自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製

サマリー

ここでは、質量分析ベースの定量プロテオミクス解析のための自動化された血漿タンパク質消化法を紹介する。このプロトコルでは、タンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化反応のための液体の移動およびインキュベーションステップが合理化され、自動化されています。所望の精密の96の井戸版を準備するのにおよそ5時間かかる。

要約

プロテオミクスにおける質量分析分析のためのサンプル調製には、タンパク質をペプチド混合物に酵素的に切断する必要があります。このプロセスは、変性、還元、アルキル化、および切断を達成するために、多数のインキュベーションおよび液体移動ステップを伴う。このワークフローを自動化されたワークステーションに適用することで、効率を高め、分散係数を削減できるため、サンプルタイプ間の統計的比較に対する信頼性の高いデータを提供できます。我々は、以前に、自動化されたプロテオームサンプル調製ワークフロー¹を説明した。ここでは、より効率的で優れた制御ワークフローの開発を次の利点と報告します: 1)液体移送ステップの数は試薬を組み合わせることで9から6に減少します。2)ピペッティング時間は、複数のチャネルを有する96位のピペットヘッドを使用して選択的な先端ピペットによって減少する。3)最大45デッキポジションの可用性によって潜在的なスループットが増加します。4)システムの完全なエンクロージャは改善された温度および環境制御を提供し、サンプルまたは試薬の汚染のための潜在性を減らす;5) 安定同位体標識ペプチド、ならびにβ-ガラクトシダーゼタンパク質を各サンプルに添加することで、プロセス全体を通してモニタリングと品質管理が可能になります。これらのハードウェアとプロセスの改善により、良好な再現性を提供し、アッセイおよびアッセイ間精度(20%未満のCV)を改善LC-MSベースのタンパク質およびペプチド定量のため。96ウェルプレートで96サンプルを消化するためのワークフロー全体を約5時間で完了できます。

概要

質量分析(MS)ベースのタンパク質およびペプチド定量は、基礎研究及び臨床検査所における血漿分析のためのバイオアナリシスツールとしてますます応用されている^2,,3.必要な機器および情報学は、MSが単一のMSラン⁴で何百ものペプチドを定量する能力のために特定のペプチド配列を標的化することによってタンパク質または修飾タンパク質を定量するための選択方法となっているように急速に進歩している。サンプル調製は、任意のプロテオミクス分析の基礎として機能します。MS分析の前に、生物学的試料中のタンパク質は、典型的には変性、還元、アルキル化、トリプティックペプチドに消化され、5を脱^塩する。アルキル化は、制御されていない変更を防ぎ、すべてのシステインが同じ質量を持っていることを保証するためにシステインをブロックします。次に、トリプシンを添加してタンパク質をペプチドに消化する。これらの各手順は最適化を必要とし、従来は全体のプロセスを手動で実行し、分析エラーを導入できます。

従来のバイオマーカー開発パイプラインは、グローバルタンパク質発見用ショットガンプロテオミクス、詳細なタンパク質インベントリ⁶を作成するショットガンプロテオミクス、高精度かつハイスループットなタンパク質定量⁷を目的とした検証と検証のための標的プロテオミクスの2つの主要プロセスで構成されています。MSアプローチにかかわらず、サンプル調製は同じであり、ペプチド混合物へのタンパク質の酵素的切断を中心とする。Van EykとSobhani⁸が提案したように、発見および標的アッセイの両方に対して正確で正確かつ再現性のある分析を可能にする方法を有することが、バイオマーカーの発見を臨床実施アッセイに効果的に移動することが望まれる。これを行うには、サンプル準備の自動化が役立ち、高スループット分析の効率を向上させる機能を提供します。手動メソッドは、通常、バイオマーカーと診断^22,99を含む改訂されたバイオアナリシス法検証ガイダンスで食品医薬品局(FDA)によって指定された許容限界を超える分析誤差を導入する。バイオマーカーの研究を促進するためには、高速で高精度でハンズフリーなMSタンパク質サンプル調製ワークフローの開発が必要であり、何千もの生物学的サンプルを調製し分析する必要があります。MS サンプルの準備には、エラーが発生する多くの手順があり、プロセスは面倒で時間がかかります。

改良された方法では、自動化されたワークステーションが、必要なすべてのプラズマサンプル調製手順を合計6ステップ(図1)で実行するようにプログラムされ、1)正確な液体移送を確実に行いました。2)反応が開始され、一貫した時間に停止します。3)反応は、制御された温度(すなわち、インキュベーター)で行われる。4)反応は全ての反応に対して均一な混合を有する。また、外因性の品質管理タンパク質と内部標準(安定同位体標識ペプチド標準)を追加して、LC-MSベースのタンパク質およびペプチド定量の品質と再現性を96ウェル形式で実現しました。試薬の準備、作業時間、および個々のチューブ内の96サンプルを処理するためには、合計1,000,000のピペット処理ステップが必要です。自動化により、実践的な時間と、関係する人間との対話の数が削減されます。

