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方法論記事

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

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DOI:

10.3791/59804

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2019年9月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

この記事について

サマリー

ここで説明する、連鎖球菌変異体における遺伝子産物の精製のための簡単な方法である。この技術は、タンパク質、特に膜タンパク質および高分子量タンパク質の精製に有利であり、かつ様々な他の細菌種と共に使用することができる。

要約

遺伝子の機能の解明は、通常、目的の遺伝子が破壊された野生型株と株の表現型形質の比較を含む。遺伝子破壊後の機能の喪失は、その後、破壊された遺伝子の生成物の外因性添加によって回復される。これは、遺伝子の機能を決定するのに役立ちます。前述の方法は、gtfC遺伝子破壊連鎖球菌株を生成することを含む。ここで、遺伝子破壊に続いて新たに生成されたS.ミュータン株からgtfC遺伝子産物を精製するための要求の厳しい方法が記載されている。目的の遺伝子の3'末端にポリヒスチジンコード配列を添加することを含み、固定化金属親和性クロマトグラフィーを用いて遺伝子産物を簡単に精製することができます。この方法では、PCR以外の酵素反応は必要ありません。遺伝子破壊後の外因性添加による遺伝子産物の回復は、遺伝子機能を決定するための効率的な方法であり、異なる種に適応することもできる。

概要

遺伝子の機能の分析は、通常、目的の遺伝子が破壊された株に野生型株の表現形質の比較を含む。遺伝子破壊株が産生されると、遺伝子産物の外因性添加が機能的回復を可能にする。

その後の修復アッセイに必要な精製遺伝子産物を得るための最も一般的な方法は、大腸菌1で異種発現を行うことである。しかしながら、膜タンパク質または高分子量タンパク質の発現は、このシステム1を用いて困難であることが多い。これらの場合、標的タンパク質は、通常、複雑な一連のステップを通じてタンパク質をネイティブに合成する細胞から単離され、遺伝子産物の損失につながる可能性があります。これらの問題を克服するために、遺伝子破壊法2、PCRベースのDNAスプライシング法3(指定2段階融合PCR)、遺伝子のエレクトロポレーションに続く遺伝子産物精製のための簡単な手順が開発されました。連鎖球菌変異体の変換.遺伝子産物のC終産にポリヒスチジンタグ(His-tag)を添加すると、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による精製が容易になります。

Hisタグ発現株を単離するために、目的の遺伝子のゲノムDNA全体(このHisタグ発現遺伝子破壊株)は、抗生物質耐性マーカー遺伝子に置き換えられる。Hisタグ発現株を生成する手順は、前述の4,5のように遺伝子破壊株を生成する手順とほぼ同じである。したがって、遺伝子破壊および遺伝子産物単離の方法は、機能解析のための連続実験として行われるべきである。

本研究では、ポリヒスチジンコード配列がgtfC(GenBank遺伝子座タグSMU_1005)遺伝子の3'末端に付着し、S.ミュータンス6にグルコシルトランスフェラーゼ-SI(GTF-SI)をコードする。次いで、連鎖球菌種における発現研究を行った。大腸菌による不一相gtfC発現の達成は困難であり、GTF-SIの分子量が高いためである可能性が高い。この株はS.ミュータンスHis-gtfCと名付けられています。野生型S.mutans(S.mutans WT)およびその誘導体におけるgtfCおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子カセット(spc r)7遺伝子の組織を示す概略図図 1.GTF-SIは、カリオ原性歯科バイオフィルム6の開発に貢献する分泌タンパク質です。ショ糖の存在下では、接着性バイオフィルムはWT S.ミュータンス株の滑らかなガラス表面で観察されるが、S.mutans gtfC-破壊株(S.mutans ΔgtfC)2、5では観察されない。.バイオフィルム形成は、組換えGTF-SIの外因性添加時にS.ミュータンスΔgtfCで復元される。 株、S.ミュータンスHis-gtfCは、次いで組換えGTF-SIを生成するために使用されます。

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プロトコル

注:gtfC遺伝子のコード領域全体をspcrに置き換えるS.mutansの生成は、これらのプロトコルを実行する前に完了する必要があります。ジェネレーション5の詳細については、公開された資料を参照してください。

