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方法論記事

マウスの血液からの血小板の浄化

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DOI：

10.3791/59803

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2019年5月7日

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1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、抗凝固剤の存在下でマウス血液を採取した。血小板は、低速遠心分離を用いてイオヘキソール勾配培地によって精製した。血小板は、実行可能であるかどうかを調査するためにトロンビンで活性化された.精製された血小板の質を、フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査によって分析した。

要約

血小板は、赤血球 (RBC)、白血球 (WBC)、および血漿タンパク質から自由でなければならない彼らの機能特性を、研究するために全血から精製されます。ここでは、血液サンプル量に対して3倍以上のイオヘキソール勾配培地を用いてマウス血液からの血小板の精製と、20° c で20分間 400 x gの揺動バケットローターでの遠心分離について述べる。精製された血小板の回収/収率は 18.2 ~ 38.5% であり、精製された血小板は安静状態であり、膨大な数の RBC および WBC が含まれていなかった。トロンビンで処理された精製血小板は、93% の活性化を示し、その生存率を示した。我々は、精製血小板が流動サイトメトリーと顕微鏡評価を用いて十分に純粋であることを確認した。これらの血小板は、遺伝子発現、活性化、顆粒放出、凝集、および接着アッセイに使用することができます。この方法は、同様に他の種の血液からの血小板の精製に使用することができます.

概要

血小板は、血管の損傷に反応して血液凝固の開始剤として機能する血液の成分である。彼らは血管壁1をふさぐために傷害の部位に集まる。血小板は、トロンボポエチンの影響下で骨髄の巨核球に由来する細胞質の anucleate の断片であり、循環2に入ります。それらは、血小板拡散、凝集、および止血プラグ形成1,3をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することによって、細胞外環境を感知することができる代謝的活性および検出可能であると考えられる。止血/血栓および創傷治癒4のほかに、血小板は宿主の炎症反応、血管新生、および転移3、5、6、7において重要な役割を果たし、8.

血小板は、血液から精製され、その生化学的および生理的性質を研究するために、他の血液成分から遊離されるべきである。赤血球 (RBC) および白血球 (白血球) が血小板9,10よりもかなり多くの RNA およびタンパク質を含むので、これらの細胞の数が少ないとしても、RNA のトランスクリプトームデータおよびプロテオーム解析を妨げる可能性があるおよび血小板由来のタンパク質があげられる。我々は、GPIIb/IIIa (JON/A) および抗 P-セレクチンのような、全血小板よりも効率的に、トロンビンで活性化される精製された血小板が、抗------のように結合した抗体を見つけた。

血小板は脆弱であるため、サンプルをできるだけ軽度に処理することが重要です。血小板が活性化されれば、それらは顆粒の内容物を放出し、最終的には分解する。したがって、血小板の機能的性質をそのまま維持するためには、単離時に血小板静止を維持することが重要である。いくつかのプロトコールは、ヒト、イヌ、ラット、および非ヒト霊長類からの血小板の分離を種々の方法1、10、11、12によって説明している。いくつかの方法は、遠心分離による多血小板血漿の収集、セパレーションカラムによる濾過、磁気ビーズに結合した RBC および WBC 特異的抗体を用いた血小板の陰性選択などの複数のステップを必要とする。時間がかかり、血小板とその内容が低下することがあります。

フォードと彼の同僚は、イオヘキソール培地11を用いてヒト血液から血小板精製を説明した。この方法は、精製中の血液サンプルおよび培地の同様の体積を使用する。ヒトはより多量の血液を産出するので、比較的簡単に血小板を浄化することができる。

イオヘキソールは、水に自由に可溶性であり、核酸、タンパク質、多糖類、および nucleoproteins13,14の分別に使用される普遍的な密度勾配不活性培地である。それは低オスモル濃度を有し、非毒性であり、したがって、無傷の生きた細胞11の精製のための理想的な媒体となっている。それは非微粒子媒体である;したがって、勾配内の細胞の分布は、血球計数器、フローサイトメーター、または分光光度計を使用して決定することができる。それは、希釈後の細胞または細胞片の酵素または化学反応の大部分を妨げるものではない。