プロトコル

1. 自動液体ハンドラのプログラミング

1. [ファイル] メニューから新しいメソッドを作成する ([ ファイル |新しいメソッド)
   注: 指定された順序で手順を完了します。斜体フォントは、Biomek ソフトウェアで入力するテキストを表します。ピペッティング技術やテンプレートについては、作者にお問い合わせください。
2. 表 1に示すように、開始ステップの変数とその値を入力します。
3. 選択的なチップピペットのカラムを設定します。手順 1.3 ~ 1.7 の場合は、[コントロール ステップ] の下にあるツールバーの [グローバル設定] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。
   1. グローバル設定ステップを使用して、値=FirstColumnを変数FirstColumn_Globalに設定し、値=LastColumnを変数LastColumn_Globalに設定し、値=LastColumn-FirstColumn+1を変数列に、値=Columns*8を変数ウェルに設定します。
   2. [コントロールステップ] の下のツールバーで[スクリプト] ステップを選択し、メソッドにドラッグします。図 2に示すように、VB スクリプトを入力します。
4. ミックスのボリュームを設定する グローバルとソリューションを設定します。
   1. グローバル設定ステップを使用して、表 2 に示すように、ボリュームミックス変数に対応する値を設定します。
   2. [コントロールステップ] の下のツールバーの[If]ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。条件下で「オートサンプラー」と入力します。
   3. [次へ] で、[コントロール ステップ] の下のツール バーの [グローバル設定] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。
   4. グローバル設定ステップを使用して、値=(モバイルフェーズ *列)+10を変数MobilePhaseWellに設定します。
   5. [Else]で、[コントロール ステップ] の下のツールバーの [グローバルに設定] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。
   6. グローバル設定ステップを使用して、値=0を変数MobilePhaseWellに設定します。
5. ガイド付きラボウェアセットアップ (GLS) の構成
   1. [ユーティリティ] の下のツールバーの[デッキ エディタ]ステップをクリックします。図 3のデッキ レイアウトに対応する新しいデッキを作成し、それをデッキ 1 とラベル付けします。
   2. [セットアップとデバイス] の下にあるツールバーの[ガイド付きセットアップ] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。表 3に示すように、ラボウェアの種類をデッキの位置にドラッグ アンド ドロップします。その後、表 3 と図 4 (ガイド付きセットアップのセットアップ) に示すように、表のタブを入力します。
6. チップ棚卸の手順の設定
   1. [コントロールステップ] の下にあるツールバーの [プロシージャの定義] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。プロシージャの名前を TipCountとして指定します。
   2. [コントロール ステップ] の下のツールバーの[スクリプト] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。図 5 (チップカウント スクリプト) に示すように、VB スクリプトを入力します。
   3. [コントロールステップ] の下のツールバーの[If]ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。
   4. 条件下でTL5 = 0 と入力します。
   5. [次へ] で、[設定とデバイスのステップ] の下にあるツール バーの[ラボウェアの移動] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ラボウェアをTL5から TR3 に移動します。ツールバーの[Labwareを移動]ステップをクリックし、[設定とデバイスのステップ]の下でメソッドにドラッグします。ラボウェアをTL2から TL5 に移動します。最後に、[設定とデバイスのステップ] の下にあるツールバーの[Labwareの移動] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ラボウェアをBC90から TL2 に移動します。
7. インキュベーターの定義手順
   1. [コントロールステップ] の下にあるツールバーの [プロシージャの定義] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。インキュベーターとして名前プロシージャ。
   2. [変数名] として[ハーフタイム]に入力し、既定値として1800を入力します。
   3. NextTempに変数名として入力し、22を既定値として入力します。
   4. 変数名としてtempに入力し、既定値として60を入力します。
   5. ツールバーの[設定とデバイスのステップ]の下にある拡張されたラボウェアの移動ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ラボウェアをP11からINHECO1に移動します。
   6. [コントロール ステップ] の下のツール バーで[プロシージャの実行]ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。手順にTipCount という名前を付けます。
   7. [統合] の下にあるツールバーのINHECO インキュベートステップをクリックし、メソッドにドラッグします。INHECO1でデバイスを使用する位置、インキュベートの場合は=ハーフタイム、°Cの場合は=Temp、目標温度の°Cの場合は3を入力します。[インキュベーション中にシェイク]オプションと [軌道] ( 時計回り) のシェイク スタイルを選択します。設定の場合は、1.00 mm の左右、6.6回秒、1.00 mm フォワード広告を後方に、6.6回秒に入力します。
      注:INHECOインキュベーターソフトウェアがインストールされていることを確認してください。
   8. [統合] の下にあるツールバーのINHECO インキュベートステップをクリックし、メソッドにドラッグします。INHECO1でデバイスを使用する位置、インキュベートの場合は=ハーフタイム、°Cの場合は=Temp、目標温度の°Cの場合は3を入力します。[インキュベーション中にシェイク]オプションと [軌道] (反時計回り) シェイク スタイルを選択します。設定の場合は、1.00 mm の左右に、1.6回秒、1.00 mm 前後に6.6回秒で入力します。
   9. [設定とデバイスのステップ] の下にあるツールバーの[一時停止] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。システム全体を1 s で一時停止します。
   10. [コントロールステップ] の下にあるツールバーの [プロシージャの定義] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。インキュベーターとして名前プロシージャ。
   11. [統合] の下にあるツールバーのINHECO インキュベートステップをクリックし、メソッドにドラッグします。INHECO1でデバイスを使用して位置に、1をインキュベート用に、=NextTempを°C、3°Cの目標温度で入力します。 3
8. 軌道の手順を定義する。
   1. ツールバーの[設定とデバイスのステップ]の下にある拡張されたラボウェアの移動ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ラボウェアをP11からOrbital1に移動します。
   2. [コントロール ステップ] の下のツール バーで[プロシージャの実行]ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。手順のヒント数を選択します。
   3. ツールバーの [デバイスの操作] ステップをクリックし、[設定とデバイスのステップ]の下の手順をクリックし、メソッドにドラッグします。デバイスのオリタルシェーカー0、コマンドタイミングシェイクを選択します。揺れ速度1000、フルスピード2に達する時間、30を振る時間を入力してください。
   4. ツールバーの[設定とデバイスのステップ]の下にある拡張されたラボウェアの移動ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ラボウェアオービタル1を P11に移動します。
9. 最初のミックスを設定する
   1. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[チップを選択]ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。再配置位置 TL4 を選択します。
   2. [統合] の下にあるツールバーのINHECO インキュベートステップをクリックし、メソッドにドラッグします。INHECO1でデバイスを使用する位置、インキュベート用1、°Cの場合は60、目標温度の°Cに3を入力します。 3
   3. [コントロールステップ] の下のツールバーの[ループ] ステップをクリックし、そのステップを [ヒントの選択] ステップ内のメソッドにドラッグします。変数としてcol =FirstColumn を開始として入力し、最後の列を終了として=、1 を増分として入力します。 1
