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方法論記事

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

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DOI：

10.3791/59800

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2019年8月31日

 ,  ,  ,  , 
1Organic and Medicinal Chemistry Division, CSIR-Indian Institute of Chemical Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

この記事について

サマリー

ここに提示されるのは、高密度めっきニューロンから神経前駆細胞に濃縮された神経球の自発的生成のためのプロトコルである。同じ実験の間に、ニューロンが低密度でめっきされるとき、プロトコルはまた、長期の一次ラットニューロン培養をもたらす。

要約

一次ニューロン培養は神経科学の分野で不可欠な技術です。脳に深い機械的洞察を得るためには、様々な神経生物学の研究に利用できる堅牢なインビトロモデルを持つことが不可欠です。一次ニューロン培養(すなわち、長期的な海馬培養)は、科学者にモデルを提供してきましたが、脳ネットワークの複雑さを完全に表しているわけではありません。これらの制限をきっかけに、脳組織に近い神経球を用いた新しいモデルが出現した。本プロトコルは、胚の胚から分離された皮質ニューロンと海馬ニューロンの高密度および低密度のめっきを記述する14-16スプラーグドーリーラットである。これにより、神経圏および長期の一次ニューロン培養の生成を2つの独立したプラットフォームとして、さらなる研究を行うことが可能となる。このプロセスは、ニューロン培養に不可欠と考えられていたいくつかのステップと試薬を最小限に抑えるため、非常にシンプルで費用対効果が高い。これは達成可能な結果で行うことができ、さらに神経科学に関連する研究の多様性のために使用することができる最小限の要件で堅牢なプロトコルです。

概要

脳は、神経細胞と非神経細胞の複雑な回路です。何年もの間、科学者たちはこの複雑な機械に関する洞察を得ようとしてきた。そのために、神経科学者は当初、調査のために様々な形質転換神経系細胞株に頼った。しかし、これらのクローン細胞株が強いシナプス結合および適切な軸線またはデンドライトを形成できないことは、科学的関心を一次ニューロン培養1、2にシフトさせた。一次ニューロン培養の最もエキサイティングな側面は、生きているニューロン3を観察し、操作する機会を作り出すことです。また、神経組織に比べて複雑性が低いため、様々な神経タンパク質の機能や輸送を研究するのに理想的な候補です。近年、顕微鏡、ゲノミクス、プロテオミクスの分野でいくつかの発展が起きており、神経科学者がニューロン培養を利用する新たな機会を生み出しています4。

一次培養により、神経科学者は神経発達の背後にある分子機構を探索し、様々な神経シグナル伝達経路を解析し、シナプスのより一貫した理解を開発することができました。多くの方法が一次ニューロン(主に海馬起源5、6、7から)からの培養を報告しているが、ニューロンの長期培養を可能にする化学的に定義された媒体を持つ統一プロトコルは、まだ必要です。しかし、低密度でめっきされたニューロンは、最も頻繁に観察され、これは長期的に生き残るものではなく、隣接するニューロンおよびグリア細胞によって提供される栄養支持体8の欠如に起因する可能性が高い。いくつかの方法は、グリア細胞とグリア細胞との一次ニューロンの共培養を示唆しています, ここでグリア細胞は、フィーダー層9として使用されています.しかし、グリア細胞は過剰増殖に起因する多くの問題を提起し、時には神経成長10を上書きする。したがって、上記の問題を考慮すると、より簡単で費用対効果の高い一次神経培養プロトコルが必要であり、これは神経生物学者と神経化学者の両方が調査に使用することができる。