マウスは多くの人間の病気15、16、17、18のための重要な動物モデルとして役立つ。マウスの血小板19,20の浄化を説明するいくつかの公開された記事があります。しかし、マウスは比較的少量の血液を生成するため、血小板の浄化が困難になります。同じ少量の勾配培地および血液サンプルが使用される場合、血小板層は、遠心分離後に RBC − WBC 層から明確に分離することができない。本稿では、血液サンプル量と低速遠心分離に対して3倍以上のイオヘキソール勾配培地を用いたマウス血小板精製の迅速かつ簡便な方法について説明した。我々はまた、トロンビンで精製された血小板を活性化し、フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査でその品質を調べた。

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プロトコル

マウスの血液収集は、適切な機関の動物ケアと使用委員会の承認を得て行われるべきです。

注:血小板精製プロトコールは、図 1のフロー図に記載されている。

1. 血液の採取

  1. 3.2% のクエン酸ナトリウム (pH 7.2) を抗凝固剤として添加し、ポリプロピレンチューブ中の Gly-プロ Arg (GPRP) を 0.4 mM 加えます。
  2. は、レトロ軌道出血を用いて C57BL/6 マウスから約200μ l の血液を採取する。
    注:    血液は、年齢や性別に関係なく、任意のタイプのマウス株から採取することができます。
    1. マウスを麻酔するために、任意のタイプのチャンバ内のイソフルランの2ml を使用してください。
      注:麻酔の深さは増加した呼吸および減らされた動きの徴候によって点検される。マウスは、麻酔室の動きに応答したり、処理されるべきではありません。マウスが動きや取り扱いに敏感である場合、それは麻酔室に維持するために、より多くの時間を必要とします。
    2. 1.2.2 は、マウスの右または左まぶたのいずれかを開き、目の血管叢に7.5 センチメートル (0.12 センチメートル直径) 毛細血管管を挿入します。
    3. 血管を破壊し、血流を開始するために、毛細管に圧力を適用しながら、毛管管の半分のターンをねじる。毛管作用によって満たされるコレクションのバイアルの上に逆さまに動物を保持します。
    4. 適切な量の血液を採取したら、毛細血管をガーゼでまぶたに 30 s のための穏やかな圧力を適用することによって、毛管管を削除し、目を閉じます。出血が止まったら、マウスをケージに戻し、出血をモニターします。
    5. 外傷のための目をチェック1-2 日レトロ軌道出血後。手順と euthanize の結果として目に重大な外傷の兆候を示す研究から任意のマウスを削除します。.
      注:マウスは、血液採取の前に少なくとも2週間の血小板を阻害することができる任意の種類の治療を受けるべきではありません.血液試料は、マウスを出血してから1時間以内に血小板精製のために使用されなければならない。

2. 血小板の浄化

注:血小板の精製は、その分解を防ぐために、室温で行われるべきです。試薬および器械の温度が18から22° c. の間にあることを確かめなさい。血小板の分解を防ぐために、プロシージャの間に速くピペットで活発な動揺は避けるべきです。