   4. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントのロードヒントを選択]ステップをクリックし、ループステップ内のメソッドにドラッグします。ドロップダウンメニューから[BC90ヒント]、[TL5の場所]、[TL2バックアップのヒントの場所]を選択します。[単一列] を選択し、「1」と入力します。
   5. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒント吸引を選択]ステップをクリックし、ループステップ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと試薬プレート位置を選択します。ボリューム=FirstMix、1列目と1行1の吸引を入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
   6. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントの選択](Select Tips Dispense)ステップをクリックし、ループステップ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと試薬プレート位置を選択します。ボリューム=FirstMixを入力し、列=colおよび行1でディスペンスします。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
   7. ツールバーの[チップの選択解除]ステップをクリックし、ループステップ内のメソッドにドラッグします。[TR1 へのヒントのアンロード] を選択します。
10. サンプルの設定
    1. [コントロールステップ] の下のツールバーの[If]ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。条件として「サンプルプレート」と入力します。
    2. [次に実行] で、[リキッドハンドリングステップ] の下にあるツール バーの[ヒントの選択] の [読み込みヒントの選択] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ドロップダウンメニューから[BC90ヒント]、[TL5の場所]、[TL2バックアップのヒントの場所]を選択します。[単一列] を選択し、=tipcolumnsを入力します。
    3. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒント吸引を選択]ステップをクリックし、その後、メソッドにドラッグします。Greiner96RoundPS ラボウェアの種類とサンプルの位置を選択します。容積=サンプル、列=FirstColumnおよび行1の吸引を入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    4. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントの選択](Select Tips Dispense)ステップをクリックし、その後、メソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと反応プレート位置を選択します。ボリューム=サンプルを入力し、列= FirstColumnと行1でディスペンスします。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    5. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[チップのアンロードを選択]ステップをクリックし、その後、メソッドにドラッグします。[TR1 へのヒントのアンロード] を選択します。
    6. Ifステップの終了後、[コントロール ステップ] の下のツールバーの [プロシージャの実行]ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。インキュベーターの手順を選択します。[変数名] として[ハーフタイム]に入力し、既定値として1800を入力します。NextTempに変数名として入力し、22を既定値として入力します。変数名としてtempに入力し、既定値として60を入力します。
11. システインブロックの設定
    1. [コントロールステップ] の下のツールバーの[ループ] ステップをクリックし、そのステップをメソッドにドラッグします(ヒントの選択ステップ内)。変数としてcol =FirstColumn を開始として入力し、最後の列を終了として=1を増分として入力します。
    2. [ループ] の下で、[リキッドハンドリングステップ] の下にあるツールバーの [ヒントの選択] の[ロード ヒントの選択] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ドロップダウンメニューから[BC90ヒント]、[TL5の場所]、[TL2バックアップのヒントの場所]を選択します。[単一列] を選択し、「1」と入力します。
    3. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒント吸引を選択]ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと試薬プレート位置を選択します。ボリュームを入力します=CysteineMix、列2と行1で吸引.テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    4. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントの選択](Select Tips Dispense)ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Round ラボウェアタイプと反応プレート位置を選択します。ボリューム= CysteineMixを入力し、列= colおよび行1でディスペンスします。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    5. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[チップのアンロードを選択]ステップをクリックし、その後、メソッドにドラッグします。[TR1へのヒントのアンロード]を選択します。
    6. Ifループの終了後、[コントロール ステップ] の下のツール バーの[プロシージャの実行] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。インキュベーターの手順を選択します。[変数名] として[ハーフタイム]に「既定値として300」と入力します。NextTempに変数名として入力し、43をデフォルト値として入力します。変数名としてtempに入力し、既定値として25を入力します。
12. 2 番目のミックスのセットアップ
    1. [コントロールステップ] の下のツールバーの[ループ] ステップをクリックし、そのステップをメソッドにドラッグします(ヒントの選択ステップ内)。変数としてcol =FirstColumn を開始として入力し、最後の列を終了として=1を増分として入力します。
    2. ループの下で、[液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントを選択]のロードヒントステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ドロップダウンメニューから[BC90ヒント]、[TL5の場所]、[TL2バックアップのヒントの場所]を選択します。[単一列] を選択し、「1」と入力します。
    3. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒント吸引を選択]ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと試薬プレート位置を選択します。ボリューム=SecondMix、列3および行1に吸引を入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    4. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントの選択](Select Tips Dispense)ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと反応プレート位置を選択します。ボリューム= SecondMixを入力し、列= colおよび行1でディスペンスします。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    5. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[チップのアンロードを選択]ステップをクリックし、その後、メソッドにドラッグします。[TR1 へのヒントのアンロード] を選択します。
    6. [If the ループ] の終了後、[コントロール ステップ] の下のツール バーの [プロシージャの実行] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。[オービタル]プロシージャを選択します。
    7. [設定とデバイスのステップ] の下にあるツールバーの[一時停止] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。システム全体を1 s で一時停止します。
13. トリプシンの追加の設定
    1. [コントロールステップ] の下のツールバーの[ループ] ステップをクリックし、そのステップをメソッドにドラッグします(ヒントの選択ステップ内)。変数としてcol =FirstColumn を開始として入力し、最後の列を終了として=1を増分として入力します。
