ここでは、抗凝固剤の存在下でマウス血液を採取した。血小板は、低速遠心分離を用いてイオヘキソール勾配培地によって精製した。血小板は、実行可能であるかどうかを調査するためにトロンビンで活性化された.精製された血小板の質を、フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査によって分析した。
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この記事について
サマリー
要約
血小板は、赤血球 (RBC)、白血球 (WBC)、および血漿タンパク質から自由でなければならない彼らの機能特性を、研究するために全血から精製されます。ここでは、血液サンプル量に対して3倍以上のイオヘキソール勾配培地を用いてマウス血液からの血小板の精製と、20° c で20分間 400 x gの揺動バケットローターでの遠心分離について述べる。精製された血小板の回収/収率は 18.2 ~ 38.5% であり、精製された血小板は安静状態であり、膨大な数の RBC および WBC が含まれていなかった。トロンビンで処理された精製血小板は、93% の活性化を示し、その生存率を示した。我々は、精製血小板が流動サイトメトリーと顕微鏡評価を用いて十分に純粋であることを確認した。これらの血小板は、遺伝子発現、活性化、顆粒放出、凝集、および接着アッセイに使用することができます。この方法は、同様に他の種の血液からの血小板の精製に使用することができます.
概要
血小板は、血管の損傷に反応して血液凝固の開始剤として機能する血液の成分である。彼らは血管壁1をふさぐために傷害の部位に集まる。血小板は、トロンボポエチンの影響下で骨髄の巨核球に由来する細胞質の anucleate の断片であり、循環2に入ります。それらは、血小板拡散、凝集、および止血プラグ形成1,3をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することによって、細胞外環境を感知することができる代謝的活性および検出可能であると考えられる。止血/血栓および創傷治癒4のほかに、血小板は宿主の炎症反応、血管新生、および転移3、5、6、7において重要な役割を果たし、8.
血小板は、血液から精製され、その生化学的および生理的性質を研究するために、他の血液成分から遊離されるべきである。赤血球 (RBC) および....
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プロトコル
マウスの血液収集は、適切な機関の動物ケアと使用委員会の承認を得て行われるべきです。
注:血小板精製プロトコールは、図 1のフロー図に記載されている。
1. 血液の採取
- 3.2% のクエン酸ナトリウム (pH 7.2) を抗凝固剤として添加し、ポリプロピレンチューブ中の Gly-プロ Arg (GPRP) を 0.4 mM 加えます。
-
は、レトロ軌道出血を用いて C57BL/6 マウスから約200μ l の血液を採取する。
注:血液は、年齢や性別に関係なく、任意のタイプのマウス株から採取することができます。- マウスを麻酔するために、任意のタイプのチャンバ内のイソフルランの2ml を使用してください。
注:麻酔の深さは増加した呼吸および減らされた動きの徴候によって点検される。マウスは、麻酔室の動きに応答したり、処理されるべきではありません。マウスが動きや取り扱いに敏感である場合、それは麻酔室に維持するために、より多くの時間を必要とします。 - 1.2.2 は、マウスの右または左まぶたのいずれかを開き、目の血管叢に7.5 センチメートル (0.12 センチメートル直径) 毛細血管管....
- マウスを麻酔するために、任意のタイプのチャンバ内のイソフルランの2ml を使用してください。
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結果
血小板精製の概要は、フロー図に記載されている (図 1)。抗凝固剤の存在下でのイオヘキソール出血を利用したマウスからの血液の採取、血液サンプルの添加、20° c で20分間の揺動バケツ400ローターでの遠心分離が含まれます。精製された血小板の質は、抗体で染色した後、任意の汚染細胞および活性化血小板を検出するための顕微鏡検査およびフローサイトメトリーを用いて評価した。
イオヘキソール勾配培地および血液試料は、血液が培地上にゆっくりと添加された場合にチューブ内に2つの別々の層を形成した (図 2a)。しかし、この段階で遅延があると、血液サンプルの大部分が培地に拡散し、血小板の浄化が困難になる可能性があります。広い穴のピペットの先端は血小板の完全性を維持し、低下を防ぐために重要である血小板への物理的な圧力を保障しなかった。遠心分離の間、遅い加速はイオヘキソール媒体との血液サンプルの不注意な混合を防ぐのを助け、遅い減速は遠心分離の後で勾配を維持するのを助けた。頂部 (麦わ.......