一次ニューロン培養は本質的に2D培養の一形態であり、脳の可塑性、空間的完全性、または不均一性を表すものではありません。これは、神経球11、12と呼ばれるより信じられる3Dモデルの必要性を生み出しました。神経球は、生体内脳13において、実際に類似した新しいプラットフォームを神経科学者に提示する。神経球は、神経幹細胞(NSC)、神経前駆細胞(NPC)、ニューロン、および星状細胞が豊富な細胞の非付着性3Dクラスターです。それらは神経幹細胞および神経前駆細胞の単離のための優秀な源であり、様々な神経系および非神経系統への分化を研究するために使用することができる。繰り返しになりますが、以前に報告されたプロトコルを用いて産生される神経球培養内の変動性は、統一された神経球培養プロトコル14の定式化に対する障壁を提示する。

この原稿は、混合皮質および海馬培養から細胞めっき密度を交互にすることによって、2Dおよび3Dプラットフォームの両方を生成することができるプロトコルを提示する。自由浮遊神経球は、E14-E16スプラーグドーリーラット胚から単離された高密度めっきニューロンから7日以内に得られ、さらなる培養時に、放射状グリア状の拡張を介してブリッジと相互接続を形成する。同様に、低密度めっきニューロンでは、週2回維持培地を変更して最大30日間維持できる一次ニューロン培養が得られる。

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プロトコル

動物に関するすべての実験手順は、CSIR-インド化学生物学研究所の機関動物倫理委員会(IICB/AEC/ミーティング/2018/1)によって承認されました。

1. 試薬およびメディアの準備

  1. ポリD-リジン(PDL)溶液:脱イオン水中で0.1mg/mLの濃度でPDL溶液を調製し、使用するまで4°Cに保存します。
  2. 解離培地:無菌、濾過脱イオン水の1Lに、塩化ナトリウム(8mg/mL)、塩化カリウム(0.4mg/mL)、リン酸カリウムモノベーシック(0.06mg/mL)、D-グルコース(1mg/mL)、各濃度で以下の成分を組み合わせます。リン酸ナトリウムジビ塩(0.479mg/mL)、および1M HEPES[4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸;10mM]。適切な混合を助け、使用するまで4°Cに貯えるためにすべての成分を渦。
    注:解離時は氷冷状で、洗濯やその他の目的で室温(RT)で解離剤を使用してください。
  3. めっき媒体:めっき媒体は、アールのバランス塩溶液(BSS;88.4%)、D-グルコース(0.6%)、馬血清(10%)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)を使用した最小必須培地(MEM)イーグルの最小必須培地(MEM)で構成されています。それぞれの比率でコンポーネントを組み合わせ、無菌条件下でフード内部の手順を実行します。
    注:常に任意のコンポーネントの劣化を避けるために、新鮮なめっき媒体を使用してください。
  4. 維持培地:ニューロベースル培地(97%)、市販のグルタミン試料0.5mM、B27無血清サプリメント(2%)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)を組み合わせて維持培地を調製する。それぞれの比率でコンポーネントを組み合わせ、無菌条件下でフード内部の手順を実行します。すべてのコンポーネントが準備されていることを確認します。

2. カバースリップの準備

  1. 直径12mmの丸いガラスカバーを取り、1M塩酸(HCl)に4時間浸します。
  2. 鉗子のペアを使用して蒸留水でカバーリップを転送し、完全に酸を取り除くために穏やかにそれを旋回します。
  3. 100%エタノールを含むビーカーで洗浄の追加ラウンドのために洗浄されたカバーリップを転送します。
  4. カバースリップを使用する前に、ティッシュペーパーの上にそれらを維持することにより、層フードでよくそれらを乾燥させます。

3. ニューロン培養用ポリD-リジンコーティングプレートの調製

  1. 2つの24のウェルプレートを取る:高密度めっきのための1つと低密度めっきのための別の。無菌パケットは、層フードの内側でのみ開きます。
  2. 24ウェルプレートに生殖不能ガラスカバーの12ミリメートルを転送します。
  3. 300 μL の PDL 溶液(脱イオン水中 0.1 mg/mL)を各井戸に注ぎ、カバースリップの表面を完全に覆います。
  4. プレートをアルミホイルで包み、乾燥を防ぎ、CO2インキュベーターに一晩保管します。
  5. 翌日(めっき前)、PDL溶液を吸引し、300μLの無菌脱イオン水を2~3回適切に洗浄します。
  6. 新たに調製しためっき媒体を200μL加え、めっきまでインキュベーターに戻します。