  1. 600μ l のイオヘキソール (12% のイオヘキソール粉末を 0.85% の塩化ナトリウム、5 mM Tricine、pH 7.2)11を 1.5 mL チューブに加えます。
  2. 200μ l の血液サンプルを、広いボアピペットを用いて勾配媒体の上にゆっくりとチューブの側面を加え、血液とイオヘキソールが混ざっていないようにします (図 2a)。
  3. 遅い加速および減速のスイングバケツローターで20° c で20分間 400 x gでチューブを含むサンプルを遠心分離します。
  4. 血小板が豊富な層のほとんどを収集し、少量の血小板乏しい層 (合計 300 ~ 400 μ l) RBC および WBC 層を乱すことなく、広いボアピペットチップを使用した (図 2b)。血小板サンプルを新しいチューブに移します。
    注:血液中の血小板数が少ない場合や少量の血液を使用した場合は、多血小板層と低血小板層を単層と見なすことができます。
  5. 1 mL の PBS を血小板サンプルに加え、反転して混ぜると、揺動バケツローターで20° c で10分間 800 x gで遠心分離します。溶液を完全に廃棄し、200μ l の PBS を加えて、軽度のピペット操作で血小板を再懸濁します。
    注:このステップは、勾配媒体および血漿タンパク質を除去し、そしてトロンビンのようなアゴニストに血小板の感受性を増加させるので、任意である。異なる遠心分離機は異なるプログラムを有するので、遅い加速/減速は、遠心分離機のユーザマニュアルを読むことによって決定することができる。
  6. このサンプルの30μ l を新しいチューブに移して血小板数をカウントします。残りの血小板は、血小板活性化、凝集、顆粒放出などの生化学的および生理的アッセイに使用することができます。
  7. RNA またはタンパク質抽出のために、血小板試料を10分間 800 x gに遠心分離して血小板をペレットにする。ペレットを乱すことなく完全に上澄みを捨てる。必要な量の RNA またはタンパク質溶解バッファーを追加して、血小板を溶解します。

3. 血小板の計数

  1. すべての血球を希釈し、精製された血小板 (PBS で2〜5倍希釈) を用いて、自動細胞分析装置を使用してカウントします。カウントのための30から50μ l のサンプルを使用しなさい。
  2. サンプルの体積を乗じて血小板の合計数を計算します。
  3. 精製された血小板の収量/回収率を計算します。
  4. 精製された血小板のサンプルの RBC および WBC を数えなさい (50 に PBS との 100-血球計数器に希釈した) および顕微鏡を使用して。

4. 血小板の活性化

  1. チューブ内に、最大100μ l の染色バッファー (2% ウシ胎児血清、FBS を含む PBS) で 1 ~ 200万の精製血小板を添加する。
  2. 複数のサンプルについて、1μ l (0.5 mg/mL) の抗体をマスターミックスし、次のようにしてください: Cy7 ラット抗マウステル119、PE ラット抗マウス CD45、FITC ラット抗マウス CD41、および APC ラット抗マウス/ヒト CD62P (P-セレクチン) RBC、WBC、血小板、および活性化血小板は、それぞれ.細胞を染色するために、チューブにマスターミックスを追加します。トロンビンを追加しないでください。
  3. 別のチューブでは、最大100μ l の染色バッファー、および 0.4 mM の GPRP ペプチドに 1 ~ 200万の精製血小板を添加します。血小板を活性化するためにトロンビンを追加し、ステップ4.2 の後に細胞を染色する。
    注:GPRP は、血小板活性化を介して凝集または血塊形成を防止するためにトロンビンを添加する前にサンプルに添加されるべきである。トロンビン濃度は、血小板の良好な活性化を得るために最適化されるべきである。血小板の活性化後、フローサイトメトリーによるサンプルの取得中にイベント数が減少します。
  4. ポジティブコントロールとして、チューブと 0.4 mM GPRP ペプチドの最大100μ l の染色バッファーに全血の1μ l を加えます。血小板を活性化するためにトロンビンを追加します。陰性対照として、最大100μ l の染色バッファーに全血の1μ l を加える。ネガティブコントロールサンプルにトロンビンを追加しないでください。ステップ4.2 の後に細胞を染色する。
  5. 未染色のアイサイトメトリー制御では、ラベル5チューブに、Cy7、pe、FITC、および APC が付いています。100μ l の染色緩衝液、1μ l の血液、およびそれぞれの抗体の1μ l を標識されたチューブに加えて、細胞を染色する。
  6. 暗所で室温で30分のシミにサンプルをインキュベートします。
  7. 各チューブに 1 mL の染色緩衝液を添加してサンプルを洗浄します。室温で5分間 800 x gで遠心分離します。ペレットを脱落ことなく、染色バッファーを慎重に廃棄します。
  8. 300μ l の染色緩衝液を各チューブに添加し、穏やかに混合し、FACS チューブに移します。染色したサンプルをフローサイトメーターで分析するまで暗所に保存する。