1. プライマーデザイン

  1. S.ミュータンの建設のためのプライマーを準備する彼の- gtfC.
    注:このプロトコルで使用されるプライマー シーケンスを表1に示します。S.mutans His-gtfCの生成のための2段階融合PCR法は、図2に概略的に示されている。
    1. hisタグコード配列の添付のための設計プライマー(gtfC-リバースおよびspcr-forward)を設計し、gtfC遺伝子とspcr(図2A)の間に介入する。
      1. GS リンカーと HIS タグコーディング シーケンスをgtfC-リバースプライマーとspcr-forward プライマーの両方に含め、5' 領域の 24 個のベースが互いに補完的です。
        注:GSリンカーおよびHis-tagのアミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His)は、遺伝子翻訳を介してGTF-SIのC終点に付着している。
      2. 遺伝子の下流1kbの下流にあるS.mutans WTゲノム>1 kbのgtfC遺伝子を標的とするgtfC-FORWARDプライマーを設計し、spc rの下流側の側面領域を標的にする S. ミュータンスでgtfC.gtfC-forward およびspcr-リバース プライマーの融解温度8 (Tm)を、gtfC-リバースおよびspcrの融解温度と一致するように設定します。フォワードプライマーは、それぞれ。
    2. 2 番目の PCR (図 2B)の入れ子になったプライマー (入れ子になった転送とネストされた逆) を設計します。
    3. 形質転換体のゲノムDNAに特異的な設計プライマー(gtfC-フォワードおよびコロニーリバース)(図2C;プライマーはコロニーPCRに使用される)。
      注:アンプリコンはgtfCとspcrの間の境界線にまたがっています。gtfC-FORWARD プライマーは、フォワード プライマーとして適用できます。
    4. S.mutans His-gtfCの生成の最終確認のための設計プライマー(アップフォワードおよびダウンリバース)(図2C;プライマーによって増幅されたPCR製品は、DNAシーケンシングに使用される)。

2. S.ミュータンからのゲノムDNA抽出

注:各S.ミュータン株は、嫌気性条件下で37°Cで脳心注入(BHI)培地で培養する必要があります。S.ミュータンスgtfCおよびS.ミュータンスHis-gtfCの変異株は、100 μg/mLスペクチノマイシンを補充したBHIで培養される。

  1. ストリークS. ミュータンs WT とS. ミュータンスgtfCを各 BHI 寒天プレートに別々に取り付けます。37 °Cで一晩インキュベートします。
  2. 殺菌された爪楊枝を使用してS.ミュータンsWTまたはS.ミュータンスの単一のコロニーを選択し、BHIスープの1.5 mLに接種します。37 °Cで一晩インキュベートします。
    注:コロニーは、最初のPCRのテンプレートDNAの供給源として使用することができる(ステップ3.1)。
  3. 各細菌培養の1mLを1.5mLマイクロ遠心管に移す。15,000 x gで1分間培養を遠心分離します。
  4. 上清を取り出し、トリス-EDTAバッファー(pH 8.0)の1 mLを加えてセルペレットを再サスペンドします。
  5. 15,000 x gで1分間の懸濁液を遠心分離します。上清を取り除く。トリス-EDTAバッファー(pH 8.0)の50 μLでセルペレットを再ステーペントします。
  6. ブロックインキュベーターを用いて95°Cで5分間懸濁液を加熱します。15,000 x gで5分間の懸濁液を遠心分離します。
  7. 上清を新しい1.5mLマイクロ遠心分離管に移します(上清は最初のPCRのテンプレートDNAとして機能します)。

3. PCR増幅

注:表1、表2、表3は、それぞれPCRプライマー、試薬、増幅サイクルをまとめた。

  1. S.ミュータンs WTおよびS.ミュータンスgtfCゲノムをPCRテンプレートとして用いて最初のPCRを実行する。 gtfC遺伝子の下流部分を収容する領域と、ステップ1.1.1.2(図2A)で説明するプライマーを使用してspcrを収容する領域を増幅する。
  2. 1%アガロースゲル上の各PCR製品を電気フォラーゼ。約1,000 bpおよび2,000 bpの所望のDNA断片を物品法で取り除き、シリカ膜系ゲル抽出法を用いてゲルから断片を精製する。
    注:PCR9、DNAゲル電気泳動10、およびDNA精製11の基本的な手順は、他の場所で詳しく説明されている。
  3. ネストされたフォワードとネストされたリバースプライマーを持つPCRテンプレートとして、最初のPCR(約等価)の製品を使用して2番目のPCRを実行します(図2B)。
  4. アガロースゲル上のPCR混合物の10分の1の電気フォレーゼ。約3,000bpの適切なアンプリコンの生成を確認します。
  5. 残りのPCR製品を沈殿させる。
    注:    第2のPCRによって生成される非特異的アンプリコンは相同組換えを妨げないため、PCR産物の精製は必要ない。
    1. PCR混合物にヌクレアーゼフリー水を追加し、総体積を100μLにし、続いて3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)と2.5体(250μL)の絶対エタノールの0.1体積(10μL)を加えます。混合物を室温(RT)で10分間混ぜて保存します。
    2. 4°Cで15,000 x gで20分間サンプルを遠心分離します。上清を捨てます。DNAペレットを洗浄するために70%エタノールの1 mLを追加します。
    3. 4°Cで15,000 x gで5分間サンプルを遠心分離します。上清を捨てます。空気乾燥し、ヌクレルトフリー水の10 μLでDNAペレットを溶解します。

