌株2細胞を長くまたは不安定な構成のために使用する。セルは50μLの体積に収める必要があります。
  5. 氷上の細胞を解凍し、冷却された組み立て製品の2μLを有能な細胞に加えます。チューブを4~5回軽くフリックして混ぜます。渦を出さないで下ろしてください。
  6. 混合物を氷の上に30分間座らせます。
  7. 42°Cで30sの熱ショック。混ぜないでください。
  8. チューブを氷に戻して2分間移動します。
  9. 950 μLの室温 SOC メディアをチューブに追加します。
  10. 反応管を37°Cで60分間インキュベートし、激しく振る(300rpm)。
  11. 37°Cでのインキュベーション中に適切な抗生物質を用いて温かい選択プレート。
  12. 遠心分離(10,000 x g、30 s)を介して細胞をペレットし、2つの選択プレート上の細胞の1/4および3/4をプレートアウトし、一晩で37°Cでインキュベートします。

8. クローンの検証

  1. コロニーPCRを使用し、アセンブリ部位(図1C)にまたがるPCRプライマーを用いて検出します。
  2. 滅菌爪楊枝を取り、単一の細菌コロニーに触れる。
  3. コロニーを持つ爪楊枝でPCRチューブの底部をタッチし、抗生物質寒天プレートに爪楊枝をストリークし、一晩敏感な構造のために37°Cまたは室温でストリークプレートをインキュベートします。
  4. 検出プライマーを含む PCR ミックスで、コロニーに触れた PCR チューブをオーバーレイします。これらはプライマー 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) を使用して設計されています。プログラムには、アセンブリジャンクションを越えてプライマーを選択するために「[ccc]」記号を使用して、定義されたシーケンス全体にプライマー設計を強制するオプションがあります。陽性株からのDNAは、シーケンシングによって単離され、検証される。

9. レポーター遺伝子を発現する環状RNAの解析

  1. 分析のために、レポーター遺伝子を真核細胞にトランスフェクトする。ここで、HEK293細胞(ATTC#CRL-1573)を用いて、高いトランスフェクション効率を与える。コストを節約するには、PEI(ポリエチレンイミン)溶液を使用してください。
  2. PEI溶液の場合は、1mg/mLの低pH、pH2で、リニアポリエチレンイミン塩酸塩(PEI)を水に溶解します。NaOH で pH を 7 に持ち出します。0.22 μmフィルターを使用した滅菌フィルターを4°Cで保存します。
  3. 細胞を6つのウェル(ウェルあたり約150,000個の細胞)に分割し、DMEM培地の10%FBSで一晩成長させます。
  4. アリコート1μgのレポーター遺伝子を無菌チューブに入れ、200μLの無菌濾過150mM NaClを加える。渦をかいてDNAと混ぜる。
  5. このミックスと渦にPEI溶液を追加し、チューブの底部でサンプルを収集するために簡単に遠心分離機。PEIの3 μLあたり1μgのDNAの比率を使用してください。
  6. 室温で10分間インキュベートし、HEK 293細胞に直接加えます。
  7. HEK293細胞を37°C、5%CO2でインキュベートし、一晩で培養する。
  8. RNA分離キットを介してRT-PCR用のRNAを分離します。

10. リニアRNAを除去するRNase R治療

  1. RNaseフリーチューブ内の総RNAの10 μgを使用してください。
  2. 10 x RNase R バッファー (0.2 M トリス-HCl (pH 8.0)、1 M KCl、1 mM MgCl2)の 10 μL を RNA に加えます。
  3. RNAにRNase Rを加えます(1 μl = 20U)。
  4. RNAに1μLのグリコールブルーを加え、滅菌水で最大100μLまでボリュームを持たします。
  5. 37°Cで30分間インキュベートします。
  6. フェノール/クロロホルムを100μL、渦を1分間加えます。
  7. 遠心分離機 21,000 x gで 1 分ごとにフェーズを分離します。
  8. 上清(水相)を取り、1ボリューム(クロロホルム約80μL)を加えます。
  9. ボルテックスを1分間、遠心分離して1分間、相を分離する。
  10. 上清を取り、1:10ボルKAcと2.5ボルエタノールを加え、1-4 h.遠心分離機で-20°Cで30分間全速速度(21,000 x g)を降ろします。下部に小さな青いペレットがあります。
  11. 上清を取り除き、80%エタノールで洗います。空気を室温で5分間乾燥させ、10μLの水に溶かします。