    2. [ループ] の下で、[リキッドハンドリングステップ] の下にあるツールバーの [ヒントの選択] の[ロード ヒントの選択] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ドロップダウン メニューから[BC90 ヒント]、[TL5 の場所]、および [TL2 バックアップのヒントの場所] を選択します。[単一列] を選択し、「1」と入力します。
    3. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒント吸引を選択]ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと試薬プレート位置を選択します。容積=トリプシン、4列目と行1の吸引を入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    4. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントの選択](Select Tips Dispense)ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと反応プレート位置を選択します。ボリューム=トリプシン、列= colおよび行1で分配を入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    5. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[チップのアンロードを選択]ステップをクリックし、その後、メソッドにドラッグします。[TR1 へのヒントのアンロード] を選択します。
    6. Ifループの終了後、[コントロール ステップ] の下のツール バーの[プロシージャの実行] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。インキュベーターの手順を選択します。[変数名] として[ハーフタイム]に「既定値」と入力し、[既定値] に「3600」と入力します。NextTempに変数名として入力し、25を既定値として入力します。変数名としてtempに入力し、既定値として43を入力します。
    7. [統合] の下にあるツールバーのINHECO インキュベートステップをクリックし、メソッドにドラッグします。INHECO インキュベーター ソフトウェアがインストールされていることを確認します。INHECO1でデバイスを使用する位置、インキュベート用1、°C用25、目標温度の°Cに対して5を入力します。
14. クエンチの設定
    1. [コントロールステップ] の下のツールバーの[ループ] ステップをクリックし、そのステップを [ヒントの選択] ステップ内のメソッドにドラッグします。変数としてcol =FirstColumn を開始として入力し、最後の列を終了として=1を増分として入力します。
    2. [ループ] の下で、[リキッドハンドリングステップ] の下にあるツールバーの [ヒントの選択] の[ロード ヒントの選択] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ドロップダウンメニューから[BC90ヒント]、[TL5の場所]、[TL2バックアップのヒントの場所]を選択します。[単一列] を選択し、「1」と入力します。
    3. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒント吸引を選択]ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Roundラボウェアタイプと試薬プレート位置を選択します。容積=クエンチ、5列目と行1の吸引を入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    4. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントの選択](Select Tips Dispense)ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Round ラボウェアタイプと反応プレート位置を選択します。ボリューム=クエンチ、列= colおよび行1でディスペンスを入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    5. [液体処理ステップ] の下にあるツールバーの[ヒントのアンロードの選択] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。[TR1 へのヒントのアンロード] を選択します。
    6. [If the ループ] の終了後、[コントロール ステップ] の下のツール バーの [プロシージャの実行] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。[オービタル]の手順を選択します。
    7. [設定とデバイスのステップ] の下にあるツールバーの[一時停止] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。システム全体を1 sの間一時停止します。
    8. [設定とデバイスのステップ] の下にあるツールバーの[一時停止] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。[システム全体を一時停止し、このメッセージを表示する] チェック ボックスをオンにします。「遠心後に続行」というメッセージを入力します。
15. オートサンプラー用プレートの設定
    1. [コントロールステップ] の下のツールバーのIfステップをクリックし、そのステップをメソッドにドラッグします([ヒントの選択])。条件として「オートサンプラー 」と入力します。
    2. [次へ] で、[コントロール ステップ] の下にあるツール バーの[ループ] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。変数としてcol =FirstColumn を開始として入力し、最後の列を終了として=1を増分として入力します。
    3. [ループ] の下で、[リキッドハンドリングステップ] の下にあるツールバーの [ヒントの選択] の[ロード ヒントの選択] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ドロップダウンメニューから[BC230ヒント]、[TL6の場所]、[TL2バックアップのヒントの場所]を選択します。[単一列] を選択し、「1」と入力します。
    4. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒント吸引を選択]ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Round ラボウェアタイプと試薬プレート位置を選択します。容積=MobilePhase、列6および行1の吸引を入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    5. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントの選択](Select Tips Dispense)ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。ラボウェアタイプとオートサンプラープレートの位置Bio_RadPCR96選択します。ボリューム=MobilePhaseを入力し、列= colおよび行1で分配します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    6. [液体処理ステップ] の下にあるツールバーの[ヒントのアンロードの選択] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。[TR1 へのヒントのアンロード] を選択します。
    7. Ifループの終了後、[コントロール ステップ] の下のツール バーの[プロシージャの実行] ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。手順のヒント数 を選択します。
    8. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントのロードヒントを選択]ステップをクリックし、メソッドにドラッグします。ドロップダウン メニューから[BC90 ヒント]、[TL5 の場所]、および [TL2 バックアップのヒントの場所] を選択します。[単一列] を選択し、=tipcolumnsを入力します。
    9. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒント吸引を選択]ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。BCDeep96Round ラボウェアタイプと反応プレート位置を選択します。容積=DigestTransfer、列=最初の列と行1の吸引を入力します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    10. [液体処理ステップ]の下のツールバーの[ヒントの選択](Select Tips Dispense)ステップをクリックし、ループ内のメソッドにドラッグします。ラボウェアタイプとオートサンプラープレートの位置Bio_RadPCR96選択します。ボリュームを入力=MobilePhase、列=最初の列と行1で分配します。テクニックのドロップダウンメニューから最適化されたテクニックを選択します。
    11. [液体処理ステップ] の下にあるツールバーの[ヒントのアンロードの選択] ステップをクリックし、[ Then] 内のメソッドにドラッグします。[TR1 へのヒントのアンロード] を選択します。選択ヒントのステップはここで終了します。
    12. メソッドを保存して名前を付けます。