5. 血小板のフローサイトメトリー解析

  1. 新しい実験を作成し、ログフォワードスキャッタ対ログ側散乱ドットプロットを生成し、Ter119 Cy7 (RBC)、CD45 PE (WBC)、CD41 FITC (血小板)、および CD62P APC (活性化血小板) のために選ばれたゲーティング戦略に応じて、ゲートを割り当てます。FACS DIVA ソフトウェアを試してみましょう。
    1. [母集団] タブの [人口階層を表示] を選択して、人口階層を開きます。ゲーティング戦略をチェックし、ゲートの名前を正しく変更して、人口階層を編集します。
    2. [統計の作成] ビューを選択して、統計ビューを開きます。統計ビューを右クリックし、[統計情報の編集] ビューを選択して、ユーザー設定に従って統計ビューを編集します。
    3. 人口に対応するボックスをダブルクリックすることで、レイアウトの視覚的な側面を強化する各ゲートの色を選択します。
  2. サイトメーターウィンドウで、[パラメータ] タブをクリックし、パラメータの電圧を調整して、プロット上の対象の母集団を視覚化します。
  3. 負の母集団と正の母集団を区別できるように、各パラメータの電圧を調整します。補正コントロールのサンプルを記録する前に、1つの染色された正のコントロールがスケール上にあることを確認します (正のピークが表示され、右にあまり遠くないことを確認してください)。
    注:正のピークがスケールオフの場合、正の人口を表示するために電圧を調整する必要があります。
  4. 報酬コントロール (未染色、Cy7、PE、FITC、および APC) の単色染色されたセルを記録します。
  5. 正の制御ゲートが正しく設定されていない場合は、電圧を変更して調整します。
  6. 報酬の計算 > ≫ 報酬設定のテストに進みます。[結果] ウィンドウでのみ [適用] を選択します。
  7. ワークシートウィンドウの左上にあるトグルボタンをクリックして、グローバルワークシートに切り替えます。
  8. ポジティブコントロールサンプルをロードし、補償とゲートを調整するのに十分なセルを取得します。
  9. サンプルを再度ロードし、各プロットが蛍光色素染色抗体に基づいて期待される細胞集団を示していることを確認します。全血サンプルのための10万イベントおよび精製された血小板のための1万のイベントを獲得し、記録しなさい。集録が完了するまで、サンプルを1つずつロードします。
  10. 適切なプロットとゲートを持つソフトウェアでフローサイトメトリーのデータを分析します (図 3)。

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結果

血小板精製の概要は、フロー図に記載されている (図 1)。抗凝固剤の存在下でのイオヘキソール出血を利用したマウスからの血液の採取、血液サンプルの添加、20° c で20分間の揺動バケツ400ローターでの遠心分離が含まれます。精製された血小板の質は、抗体で染色した後、任意の汚染細胞および活性化血小板を検出するための顕微鏡検査およびフローサイトメトリーを用いて評価した。

イオヘキソール勾配培地および血液試料は、血液が培地上にゆっくりと添加された場合にチューブ内に2つの別々の層を形成した (図 2a)。しかし、この段階で遅延があると、血液サンプルの大部分が培地に拡散し、血小板の浄化が困難になる可能性があります。広い穴のピペットの先端は血小板の完全性を維持し、低下を防ぐために重要である血小板への物理的な圧力を保障しなかった。遠心分離の間、遅い加速はイオヘキソール媒体との血液サンプルの不注意な混合を防ぐのを助け、遅い減速は遠心分離の後で勾配を維持するのを助けた。頂部 (麦わ...