11. RT-PCR分析

  1. RT反応あたり1μgのRNAを使用してください。
  2. 反応1回あたり20μLの最終総容積のために反応ミックスを作ります。1つの反応に対して、10 mM dNTPの1μL、0.1 Mジチオスレイトール(DTT)の1μL、5xファースト・ストランド・バッファーの4μL、および0.5μLの逆転写酵素を使用してください。
  3. アリコート 6.5 μL の反応は新しい PCR チューブに混入します。
  4. 1つのミックスで5プライマーまで混ぜます。ただし、PCR の他のプライマーと誤ってペアリングされるプライマーもあります (図 5)。プライマーシーケンスは、表 2にあります。遺伝子特異的なエキソン接合プライマーを日常的に使用していますが、ランダムな六角形によるプライミングも可能です。
  5. 目的のRT反応管に10μMリバースプライマーの1μLを加えます。
  6. PCR反応チューブに1μgのRNAを加えます。
  7. RNaseフリーH2Oを合計20μLまで追加します。
  8. チューブをスピンダウンしてチューブの側面の残留物を取り除き、サーモサイクラーに入れます。
  9. サーモサイクラーでRT反応を50°Cで50分間実行します。
  10. RT cDNAを-20°Cに保存するか、PCR反応に進みます。

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結果

レポーター遺伝子は、円形RNA形成に影響を与える調節因子の決定を可能にする。しかし、これらのレポーター遺伝子は大きく、DNA構築を不安定にすることが多い反復的な要素を含んでいます。大きなサイズのため、エキソンを含むゲノム部分と小さな横向きのイントロニック部品を増幅することによって達成されるイントロンの一部を削除することがしばしば必要です。これらのDNA片は酵素的に組み立てられ、制限酵素なしで構築することができます。

微小管関連タンパク質タウ(MAPT)から生成された円形RNAの例は、円形RNAを分析するためのミニジーンアプローチの応用を示す。この例で使用したtau 9→12ミニジーンを異なるスプライシング因子で共にトランスフェクションし、これらのスプライシング因子の効果をRT-PCRで検出した(図6)。異なるトランス作用因子は、円形RNAと線形プレmRNA形成の両方に影響を与えます。実験はまた、円形RNA形成に必要なすべての配列要素がクローン化された断片に局在していることを示している。

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ディスカッション

一般に、円形RNAは、その機能と形成の研究を複雑にする1の豊富な低い存在です。リニアRNA13と同様に、レポーターミニ遺伝子を使用することで、円形RNAの形成を調節するシスおよびトランス作用因子の同定が可能となる。したがって、このアプローチは、内因性遺伝子を用いてさらに試験することができる仮説を生成する。

最も重要なステップは、レポーター遺伝子の設計です。DNA断片の酵素的集合体(「ギブソンクローニング」27)は、制限部位から独立した大規模なレポーター遺伝子の構築を可能にするため、この設計を容易にする。

バックスプライシング部位は、レポーター遺伝子構築で考慮されるべき横向きの反転繰り返しを通じてまとめられる。繰り返しはゲノムブラウザの「リピートトラック」にアコードされ、それらを選択するとその向きを示します。タンパク質はまた、円RNA発現28

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

この作業は、国防総省 DoD 助成金 AZ180075 によってサポートされました。ステファン・スタムはジャクリーン・ヌーナン基金に感謝します。アンナ・パウエルは、ドイツの学術交流プログラムであるDAADの支援を受け、ジャスティン・R・ウェルデンはケンタッキー大学マックス・ステックラー賞を受賞しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(PEI) 塩酸塩Polysciences24765-1
ビルダー ツールNEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.クレア・ケミカル・リサーチ
酵素DNAアセンブリキットNEBE2621S
ゲルおよびPCRクリーンアップキットプロメガA9282
グリコブルーサーモフィッシャーAM9516
pcDNA3.1 クローニング部位ポリクローニング部位https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
ポリメラーゼ 1NEBM0491LQ5 DNA ポリメラ
ーゼ ポリメラーゼ 2Biorad1725310長距離ポリメラーゼ (NEB)、iproof (BioRad)
ポリメラーゼ 2Qiagen206402Qiagen 長距離ポリメラーゼキット
逆転写酵素サーモフィッシャー18080044
RNA単離キットLife Technologies12183025Ambion by Life Technologies
RNAse RLucigenRNR07250Epicenter/Lucigen
安定コンピテントセルNEBC3040HNEB 安定細胞
スタンダードクローニング細菌NEBC2988JNEB5-alpha プライ
マーを設計するためのNEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
>Web ベースの温度計算NEBhttps://tmcalculator.neb.com/#!/main
コンピテントウェブツール

参考文献

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