2. 試料、ラボウェア、試薬の準備

1. 5 μL のプールされた健康な人間の血漿をポリプロピレン、96 ラウンドディープウェルプレートに移します。
   注: このプロトコルで使用される試薬および供給については、資料表を参照してください。TPCK処理トリプシンを購入し、トリプシン対基板比、インキュベーション時間を具体的に最適化した。配列グレードの組換えトリプシンなど、異なるグレードのトリプシンを使用する場合は、酵素対基質比およびインキュベーション時間をテストし、最適化する必要があります。

3. 操作手順

1. ソフトウェアアイコンをダブルクリックします。
2. [方法]タブで、[すべての軸のホーム]を選択して、自動液体ハンドラの方向を設定して準備します。すべてのワークステーションのスポイジに可視の気泡が含まれていないことを確認します。
3. [ファイル] で、[開く ] を選択します。メソッド。
4. 方法を選択します (図 6)。
5. 緑色の三角形の[実行] アイコンをクリックして、メソッドを開始します。
6. メソッドの最後にオートサンプラープレートを準備するには、「オートサンプラーに使用する値を入力してください」というプロンプトに値 「true」を入力し、次に「OK」をクリックします。オートサンプラープレートが準備されていない場合は、値「false」を入力し、「OK」をクリックします。
7. [最初の列に使用する値を入力してください] プロンプトに値 '1' を入力し、[OK]をクリックします。
8. [最後の列に使用する値を入力してください] プロンプトに値 '12' を入力し、[OK]をクリックします。
   注:このステップとステップ4.7は、96ウェルプレートの12列に消化を実行するようにワークステーションに指示し、その結果、プレートのすべてのウェルが消化に使用されます
9. サンプルプレートが 20 μL 以上のサンプルボリュームで使用されている場合は、「SamplePlate に使用する値を入力してください」というプロンプトに値 「true」を入力し、「OK」をクリックします。サンプル プレートが使用されていない場合は、値 「false」を入力し、[OK]をクリックします。
   注:サンプルプレートが使用されていない場合は、反応プレートの対応するウェルに5μLのサンプルを追加します。
10. ガイド付き Labware セットアップ ウィンドウの指示に従い、[続行] をクリックします。
    注: 次のウィンドウには、準備する「試薬プレート」のレイアウトが記述されています (図 7、補足表 1)。以下のボリュームは、1 mL深いラウンド96ウェルプレートの単一の列の8つの井戸のそれぞれにアリクォートされます:
    カラム1:反応ミックス1の540μL。
    カラム2:システインブロックの50 μL。
    カラム3:反応ミックス2の730μL。
    カラム4:トリプシンの130 μL。
    コラム5:クエンチ溶液の130 μL。
    コラム5:モバイルフェーズソリューションの1090 μL(ユーザーがステップ6で「true」と入力した場合)。
11. 「次へ」をクリックすると、サンプルプレートに入る必要がある最小体積(20 μL)が次のウィンドウに表示されます。サンプルプレート(ステップ9)に関するプロンプトに対して値「false」を入力した場合、反応プレートに5μLサンプルを追加するよう求められます。
12. [次へ] をクリックします。
    注:次のウィンドウでは、空の90 μLチップボックスを自動液体ハンドラデッキに配置する必要があります。
13. もう一度[Next]をクリックし、指定および図示にしたがって、自動液体ハンドラのデッキをレイアウトします(図8)(試薬プレート、サンプルプレート、オートサンプラープレート、6個のフル90 μLチップボックス、空の90 μLチップボックス、フル230μLチップボックスを含む)。
14. [完了] をクリックして、メソッドを開始します。
    注: [完了] をクリックすると、ユーザーは自動液体ハンドラにアクセスできなくなります。これは機械の「ライトカーテンを壊す」と安全上の注意として液体ハンドラを停止します。
15. 遠心分離後の続行プロンプトで、反応プレートを取り出し、3,000rpmで30分間遠心分離します。
16. 遠心が完了したら、反応プレートを、遠心分離前の位置に自動液体ハンドラに戻し、[続行] をクリックします。
    注: メソッドが完了すると、自動液体ハンドラが再度停止します。ユーザーがステップ6に「true」と入力した場合、オートサンプラープレートをワークステーションから取り外し、分析用に液体クロマトグラフィー装置のオートサンプラーに配置することができます。

4. LC-MSMS

1. 流量0.25mL/minのC18 2.1mm x 100mm、3.5 μmカラムからなる高流量HPLC上のペプチドを解決し、三重四極質量分析計でインライン分析します。
   注:ペプチド消化後、ロボットで調製されたサンプルからペプチドを定量する標的LC-MSMS法を、LC-MSMSの簡単な説明に従って詳細¹に説明する。
2. カラムオーブン温度を40°Cに設定します。バッファー A (2% ACN, 98% 水, 0.1% ギ酸) およびバッファー B (95% ACN, 5% 水, 0.1% ギ酸) を 2 つの移動相として使用します。
3. ロード後 5 分間、列を 5% B で平衡化します。バッファーBの5%から35%の勾配を線形で30分間にわたってペプチドを溶出する。
   1. 次のサンプルをロードする前に、98%Bを10分間洗浄し、5%Bで5分間リサイクルします。
   2. オンライン転用の場合は、2相切替弁を使用してイオン源に入る前に、ポストカラム溶離液を無駄にします。
4. MRM データを処理します。