4. 胎児の除去と切断

注:121 °C(15 psi)でアルミホイルに詰め込まれたすべての手術器具を30分間殺菌します。これには、鈍い端のはさみ、鉗子、細かい鉗子、2つの細かいはさみ、およびプロシージャ全体のための1つの動脈鉗子のペアが含まれる。

  1. ニューロンと神経球を生成するために, 時間妊娠スプラーグドーリーラットを使用し、E0として膣プラグ検出で一日をマーク.
    注: カルチャは E14-E16 の間で実行する必要があります。
  2. 培養の日に、無菌のガラスペトリプレートを氷の上に置き、冷たいハンクのバランス塩溶液(HBSS)でそれを埋めます。
  3. 体重90mgケタミン/kgの経皮内注射(i.p.)と10mgキシラジン/kgの注射でE14-E16妊娠中のラットを麻酔し、子宮頸部脱臼を行って犠牲にする。
    注:ラットはまた、ペントバルビタールの過剰摂取またはキシラジンまたはジアゼパムとケタミンの過剰摂取によって安楽死させることができる。
  4. 70%のエタノールを噴霧してダムの腹部を殺菌し、無菌鉗子と鈍い端のはさみを使用して腹部のV字型のカットを作ります。
  5. 冷たいHBSS溶液でペトリプレート上の胚嚢を慎重に取ります。
    注:これは内臓を汚染するので、皮膚に使用されたのと同じ鉗子やはさみを使用しないでください。内臓には異なるハサミ/鉗子を使用してください。
  6. 胚嚢から新鮮で冷たいHBSSで胚を取り出す。
  7. 生殖不能のはさみで頭を切り落とす。

5. 海馬による脳の除去と皮質の解剖

  1. 開始する前に、冷たい、無菌HBSSで90ミリメートルの生殖不能ペトリ皿を埋めます。
  2. 無菌の鈍い終わりのドレッシング鉗子を使用して無菌の皿の頭部を移す。
  3. 立体顕微鏡の下で、無菌の皮切り鉗子でスナ産領域から頭部を保持し、皮膚と頭蓋骨を開いて切断することによって脳を取り除く。
  4. HBSS溶液中で同じ方法ですべての胚脳を収集します。
  5. 脳幹を保持することにより、半球と中脳からすべての髄膜を削除します。
  6. 海馬と皮質を含むキノコキャップに似た無傷の半球を慎重に取り除きます。
  7. 10 mLの解離培地を含む15mLの円錐管に皮質と無傷の海馬を含む半球を集める。