4. 細胞変換

  1. 有能なS. mutans WT を準備して、前のパブリケーション5で説明した手順に従って 2 番目の PCR 製品を導入します。細胞を-80 °Cに保管してください。
    注:この実験では、有能なS.ミュータンのWT細胞は、すでに-80 °Cに保存されており、S.ミュータンスgtfCを生成している。
  2. 濃縮された第2PCR産物の5μLを、以前に凍結した氷冷有能な細胞の50μLアリコートに混ぜる。エレクトロポレーションキュベットに混合物を追加します。エレクトロポレーション装置を使用してセルに単一の電気パルス(1.8 kV、2.5 ms、600 Ω、10 μF)を与えます。
  3. BHIスープの500 μLで細胞を再中断します。直ちに、スペチノマイシンを含むBHI寒天プレートに懸濁液の10-100 μLを広げる。コロニーが十分に成長するまで、37°Cで2〜6日間プレートをインキュベートします。

5. Gエノム組み換えと貯蔵の検証

  1. コロニー PCR を実行し、gtfC フォワードプライマーとコロニーリバース プライマーを使用して、組み換えのスクリーニングを行います。アガロースゲル上の各コロニーPCR産物を電気フォラーゼする。約1,500bpのDNA断片を確認します。
  2. 殺菌された爪楊枝を使用して陽性コロニーの1つを選択し、スペクチノマイシンを含むBHIブロスの2 mLで細胞を一晩サブ培養する。
  3. -80 °C または -20 °C で無菌 50% グリセロールとストックの 0.8 mL と細菌培養の 0.8 mL を混合します。
  4. 残りの1mLのセル懸濁液を1.5mLのマイクロ遠心分離管に移します。ステップ2.3~2.7を繰り返し、細胞からゲノムDNAを抽出します。
  5. アップフォワードとダウンリバースプライマーとゲノムDNAをテンプレートとして使用してPCRを実行します。ステップ3.2を繰り返し、ゲルから増幅されたDNA産物を精製する。
  6. DNAシーケンシングにより精製アンプリコンのDNA配列を決定する。
    注:DNAシーケンシングにより、S.ミュータンの生成を確認してください。