結果

自動化されたワークステーション上の自動プロテオミクスサンプル調製ワークフローは、従来の自動化プロトコルから、選択された血漿タンパク質、および品質管理に使用される外因性タンパク質であるβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)の堅牢なLC-SRM-MS取得方法¹で調整されました。処理後、サンプルを血清アルブミン、βガラクトシダーゼを標的とするSRMアッセイで三重四重極LC-MSで実行した。各遷移のSRM信号の変動係数(CV)を用いて、自動消化プロトコルの再現性を監視しました。

試薬の添加と混合のステップを自動化し、5 μLプラズマサンプルの消化を2時間オンデッキインキュベーターのトリプシンインキュベーションで消化しました。再現性を決定するために、プラズマプールの5μLを、マルチチャンネルヘッド(96ピン)を有する反応板の複数のウェルに配管した。一貫性を監視するために、還元反応およびアルキル化反応の前にβ-galタンパク質を添加しました。自動化プロテオミクスサンプル調製ワークフローは、品質管理に使用されるアルブミン、最高量の血漿タンパク質、β-galタンパク質を含む堅牢なLC-SRM-MS取得方法で試験しました。3つのβ-galペプチドおよび2つのアルブミンペプチドを、処理された血漿アルブミンタンパク質およびスパイクβ-galタンパク質からモニターした(表4)。

時間を節約し、手順を簡素化するために、9段階のワークフローから6段階のワークフローにワークステーションとの試薬と反応混合物の添加/混合/インキュベーションの液体転送ステップを減らしました(図1)。全プロテオミクスワークフローは、自動サンプル調製とLC-MS/MSの2つの実験成分で構成され、まず、オートサンプラープレートの同じ消化ウェルから8回連続でLC-MS/MS SRMデータ取得の精度を評価しました。自動サンプル調製ワークフローの精度は、全プロテオミクスSRMワークフローの分散係数(%CV)からLC-MS/MSの%CVを差し引いた割合で計算した(図9B)。自動化されたワークステーションでの血漿消化手順の合理化により、自動サンプル調製の実験精度は、外因性スパイクβ-galタンパク質に対して11.4%未満(平均10.0%)、最も豊富なヒト血清アルブミン(平均9.9%)では14.9%未満であった(図9)。期待通り、ヒト血清アルブミンおよびβ-galタンパク質の両方について良好なシグナル強度が観察された(図9C)。

ピペット化および液体移送ステップごとに、技術を特に最適化した。液体移送ステップの精度を監視するために、反応ミックス1、システインブロッカー、反応ミックス2の3つの独立試薬転写工程において、内因性ヒト血清アルブミンタンパク質および外因性β-galタンパク質に対する安定同位体標識(SIL)ペプチド標準をスパイクした。これら5つのSILペプチドからのMRMシグナルを取得し、自動液体移動ステップの精度を監視しました。ペプチドの平均%CV、DDNPNLPR^、およびGDFQFNISR^(^はN15標識アミノ酸を表す)の反応ミックス1ステップは1.8%から11.2%の範囲であった。システインブロッカーステップからの1つのペプチド(IDPNAWVER^)の平均%CVは6.6〜8.8%の範囲であった。2つのペプチドの平均%CV(WVGYGQDSR^およびLVNEVTEFAK^)は6.2%から11.9%に及んだ(図10)。

自動プロテオミクスサンプル調製ワークフローを検証するために、ヒト血清アルブミン、外因性β-gal、および40個の追加の血漿タンパク質について、複数のタンパク質および複数日にわたる再現性を評価しました。我々は、3つの異なる日に21の複製サンプル(プールされた正常なヒトプラズマ)、よく位置を処理した。日中のCVは、同じ日に準備された21の井戸から計算されました。40個のタンパク質の平均日内%CVは4%から20%の範囲であった(図11B)。プレートベースの自動化ワークフローのエッジ効果を評価するために、%CVは、指定された列および行内の特定のウェルから計算された(図12列および行マップの場合はA)。MRM信号強度は、3%から22%の範囲の%CVを持つすべての列および行構成で類似していた(図12B)。

要約すると、最適化された自動化されたワークフローは、優れた実験精度で5時間以内に96個の均一に処理されたサンプルを生成します。自動化されたワークフローとの相溶性のために、我々は、ごくわずかの非特異的な副反応を有し、周囲光で安定であり、LC-MS/MSに優しく、凍結アリコートとして保存することができる試薬を選択した。