6. 皮質組織と海馬組織を単一ニューロンに解離する

  1. 収集した組織が落ち着き、解離培地を吸引し、5%-10%の培地を残します。
  2. 組織に新鮮な解離培地の10 mLを追加し、ステップ6.1を2回繰り返します。
  3. 解離培地の4.5mLと0.25%(1x)トリプシンEDTA(エチレンジアミン四酢酸エチレン)溶液の0.5mLを加えます。
  4. 消化が進むまで20分間、インキュベーター内の組織を37°Cに保ちます。
  5. 培地を吸引し、消化組織に連続的に解離およびめっき媒体の10 mLを追加します。
  6. 消化された組織が落ち着き、解離媒体を吸引できるようにします。めっき媒体の2.5 mLを追加し、90ミリメートルの滅菌皿のベースに注ぎます。
  7. 1,000 μLピペット先端を使用して、皿の角ベースで消化された組織をトリチュレートし、最小限の体積を占めます。
  8. 組織の任意のチャンクを除く70 μm細胞ストレーナーを通して得られた細胞懸濁液を渡す。
  9. トリパン青色色素排除法を使用して生存可能な細胞の密度を決定し、自動セルカウンタ内のセル数をカウントします。
    1. トリパン青色色素排除法の場合は、セル懸濁液の10μLと0.4%トライパンブルーステインの10μLを取り、完全に混合し、使い捨て室スライドの2つの密閉室のいずれかに混合物の10 μLを追加します。
    2. 混合物を含むスライドをセルカウンタに挿入し、読み取りを取得します。
      注:トリパン青色染料除外法は、生細胞(その無傷の膜による)がトリパン青色染料を除外し、したがって、簡単にトリパンブルーを取り上げ、青色に見える非実行可能な細胞と比較して、明確な細胞質を示す原理に基づいています。色15.
  10. プレートに得られた細胞数を希釈する 1.5 x 105セル/mL 高密度および 20,000 セル/mL 低密度の 20,000 セル/mL を、各めっき媒体を含む 2 つの別々のチューブで低密度にします。
  11. 各ウェルから以前に添加しためっき媒体を吸引し、各ウェルにめっき媒体に分散した細胞の500μLをプレート化する。
  12. その後、プレートを37°Cでインキュベーターに戻し、5%CO2を4時間返す。
  13. めっき後4時間の顕微鏡下で細胞の付着を調べる。
  14. 両方のプレートに細胞が適切に付着している場合は、各ウェルの培地を500μLの新鮮なメンテナンス培地で交換し、37°Cでインキュベートします。
  15. これらのニューロンを1週間に2倍の維持培地を変化させたりして30日間低密度で培養した。
  16. 超低アタッチメントプレートに転写して同じ維持培地中の高密度めっきニューロンから得られた神経球を培養する。
  17. 重要なマーカーでそれらを免疫染色することにより、ニューロンと神経球を特徴付け.免疫細胞化学の場合は、まずプレート自体に4%ホルムアルデヒドを使用して細胞/神経球を30分間固定し、次に0.1%の非イオン性洗剤で細胞を10分間透過させます。
  18. リン酸緩衝生理食塩分(PBS)にニューロン(抗Tuj1、GFAP、O4、タウ)と神経球(抗ネスチン、GFAP、Tuj1)の両方に一次抗体を加え、4°C16で一晩インキュベートする。
    注:Tuj1(クラスIIIβ-チューブリン)およびタウは一次ニューロンに対する正のマーカーであり、GFAP(グリア線維性酸性タンパク質)およびO4(オリゴデンドロサイトマーカー)は原発ニューロン17、18に対する陰性マーカーである。神経球の場合、Tuj1、GFAP、およびネスチンはすべて正のマーカー19,20として機能します。
  19. 翌日、PBSで細胞を1~2回洗浄し、2時間RTで1:600濃度でPBSに適切な二次抗体を添加する。
    注:抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体は、添加された一次抗体の宿主種に応じて選択される。二次抗体は、蛍光顕微鏡の目的に適した蛍光誘導体に結合する必要があることを心に留めておく必要があります。
  20. PBSで再度細胞を1~2回洗います。
    1. Hoechst 33258(脱イオン水中の1mg/mLストック溶液)で細胞の核染色を行う。ストック溶液からPBSで0.1%のホエヒト溶液を準備し、細胞に追加します。
    2. 0.1%のホエヒト溶液で細胞を30分間インキュベートし、PBSで再び洗浄する。
  21. スライドに20 μL PBS(または取り付け媒体)を追加し、PBSを含むスライドの領域に染色されたセルを含むカバースリップをゆっくりと取り付けます。カバースリップの余白をジブチルフタレートポリスチレンキシレン(DPX)でシールします。
  22. 10倍と40倍の倍率で顕微鏡下で固定細胞のイメージングを行います。