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ディスカッション
一般的に、血小板は、大量の血液細胞、細胞破片、および生化学的および生理的なアッセイおよびニーズを妨げる可能性のある血漿タンパク質を含む、血小板が豊富な血漿を生成する低速遠心分離によって単離されるさらに精製21.したがって、主要な汚染物質なしに純粋な血小板を生成することができる迅速かつ簡便な方法を使用することが重要です。ここで提示されるプロトコールは、低速遠心分離を有する勾配媒体を用いたマウス血液からの血小板の精製について説明する。このプロトコルで使用されるパラメータは収量を最大化し、血小板の分解を最小限に抑えます。勾配培地および血漿タンパク質を、アゴニストまたは抗体への血小板の感受性を増加させることができる血小板採取後の洗浄ステップを含むことによって除去することができる。最も重要なことは、精製された血小板は安静状態にあるが、それらはトロンビンのようなアゴニストの存在下で活性化することができる。トロンビンの活動は、ソースごとに異なることがわかりました。したがって、トロンビン濃度は、血小板の良好な活性化を得るために経験的に最適化されるべきである。
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開示事項
著者は利害の対立を宣言していない。
謝辞
この作品は、シンシナティ児童研究財団のスタートアップ資金と、シンシナティ大学のパイロット・トランスレーショナル・ M.N. への助成金によって支えられました。シンシナティ児童病院のサービスのフローサイトメトリーコアに感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| APCラット抗マウス/ヒトCD62P(P-セレクチン) | サーモサイエンティフィック | 17-0626-82 | 血小板活性化マーカー |
| エッペンドルフチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 14-222-166 | センティフュージ用チューブ |
| FACS DIVAソフトウェア | BD バイオサイエンス | カタログ外品 | 血小板と全血 |
| FACSチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 352008 | フロー用チューブcytomtery |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Invitrogen | 26140079 | 染色緩衝液 |
| FITC ラット抗マウス CD41 | BD Biosciences | 553848 | 血小板マーカー |
| フローサイトメーター | BD Biosciences | カタログ外 血 | 小板・全血の分析 |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | カタログ外品 | 血小板・全血の分析 |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | 血小板血栓形成の防止 |
| ヘマトクリット毛細血管 | フィッシャー・サイエンティフィック | 22-362566 | 採血毛毛管 |
| ヘマベット | ・ドリュー・サイエンティフィック | カタログ外品 | 血球分析装置 |
| 血球計算盤 ハウ | ザー科学 | 3100 | 細胞計数室 |
| イソフルラン | バクスター | 1001936040 | マウス |
| 顕微鏡(オリンパスCKX41) | オリンパス | 非カタログ項目 | 細胞のモニタリングとカウント |
| Nycodenz(Histodenz) | シグマアルドリッチ | D2158 | グラジエント培地 |
| PEラット抗マウスCD45 | BDバイオサイエンス561087 | WBCマーカー | |
| PE-Cy7ラット抗マウスTER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBCマーカー |
| ピペットチップ200 µL、ワイドボア | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21-236-1A | 血液および血小板サンプルの移送 |
| ピペットチップ 1000 µL、広口径 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21-236-2C | 血液および血小板サンプルの移送 |
| リン酸バフ硬化塩水(PBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14040-117 | 洗浄および希釈用緩衝液 |
| 塩化ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | S7653 | 生理食塩水 |
| クエン酸ナトリウム | フィッシャー・サイエンティフィック | 02-688-26 | 抗凝固剤 |
| 染色バッファー | 社内 | カタログ外品 | 洗浄・希釈液 |
| シュタイル水 | カタログ | 外品 | 溶媒 |
| テーブルトップ遠心機 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 75253839/433607 | スイングバケットローター遠心機 |
| トロンビン | 酵素研究所 | HT 1002a | 血小板活性化アゴニスト |
| トリシン | Sigma-Aldrich | T0377 | Nycodenz medium用バッファー |
参考文献
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E.
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再版と許可
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