図 1: サンプル準備ワークフローのスキーマ。主な6液体の転送ステップがリストされています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:スクリプトの読み込みヒントVB スクリプトの詳細については、こちらに示します。スクリプトは、ヒントの読み込み条件を指定します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:自動ワークステーションデッキレイアウトデッキは1x1のALPs、先端の負荷のALP、ゴミ箱、先端の洗浄、ペルチェおよびインキュベーターから成っている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:試薬板の特性。ガイド付きラボウェア セットアップを使用してアクセスする場合に、試薬プレート ラボウェアに必要なプロパティを示します。対応する列を選択し、図に示すように変数を入力します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: チップカウントスクリプトこのスクリプトは、デッキ上のヒントの数を追跡するのに役立ちます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:プラズマサンプルの消化とアリクォートの方法の概要液体ハンドラの方法における試薬計算、ラボウェアのセットアップ、および液体操作のためのステップ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:試薬プレートのレイアウト。図示は、プラズマ消化およびオートサンプラー調製に必要な化学試薬であり、試薬プレートラボウェアに分布しています。この図は、テクニカルノート¹⁰から修正されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 8: 自動化されたワークステーションのデッキ上のラボウェアのレイアウト。液体ハンドラのプラズマ消化法のデッキレイアウトを示します。この図は、テクニカルノート¹⁰から修正されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図9: 全プロテオームワークフローの精度は、ワークステーションCVと対象LC MS/MS CVで構成されています。
β-galおよびアルブミンから5個のペプチドをモニタリングし、各ペプチドのクロマトグラムおよびペプチド保持時間が示されている(A)、精度は30ウェル/サンプル処理の代表的な実験から決定し、全プロテオームワークフローに対するCV%、LC MS/MS分析および自動処理サンプル処理を計算した(B)。全体として、消化されたペプチドは、1x10⁵から1x10 8までの良好なシグナルを示^した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図10:液体移送ステップの精度の決定合成ペプチドを工程特異的試薬でスパイクし、かつ自動液体移送を全%CVで求めた。30ウェル/サンプル実験からマイナス%CV LC MSMS(8繰り返しLC MSMS注射によって決定される)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図11:42タンパク質MRM解析による自動プロテオームサンプル調製ワークフローの再現性を示す複数日。(A)3日間のそれぞれについて反応板マップがここに示され、21のウェルのそれぞれに5μLプラズマを加えた。3ウェルは5ウル水を受け取り、負/ブランクコントロールとして使用した。(B)190の遷移の平均強度は、各MRM移行のための75ペプチドと42タンパク質(左)および%CVから構成され、各日(右)の21ウェル消化から計算された。Bこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図12:ウェルの特定の位置(列と行の位置)の再現性。(A) プレート マップを含む列と行の位置を次に示します。(B)単一プレート消化からの指定されたウェル(左)およびcv%(右)からの平均強度のカラムおよび行位置特異的なMRM信号。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 13: 技術エディタのスクリーン ショット各ピペットテンプレートについて、液体レベル検出、クロット検出、ピアス、液体タイプ、一般、吸気、ディスペンス、ミックス、キャリブレーションの特性を定義します。このプロトコルで使用されるテンプレートと技法を補足表 2に示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

変数	変数	値	説明
オートサンプラー	ブール	True	オートサンプラーを使用する
ベタガル	整数	5	ベタガルのボリューム
BG1	整数	0.8	BG1ボリューム
BG2	整数	0.8	BG2ボリューム
BG3	整数	0.8	BG3ボリューム
シスタインブロッカー	整数	1.25	システインブロッカーボリューム
システインバッファ	整数	0.45	システインバッファー容積
デナチュラント	整数	5	デナチュラント容積
ダイジェスト転送	整数	10	ダイジェスト転送量
最初のバッファ	整数	25.9	最初のバッファー・ボリューム
最初の列	整数	1	最初の列
HSA1	整数	0.8	HSA1 ボリューム
HSA2	整数	0.8	HSA2 ボリューム
最後の列	整数	12	最後の列
モバイルフェイズ	整数	90	移動相容積
クエンチ	整数	10	クエンチカラム
還元剤	整数	5	還元剤列
サンプル	整数	5	サンプル列
サンプルプレート	ブール	True	サンプルプレートを使用する
セカンドバッファ	整数	58.4	2 番目のバッファー・ボリューム
トリプシン	整数	10	トリプシン列

表 1: 開始ステップ変数

値	変数
=ファーストバッファ+デナチュラント+還元剤+ベタガル+BG1+HSA1	ファーストミックス
=システインブロッカー+システインバッファ+BG2	システインミックス
=セカンドバッファ+BG3+HSA2	セカンドミックス
=(ファーストミックス*カラム)+30	ファーストミックスウェル
= (システインミックス*コラム)+20	システインウェル
=(セカンドミックス*カラム)+10	セカンドミックスウェル
=(トリプシン*カラム)+10	トリプシンウェル
=(クエンチ*カラム)+10	クエンチウェル
=(ファーストミックスウェル*8)+100	ファーストミックスストック
=システインウェル*8+20	システインミックスストック
=(セカンドミックスウェル*8)+100	セカンドミックスストック

表 2: ボリュームミックス変数

型	名前	位置	深さ	プロパティ	使用。
BCディープ96ラウンド	試薬プレート	P5	1(上)	#	=サンプルプレートではない
BCディープ96ラウンド	試薬プレート	P5	1(上)	#	=サンプルプレート
BCディープ96ラウンド	反応プレート	P11	1(上)		True
Bio_RadPCR96*	サンプル	P9	1(上)		=サンプルプレート
Bio_RadPCR96*	オートサンプラープレート	P10	1(上)		=オートサンプラー
BC90	空		1(上)		True
BC90			1(上)		True
BC90			1(上)		True
BC230			1(上)		=オートサンプラー
BC90			1(上)		=列>1
BC90			1(上)		=列>3
BC90			1(上)		=列>5
BC90			1(上)		=列>7
BC90			1(上)		=列>9
メモ： *:96ウェルバイオラッドプレートに対応しています。 #: プロパティをクリックし、図6に示すようにボリューム変数を入力します。