6. ポリヒスチジンタグ付きGTF-SIの精製

  1. ストリークS.ミュータンス彼の-gtfCをスペクチノマイシン含有BHI寒天プレート上に。37 °Cで一晩インキュベートします。
  2. BHIスープの3 mLで殺菌された爪楊枝とサブ培養細胞を使用して単一のコロニーをピックアップします。37 °Cで一晩インキュベートします。
  3. スペクチノマイシンなしでBHIスープの1 Lで2つの円錐状フラスコを準備します。BHIスープの1Lに一晩培養懸濁液の1mLを接種する。37 °Cで一晩インキュベートします。
  4. 硫酸アンモニウム沈殿による培養上清からのタンパク質を濃縮する。
    注:    標的タンパク質が細胞内にある場合は、細胞体から抽出します。硫酸アンモニウム沈殿のための基本的な手順は、他の場所で詳細に12.
    1. 4°Cで10,000 x gで20分間細菌培養懸濁液を遠心分離する。培養上清を3Lガラスビーカーに回収する。
    2. 上清の2Lに硫酸アンモニウム1,122g(80%飽和)を加え、磁気攪拌機を用いて激しく撹拌する。沈殿物を攪拌しながら4°Cで4時間以上形成できるようにする。
      注:沈殿物の形成は一晩続けることができる。
    3. 硫酸アンモニウム沈殿液を15,000 x gで遠心分離し、4°Cで20分間使用します。上清をデカント。
    4. ヘラで沈殿物を収集し、200 mLガラスビーカーに転送します。結合バッファーの35 mLでペレットを再ステース(50 mM NaH2PO 4、300 mM NaCl、5 mMイミダゾール、pH 8.0)で再ステースする。
    5. 再生セルロース透析チューブを用いて結合バッファーの2,500mLに対して懸濁液を透析し、4°Cで、撹拌する。2時間後に透析液を交換し、一晩透析を続けます。
    6. 透析液をもう一度交換してください。さらに2時間透析を続けます。
  5. 4°Cで10分間20,000 x gで透析液を遠心分離します。吸引ろ過装置を使用して膜フィルターを通して上清をろ過する。濾液を75cm2フラスコに移します。
  6. 固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による濾過懸濁液からポリヒスチジンタグ付きGTF-SIをフラクショナルレートします。
    1. Ni-電荷IMAC樹脂スラリーの2mL(樹脂約1mL)を、シリコーンチューブにコンセントを取り付けたクロマトグラフィーカラムに移します。重力の流れによって貯蔵ソリューションを取り除きます。
      注意:IMAC全体で樹脂を乾燥させないようにしてください。
    2. 樹脂を洗浄するために、カラムに蒸留水の3 mLを追加します。樹脂を平衡化するために結合バッファーの5 mLを追加します。
    3. ホフマンのピンチコックで流れを止めろステップ6.5からフィルタリングされたサスペンションの5 mLを追加してスラリーを作ります。
    4. 残りのフィルタリングされたサスペンションにすべてのスラリーを追加します。4°Cで30分間穏やかに混合物を旋回します。
    5. 混合物を列に戻します。重力の流れによって懸濁液を取り外します。IMAC樹脂を20mLの結合バッファーで洗浄します。
      注:その後の IMAC 全体でホフマンピンチコックを使用して、流量を約 2 mL/min に調整します。
    6. 溶出バッファーの20 mL(50 mM NaH2PO 4、300 mMNaCl、500 mMイミダゾール、pH 8.0)で組換えGTF-SIを溶出します。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。溶出物は4°Cで保存する必要があります。IMAC樹脂は再利用可能です。IMAC樹脂の説明書を参照してください。
  7. 溶出バッファーをストレージバッファ(50 mMリン酸バッファー、pH 6.5)に置き換え、組換えGTF-SI溶液を遠心超濾過ユニットを使用して約1mLに濃縮します。組換えGTF-SI溶液を4°Cに保管してください。
    注:SDS-PAGE 13およびウェスタンブロッティング14を用いてポリヒシジンタグ付きGTF-SI精製を確認し、ワサビペルオキシダーゼ結合抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を用いて確認する。CHAPSの追加(最終濃度、0.1%)溶離剤には、標的タンパク質に応じて、ユニットへの非特異的な吸着を避けるために必要とされる場合があります。

7. 組換えGTF-SIによる機能修復

  1. 各S.ムタンの株をBHI寒天プレートに個別にストリークします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
  2. 殺菌されたつまようじを使用して、BHIスープの2 mLに接種する単一のコロニーを拾います。37 °Cで一晩インキュベートします。
  3. S.mutansの一晩培養物の20 μLを使用して、ガラス試験管に抗生物質を含まない1%ショ糖を含むBHIスープの2mLを接種する。GTF-SIまたは車両の同等の体積をS.mutansのgtfC培養物に加え、チューブを一晩傾斜位置に置いて細胞を培養する。
    注:無菌注射器フィルターでGTF-SI溶液を殺菌し、使用前にビシンコニン酸タンパク質アッセイ15を用いてタンパク質濃度を決定する。
  4. 10 s. サスペンションをデカントのための渦ミキサーで培養懸濁液を攪拌します。十分な量の蒸留水で試験管を洗います。
  5. 0.25%クーマシーブリリアントブルー(CBB)の1 mLでチューブウォールのバイオフィルムを汚します。
  6. 1分後に染色液をデカントし、十分な量の蒸留水で試験管を洗浄します。試験管を空気乾燥させます。

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結果

図3は、第1PCR(図3A)および第2PCR(図3B)からの各アンプリコンのサイズを示す。各アンプリコンのサイズは、表1に説明するように、予測サイズに対応しました。図4Aは、第2のPCR産物で形質転換し、スペクチノマイシンを含むBHI寒天プレート上にメッキされたS.ミュータンコロニーを示す。その後、コロニーPCR産物をアガロースゲル(図4B)で走らせた。各アンプリコンは、表 1に説明するように、予測サイズのサイズでした。図 5は、SDS-PAGE とウェスタン ブロットの画像を示しています。IMACで精製したタンパク質は、SDS-PA...