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結果

このプロトコルでは、2つの異なる神経スクリーニングプラットフォームから可変細胞めっき密度が得られるという簡単な戦略が解明されている。図1Aは、Bがそれぞれ高密度及び低密度メッキ細胞におけるニューロンをめっきした4時間後の細胞の付着を示す。図1に示すようにニューロンの適切な付着を観察すると、めっき培地を各ウェルのメンテナンス培地に置き換え、それによって37°Cでインキュベーターに戻した。高密度めっきニューロンでは比較的多くの細胞接着が認められた。めっきの24時間後、高密度メッキニューロンと低密度メッキニューロンの両方が精巧なニューロン拡張およびシナプス相互接続を示し、図2A、Bの差動干渉コントラスト(DIC)画像で観察された。

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ディスカッション

このプロトコルは、一次ニューロンの細胞めっき密度を変化させ、2つの可変ニューロンプラットフォームが得られる方法を説明する。これは簡単な方法ですが、目的の結果を得るには、各ステップを細心の注意を払って実行する必要があります。他の以前の方法は、長期の一次ニューロン培養または神経球培養を報告しています。.ほとんどの一次ニューロン培養プロトコルは、3〜5週間海馬ニューロンの培養に関与しているが、ほとんどのニューロンが死亡し、接続の損失のために枯れるにつれて、ほとんどが失敗している。プロトコルのもう一つの利点は、ニューロンが任意のグリアフィーダー層を必要とせずに培養することができ、したがって、ニューロンの純度を維持することができることです。

ただし、目的の結果を得るには、いくつかの重要な手順を慎重に実行する必要があります。第一に、無菌状態を全面的に維持することが絶対に必要です。始める前に、ラミネートフードのほとんどのステップを実行するだけでなく、すべてのスラブ、器具、および外科用具を70%アルコールで事前に洗浄することをお勧めします。それ以外の場合は、細菌や真菌による汚染による故障の可能性が...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

CSIR-IICB動物施設に感謝します。G. D. 感謝 ICMR, J. K. と V. G. DST インスパイアに感謝し、D. M. 彼らのフェローシップのために DBT に感謝します。S.G.は、インドのSERB(EMR/2015/002230)が財政支援を行った場合に認める。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アンチGFAPAbcamAB7260
アンチネスティンアブカムAB92391
アンチ O4ミリポアMAB345
アンチタウアブカムAB76128
アンチ Tuj1ミリポアMAB1637
B27 セラム フリー サプリメント Gibco17504-044
Cell CounterLife technologiesCountess II FL
CO2 IncubatorEppendorfGalaxy 170 R
D-グルコース SDFCL38450-K05
エタノールメルク ミリポア100983
蛍光顕微鏡オリンパスIX83 モデル
ホルムアルデヒドSigma Aldrich47608
GlutaMax-I SupplementGibco35050-061
GtXMs IgG FluorMilliporeAP1814
GtXMs IgG (H+L)ミリポアAP124C
HEPESSRL16826
Hoechst 33258Calbiochem382061
Horse Serum HiMediaRM10674
塩酸ランケムH0100
層流フードBioBaseBBS-V1800
MEM Eagle'アールとsのBSS シグマ アルドリッチM-2279
顕微鏡DewinterVictory Model
Neurobasal Medium Gibco21103-049
プラスチック製品 (24 ウェルプレート、セルストレーナー、低接着プレート)BD Falcon353047, 352350 and 3471
90 mm PetridishHimediaPW001
Penicillin/Streptomycin Gibco15140-122
ポリ-D-リジンミリポアA.003.E
塩化カリウム フィッシャーサイエンティフィックBP366-500
リン酸カリウム一塩基性 メルクMI6M562401
塩化ナトリウム Qualigem15918
リン酸二塩基酸ナトリウム メルクMI6M562328
ステレオマイクロソープDewinterZoomstar モデル
Triton-X 100SRL2020130
トリパン ブルー ソリューションGibco15250-061
0.25 % トリプシン EDTAGibco25200-072

参考文献

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