表 3: ガイド付きセットアップの設定

プロテイン ID	ペプチド配列	Q1 ミサ (ダ)	Q3 ミサ (ダ)	時間 (分)	フラグメントイオン	クラスタ化の可能性を取り下げ	衝突エネルギー	衝突セル出口ポテンシャル
sp|P00722|BGAL_ELOCI	グフクフニサー	542.3	262.1	19.7	+2y2	61	21	8
		542.3	636	19.7	+2y5	61	25	12
		542.3	764.2	19.7	+2y6	61	25	18
	イドプナウォーバー	550.3	436.1	18.1	+2y7+2	61	23	8
		550.3	871.2	18.1	+2y7	61	25	18
		550.3	774.2	18.1	+2y6	61	33	8
	WVGYGQDSR	534.3	782.1	12.1	+2y7	51	25	6
		534.3	562.1	12.1	+2y5	51	27	6
		534.2	505.2	12.1	+2y4	90	25	8
sp|P02768|ALBU_HUMAN	DDNPNLPR	470.8	596.2	9.2	+2y5	61	27	16
		470.8	499.3	9.2	+2y4	61	27	18
		470.8	710.4	9.2	+2y6	61	27	18
	ルフネフテファク	575.3	694.4	18.2	+2y6	73.1	29.6	18
		575.3	937.5	18.2	+2y8	73.1	29.6	18
		575.3	823.4	18.2	+2y7	73.1	29.6	18

表 4: MRM パラメータ

補足表1:試薬プレートこちらをクリックして、この表をダウンロードしてください。

補足表 2: プロトコル テンプレートここをクリックして、この表をダウンロードしてください。

ディスカッション

質量分析のサンプル処理には、システインをブロックするタンパク質変性、還元、アルキル化、およびタンパク質をペプチドに切断するためのトリプシン消化が必要です。各化学反応または酵素反応は、指定された時間に開始し、制御された温度で行う必要があり、プロセス内のすべてのステップは、実験的な変動を導入することができる複数の液体移動ステップを伴う。自動サンプル処理は、このジレンマに対する解決策となります。現在利用可能な液体処理システムは、使用される頭部と先端の種類に応じて、正確かつ精度が5%未満の96ウェルプレートに試薬を移管し、必要に応じて14°Cから70°Cの範囲の制御温度下で、必要に応じてサンプルをインキュベートする能力を有する。自動液体ハンドラを使用して、SRMアッセイ用のプラズマを96ウェル形式で処理しました。

血清、血漿、およびその他の生物学的サンプル中のタンパク質の複雑な混合物内に何千ものプロテアーゼ切断部位があります。これらのタンパク質のそれぞれは、切断部位のアクセシビリティおよび得られるペプチドの安定性に影響を与えるユニークな特性を有する。したがって、すべてのタンパク質に最適なサンプル処理手順を設計することは不可能です。最善の方法は、できるだけ一貫性を保つ方法です。

一貫性を実現するために、自動液体ハンドラによって実行される各ピペットステップを最適化しました。まず、液体の種類(プラズマ、水性、有機)と対応する特性(粘性、凝集度、揮発性)、ハードウェア(ワークステーションピペットヘッドとプレートをつかむアーム)、ラボウェアによって課される量と制約を考慮しました。その後、吸引の速度と後続のエアギャップ、分配のための速度と吹き出し量、および混合の力と持続時間を変えながら、吸引および/または分配後のチップタッチを組み込み、必要に応じて、先端の外側に付着する液体を排除した(図13、補足表1)。安定性を事前にスクリーニングした独自のSILペプチドを各試薬にスパイクし、各液体処理ステップの精度を監視することを可能にしました。最適化後、移行の大部分のプロセス CV は 10% 未満であり、自動化されたワークステーション (図 9、図 10、図 11、図 12)で再現性の良い結果を示しています。

ここで示す自動化されたワークフローは、手動の方法と比較して再現性とスループットを向上させた一貫した酵素消化を提供します(図9、図10)。このアプローチは、質量分析によるバイオマーカー発見と検証の精度と信頼性を向上させることが約束されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プールされた健康なヒト血漿	バイオレクラメーション株式会社		原稿
Acetonitrile、HPLC Grade	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	LC MS/MS 溶媒
B-ガラクトシダーゼ E.Coli	Sigma-Aldrich	G3153-5MG	外因性コントロールタンパク質
Biomek i7 Automated Workstation	ベックマン・コールター		プロテオミクスサンプル調製ワークステーション:Biomek自動ワークステーションは、疾患やその他の状態の診断に使用することを意図または検証していません
Biomek i-Series Tips 230µL 非滅菌ベ	ックマン・コールター社	B85903	ヒント、i7
Biomek i-Series Tips 90µL 非滅菌ベ	ックマン・コールター社	B85881	ヒント、i7
FG、キットトリプシンTPCK	Sciex	4445250	消化に使用されるトリプシン
シェル96ウェルPCRプレート、薄型、薄壁、スカート、グリーン/クリア	バイオ・ラッド	#hsp9641	オートサンプラープレート
オクチル B-D-グルコピラノシド	Sigma-Aldrich	O9882-5G	消化に使用した界面活性剤
ポリプロピレン、96 ラウンドディープウェルプレート 滅菌済み	Beckman Coulter, Inc.	267007	試薬・消化プレート
Prominence UFLCXR HPLCシステム	島津製作		ハイフローLCシステム
QTRAP 6500	SCIEX		質量分析計
水・HPLCグレード	サーモフィッシャーサイエンティフィック	W54	LC MS/MS 溶媒
Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm	Waters	186003564	LC MSMSカラム