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ディスカッション

一般的に、血小板は、大量の血液細胞、細胞破片、および生化学的および生理的なアッセイおよびニーズを妨げる可能性のある血漿タンパク質を含む、血小板が豊富な血漿を生成する低速遠心分離によって単離されるさらに精製21.したがって、主要な汚染物質なしに純粋な血小板を生成することができる迅速かつ簡便な方法を使用することが重要です。ここで提示されるプロトコールは、低速遠心分離を有する勾配媒体を用いたマウス血液からの血小板の精製について説明する。このプロトコルで使用されるパラメータは収量を最大化し、血小板の分解を最小限に抑えます。勾配培地および血漿タンパク質を、アゴニストまたは抗体への血小板の感受性を増加させることができる血小板採取後の洗浄ステップを含むことによって除去することができる。最も重要なことは、精製された血小板は安静状態にあるが、それらはトロンビンのようなアゴニストの存在下で活性化することができる。トロンビンの活動は、ソースごとに異なることがわかりました。したがって、トロンビン濃度は、血小板の良好な活性化を得るために経験的に最適化されるべきである。

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開示事項

著者は利害の対立を宣言していない。

謝辞

この作品は、シンシナティ児童研究財団のスタートアップ資金と、シンシナティ大学のパイロット・トランスレーショナル・ M.N. への助成金によって支えられました。シンシナティ児童病院のサービスのフローサイトメトリーコアに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
APCラット抗マウス/ヒトCD62P(P-セレクチン)サーモサイエンティフィック17-0626-82血小板活性化マーカー
エッペンドルフチューブフィッシャーサイエンティフィック14-222-166センティフュージ用チューブ
FACS DIVAソフトウェアBD バイオサイエンスカタログ外品血小板と全血
FACSチューブフィッシャーサイエンティフィック352008フロー用チューブcytomtery
ウシ胎児血清 (FBS)Invitrogen26140079染色緩衝液
FITC ラット抗マウス CD41BD Biosciences553848血小板マーカー
フローサイトメーターBD Biosciencesカタログ外 血小板・全血の分析
FlowJo softwareFlowJo, Inc.カタログ外品血小板・全血の分析
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)EMD Millipore03-34-0001血小板血栓形成の防止
ヘマトクリット毛細血管フィッシャー・サイエンティフィック22-362566採血毛毛管
ヘマベット・ドリュー・サイエンティフィックカタログ外品血球分析装置
血球計算盤 ハウザー科学3100細胞計数室
イソフルランバクスター1001936040マウス
顕微鏡(オリンパスCKX41)オリンパス非カタログ項目細胞のモニタリングとカウント
Nycodenz(Histodenz)シグマアルドリッチD2158グラジエント培地
PEラット抗マウスCD45BDバイオサイエンス561087WBCマーカー
PE-Cy7ラット抗マウスTER 119BD Biosciences557853RBCマーカー
ピペットチップ200 µL、ワイドボアサーモフィッシャーサイエンティフィック21-236-1A血液および血小板サンプルの移送
ピペットチップ 1000 µL、広口径サーモフィッシャーサイエンティフィック21-236-2C血液および血小板サンプルの移送
リン酸バフ硬化塩水(PBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック14040-117洗浄および希釈用緩衝液
塩化ナトリウムシグマ・アルドリッチS7653生理食塩水
クエン酸ナトリウムフィッシャー・サイエンティフィック02-688-26抗凝固剤
染色バッファー社内カタログ外品洗浄・希釈液
シュタイル水カタログ外品溶媒
テーブルトップ遠心機サーモフィッシャーサイエンティフィック75253839/433607スイングバケットローター遠心機
トロンビン酵素研究所HT 1002a血小板活性化アゴニスト
トリシンSigma-AldrichT0377Nycodenz medium用バッファー
の分析 的な

参考文献

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