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ディスカッション

プライマーの設計は、プロトコルの最も重要なステップです。gtfC -リバースプライマーとspcr-forward プライマーのシーケンスは、gtfC の 3'終了領域とspcrの 5′ 終了領域の両方のシーケンスに基づいて自動的に決定されました。各プライマーには、GS リンカーと 5' リージョンの His タグ コーディング シーケンスをエンコードする 24 の相補ベースが含まれています。上流の側面領域に位置するネイティブの規制シーケンスの中断は、3'末端にHisタグコーディングシーケンスを追加することによって回避することができます。DNAストップコドンは、gtfC-リバースプライマーから除去し、spcr-FORWARDプライマーに追加する必要があります。さらに、gtfC-forwardおよびspcr-reverseは、S.mutans WTゲノムにおける相同組換えの標的領域の約1kb上流...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、日本学術振興会(JSPS)(助成番号16K15860、19K10471~T.M.、17K12032~N.H.、セコム科学技術振興財団(助成番号201)の支援を受けています。.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロー日本ジェネティクスNE-AG02アガロースゲル電気泳動用
アナエロパック三菱ガス化学A-03嫌気性培養システム
抗His-Tagモノクローナル抗体MBLD291-7HRP標識
BCAタンパク質アッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック23227タンパク質濃度の測定
ブレイン ハート インフュージョン ブロスベクトン、ディキンソン237500細菌培養培地
CBB R-250和光031-17922バイオフィルム染色用
遠心限外ろ過ユニットザルトリウスVS2032バッファーの交換とタンパク質濃度
遠心分離機クボタ7780II
クロマトグラフィーカラムバイオ・ラッド7321010IMAC
透析メンブレンクランプフィッシャーブランド21-153-100
透析チューブAs One2-316-06
DNAポリメラーゼ宝R045AハイフィデリティDNAポリメラーゼ
DNAシーケンシングユーロフィンズゲノミクス
ECL基質バイオ・ラッド170-5060ウェスタンブロッティング用
EDTA (0.5 M pH 8.0)Wako311-90075Tris-EDTA buffer preparation
エレクトロポレーションキュベットBio-Rad16520860.2 cm gap
ElectroporatorBio-Rad1652100
EtBr溶液Nippon Gene315-90051アガロースゲル電気泳動用
ゲルバンドカッター日本ジェネティクスFG-830
Gel抽出キット日本ジェネティクスFG-91202アガロースゲルからのDNA抽出
イメージャーGEヘルスケア29083461SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング用
イミダゾール和光095-00015結合緩衝液および溶出緩衝剤調製
インキュベーター日本メディカル&化学機器EZ-022温度設定:4°C;C
インキュベーター日本メディカル&化学機器LH-100-RDS温度設定:37°C;C
メンブレンフィルターMerck MilliporeJGWP047000.2 & micro;m径
クボタ3740
NaCl和光191-01665結合緩衝液および溶出緩衝液の調製
NaH2PO4·2H2O和光192-02815結合緩衝液および溶出緩衝液
の調製 NaOH和光198-13765結合緩衝液および溶出緩衝液
(NH4)2SO4光015-06737硫酸アンモニウム沈殿
Niチャージ樹脂Bio-Rad1560133IMACの場合
PCR プライマーEurofins Genomicsカスタムオーダー
タンパク質標準Bio-Rad161-0381SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング
溶媒ろ過装置1つとしてFH-1G
スペクチノマイシンワコー195-11531抗生物質; 100 μg/mL
滅菌シリンジフィルターMerckmilliporeSLGV004SL0.22 µm 直径
Streptococus mutans ΔラボでgtfCStock株。gtfCをspcr
Streptococus mutans UA159ストック株にS. mutans ATCC 700610, 野生型
ショ糖ワコー196-00015バイオフィルム開発用
TAE (50 回; )Nippon Gene313-90035アガロースゲル電気泳動用
サーマルサイクラーバイオ・ラッドPTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)和光314-90065Tris-EDTA緩衝液調製
ス 用 和用 置き換えました。

参考文献

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